vchapter công nghệ sản xuất enzyme 3

Khái niệm về phương pháp cố định enzyme• Tiến trình sản xuất sản phẩm dùng enzyme làm xúc tác thường người ta dùng bể phản ứng khuấy trộn enzyme thể lỏng để tạo sản phẩm theo phương pháp

CHƯƠNG 3

PHƯƠNG PHÁP CỐ ĐỊNH ENZYME

Khái niệm về phương pháp cố định enzyme

• Tiến trình sản xuất sản phẩm dùng enzyme làm xúc tác

thường người ta dùng bể phản ứng khuấy trộn enzyme thể lỏng để tạo sản phẩm theo phương pháp từng lô Trong giai đoạn cuối của tiến trình này người ta trích chiết sản phẩm ra khỏi enzyme còn lại trong bể.

• Loại bỏ enzyme ra khỏi bể phản ứng bằng nhiệt để biến tính enzyme (thermal denaturation) hoặc bằng trầm hiện với

ammonium sulfate hoặc siêu lọc Đây là những phí tổn

• Ngoài ra mổi lần bắt đầu 1 lô sản phẩm mới là người ta phải dùng 1 lượng enzyme khác

• Trong hệ thống cố định enzyme, thì enzyme được cố định vào vật cố định ở thề rắn để nó có thể được xử dụng nhiều lần làm giảm phí tổn sản xuất.

• Phương pháp gắn liền enzyme vào vật cố định bắt đầu từ thập niên 1950 Lúc đó người ta nhốt enzyme trong mạng lưới

polymer (thạch) hoặc gắn nó vào vật chuyên chở (carrier

materials) Bây giờ thì có nhiều phương pháp cố định khác nhau.Lý do chính mà người ta cố định enzymes là:

➢Dể dàng tách rời enzyme ra khỏi sản phẩm

➢Tái xử dụng enzyme Làm giảm phí tổn sản xuất

• Tính chất của hế thống enzyme cố định tùy thuộc vào tính chất của enzyme và của vật cố định Phản ứng tương tác giửa 2 chất liệu này ảnh hưởng đến hoạt tính của hệ thống enzyme cố định.

Hiệu năng của hệ thống enzyme cố định

• Công lượng của hệ thống enzyme cố định có thể được thể hiện bằng số kg sản phẩm mà hệ thống tạo ra mổi mẽ Sô lượng này tùy vào số enzyme cố định trong hệ thống.

• Hiệu năng của hệ thống có thể được diển tả bằng số lượng

enzyme để sản xuất ra 1 kg sản phẩm của mẽ trong 1 thời gian nhất định ở 1 nhiệt độ nhắt định Td hệ thống có 1000U enzyme sản xuất 10kg sản phẩm mổi mẽ Hiệu năng của hệ thống là

1000U/10kg hay 100U/kg.

• Hiệu năng còn có thể được diển tả bằng phí tổn của hệ thống cho mổi kg sản phẩm của mổi mẽ sản xuất trong 1 thời gian nhất định và ở 1 nhiệt độ nhắt định Td Phí tổn tạo ra hệ thống trên là

1000$ Hiệu năng của hệ thống là 1000$/10kg hay 100$/kg

• Phí tổn sản xuất hệ thống tùy vào:

➢Số lượng enzyme dùng trong để cố định.

➢Hiệu suất của tiến trình cố định enzyme, nghĩa là:

❖Số lượng enzyme còn lại trong hệ thống / số lượng enzyme mất đi trong tiến trình cố định.

❖Số lượng enzyme có thể tác động với chất nền (enzyme có thể bị dính vào các pore nhỏ mà chất nền không vào được).

❖Hiệu suất này tùy thuộc vào phương pháp cố định

• Mặc khác nếu enzyme cố định có hoạt tính bền vững lâu dài thì những mất mát trên có thể được bù trừ lại.

• Để có thể ước lượng được phí tổn của enzyme cố định, chúng ta nên khảo sát các điểm sau:

1 Phí tổn của sinh khối cho vi sinh lên men để tạo ra enzyme.

2 Phí tổn trích chiết và tinh lọc enzyme, và số lượng enzyme thất thoát trong tiến trình cố định.

3 Phí tổn của tiến trình gắn enzyme vào vật cố định

• Phí tổn sản xuất sẽ được giảm thiểu nhờ vào hệ thống được tái xử dụng nhiều lần Ta có ước tính số lượng enzyme dùng để tạo ra 1kg sản phẩm trong suốt thời hạn xử dụng của hệ thống, hơn là số lượng dùng cho mổi lô.

Phí tổn và năng suất xử dụng hệ thống cố định enzyme

Thí dụ những hệ thống enzyme cố định

• Hệ thống giản dị nhứt là, trộn enzyme với dung dịch thạch ấm Để cho dung dịch nguội, đông lại thì enzyme sẽ bị nhốt trong mạng lưới polymer thạch.

• Cắt thạch ra từng khối nhỏ và cho vào bể phản ứng có chứa chất nền.

• Enzyme to trong mạng lưới xúc tác chất nền (nhỏ hơn) thành sản phẩm trong bể.

• Xả bể xuyên qua màn lưới ở dưới đáy của bể để lấy sản

phẩm Enzyme còn trong khối thạch sẽ được tái xử dụng cho lô chất nền kế tiếp.

• Td: Glucose + Enzyme Fructose + Enzyme

Bể phản ứng có khuấy

• Tiến trình cố định có thể làm một vài điểm tác động trên

enzyme bị che lấp đi, làm giảm số lượng chất nền mà enzyme có thể bám Tuy nhiên tiến trình cố định có thể tạo ra những biến đổi sinh hóa học làm cho enzyme bền vững hơn Sự bền vững này được thể hiện qua các đặc tính sau:

➢Thời hạn xử dụng hệ thống kéo dài Khi E bám vào vật cố định, làm cấu trúc E vững chắc hơn ít bị denature.

➢Enzyme bền vững trong những điều kiện sản xuất như pH và nhiệt độ cực đoan

• Các nhà sản xuất kỹ nghệ thích xử dụng hệ thống enzyme cố định vì việc thu hoạch sản phẩm dể dàng và cũng vì có thể tái xử dụng enzyme trong sản xuất.

• Trong hệ thống enzyme không cố định người ta trộn đều enzyme với chất nền, thì phản ứng xúc tác xảy ra hoàn toàn Trong hế

thống enzyme cố định, enzyme không tiếp xúc đều với chất nền nên hiệu quả sẽ thấp hơn so với hệ thống trộn đều.

• Tỉ số hiệu năng 0.1 nghĩa là thu hoạch do hệ thống cố định chỉ đạt được 10% thu hoạch so với không cố định dùng cùng số lượng

enzyme

• Dù cho tỉ số hiệu năng của hệ thống enzyme cố định thấp nhưng hệ thống này được tái xử dụng Miển sao

Tỉ số hiệu năng x số lần tái xử dụng ≥ 1Thì hệ thống đủ giá trị kinh tế.

• Hệ thống enzyme cố định có thể được dùng trong chế độ sản xuất liên tục Chất nền bơm liên tục vào bể phản ứng và sản phẩm chảy ra liên tục (Bể Phản Ưng Liên Tục)

• Trong hệ thống Bể Phản Ứng Liên Tục, enzyme nằm trong agar trong bể có lưới Sản phẩm chảy ra đều đặn khi người ta bơm chất nền vào

(a) Bể Phản Ứng liên tục khuấy (b) Bể Phản Ứng cố định

• Cả 2 bể đều có thể dùng được nhiều lần trước khi phải thay lô enzyme mới Td Trong sản xuất siro fructose, người ta cố định enzyme glucoisomerase và xử dụng liên tục trong vòng 2 – 4 tháng mới phải thay lô enzyme mới vào Lúc đó hoạt lực của enzyme giảm xuống còn 25% so với hoạt lực đạt được lúc enzyme mới cố định.

• Trong hệ thống trộn đều thì sau mổi lô người ta phải xả hết bể,

rửa hệ thống và chuẩn bị cho lô tiếp theo Sau đó cho enzyme mới vào Thời gian này gọi là thời gian chết, không sản xuất.

• Hệ thống trộn đều còn đưa đến sự không đồng đều (variation) giửa lô sản phẩm.

• Vì ta có thể xử dụng liên tục, hiệu năng sản xuất của hệ enzyme cố định cao nên người ta chỉ cần dùng hệ thống bể phản ứng nhỏ hơn khoảng 10 – 100 lần là cũng tạo đủ lượng sản phẩm như hệ thống không cố định Do đó phí tổn trang thiết bị thấp đi

Các yếu tố cần phải cứu xét trước khi cố định enzyme

• Sau khi cố định trên vật cố định thì sẽ thay đổi tính chất vật lý và hóa học của enzyme.

• Môi trường nhỏ xung quanh enzyme thay đổi do vật cố định gây ra có thể làm enzyme làm thay đổi tính bền vững và hoạt tính của nó (Td trong hệ thống dùng ion exchanger làm vật cố định thì điều kiện pH sẽ thay đổi khi ta cố định enzyme).• Bề mặt vật cố định để enzyme bám vào duy trì cấu trúc 3

chiều (tertiary structure) của enzyme qua các nối hóa học như (nối hydrogen, nối covalent) với vật cố định này Khi các nối này bị gảy nó sẽ làm thay đổi cấu trúc của enzyme đưa đến thay đổi khả năng của enzyme bám chất nền.

• Mục tiêu của việc cố định enzyme là làm sao để:

➢Enzyme phải bám vào vật cố định theo đúng chiều hướng để điểm hoạt động (active site) trên enzyme có thể tiếp xúc được với nhóm chức năng trên chất nền

➢Cơ cấu của enzyme phải được bảo tồn để vẫn còn hoạt động.

Phương pháp cố định enzyme dùng trong kỹ nghệ

• Có 3 phương pháp chánh

1 Phương pháp hấp thụ (Adsorption) vào vật cố định

• Enzyme hấp thụ vào mặt ngoài của vật cố định (support) Vật cố định của enzyme có thể là

➢Chất khoáng (td Aluminum oxide, đất sét)➢Chất hữu cơ (td Tinh bột)

➢Chất nhựa biến thái (td sepharose, ion exchange resin)• Enzyme và vật cố định không gắn vào nhau bằng nối vỉnh

viển (permanent) Chúng chỉ dính nhau bằng nối yếu như nối ion, nối hydrogen hay lực Van der Waal.

• Vật cố định phải nhỏ (500Å - 1nm) và không cho enzyme thấm thấu vào những lổ nhỏ (pores) trên vật này

Lợi điểm của phương pháp hấp thụ

• Enzyme chỉ bám trên bề mặt của vật cố định chứ không bám vào các khe Do đó enzyme có thể tiếp xúc chất nền.• Hệ thống cố định này dể dàng thiết lập.

• Ít làm hư hại đến enzyme

Nhược điểm của phương pháp hấp thụ

• Enzyme dễ bị tách ra khỏi vật cố định vì lực nối yếu

Vật cố định cho enzyme

• Nhựa trao đổi ion.

(a) DEAE-Sephadex; (b) CM-Sephadex• DEAE mang điện dương; CM mang điện âm

• Hệ thống sẽ gồm các thành phần dính liền nhau như sau: Enzyme – DEAE (hoặc CM) trên hạt nhựa (Vật cố định)

• Chất nền sẽ bám vào Enzyme

Enzyme kết nối với chất trao đổi ion nhờ vào điện tích của 2 phía: Enzyme (là protein) và chất trao đổi ion (DEAE hoặc CM).

➢Điện tích của protein

Điện tích của protein ở pH của môi trường

➢Điện tích của chất trao đổi ion

• Ở pH 9 và thấp hơn thì DEAE trên hạt nhựa sẽ trở nên có điện Ở pH > 9 nó lần lần mất điện tính Ở pH < 9 nó mang điện tính (+) Enzyme là protein, thường có pI ~5 Trong môi trường pH > 5, E mang điện (-) Ở pH < 5 nó mang điện (+)

• Khi pH được giử trên ở pH 5 – 9 thì enzyme sẽ (-) và vật cố định sẽ (+) Enzyme sẽ bám vào DEAE do điện lực.

• Khi người ta giảm pH xuống thấp (dưới pI) thì enzyme sẽ trở thành (+) và vật cố định có điện tính (+) nên enzyme bị đẩy ra khỏi chổ bám Đây là phương pháp thay đổi enzyme khi hoạt lực của enzyme xuống quá thấp Sau đó người ta tăng pH lên pH 6 – 8 thì enzyme mới sẽ (-) và nó sẽ bám vào vật cố định.

2 Phương pháp liên kết hóa trị (covalent bonding)

• Người ta nối enzyme với vật cố định bằng nối liên kết hóa trị Do đó liên kết này rất chặt Đây là phương pháp được dùng nhiều nhứt.

• Nhóm hydroxyl và nhóm amin của enzyme và của vật cố

định tạo nối cộng hóa trị dễ dàng Ta dùng Sepharose Nó là galactose Ta tác dụng nhóm hydroxyl trên galactose với

cyanogen bromide tạo thành cyclic imido-carbonate để liên kết cộng hóa trị với lysine trên enzyme

• Lợi điểm của liên kết cộng hóa trị

➢Nối giửa enzyme và vật cố định rất chặt.

➢Không có vấn đề enzyme bị rò rĩ hay bị tách ra mất đi.

• Nhược điểm của phương pháp liên kết cộng hóa trị:

➢Trong tiến trình nối enzyme với vật cố định, cơ chế hóa học của enzyme bị thay đổi làm nó mất đi hình thể chức năng (hoạt tính)

➢Vì đây là phương pháp không hoán chuyển (irreversible), nên người ta không tái xử dụng vật cố định được Cả

enzyme và vật cố định đều bị bỏ đi khi thay enzyme.

3 Phương pháp bẫy (Entrapment)

• Theo phương pháp này, enzyme bị kẹt bên trong mạng lưới (porous matrix) của vật cố định

• Enzyme dính trong mạng lưới có thể bằng nối liên kết hóa trị hay không phải liên kết hóa trị

• Người ta có thể điều chỉnh kích thước của lổ của mạng lưới của vật cố định bằng cách thay đổi nồng độ của vật cố định.• Nguyên liệu để tạo mạng lưới thường là:

➢Polyacrylamide gel➢Agar

➢Gelatin

• Lợi điểm của phương pháp bẫy enzyme:➢Tạo lập nhanh chóng, rẽ tiền

➢Ít làm thay đổi hình dạng của enzyme, do đó giử được hoạt tính của enzyme

• Bất lợi của phương pháp bẫy là:➢Enzyme bị rĩ ra

➢Có thể bị nhiểm vi trùng

➢Không thành công trong kỹ nghệ

Cơ chế gel đông Khi nóng gelở dạng Monomer Khi làm

lạnh thì tạo thành polymer

Agar structure

Sản xuất thuốc kháng sinh dùng enzyme cố định

• Xưa nay người ta dùng Penicillins lấy từ nấm penicillium do

tiến trình lên men Tuy nhiên các vi trùng gây bệnh bây giờ trở nên kháng lại nguồn penicillin thiên nhiên này.

• Ngày nay người ta dùng chất dẩn xuất (derivatives) bán nhân tạo của penicillin Người ta tạo các chất dẩn xuất này bằng cách loại bỏ nhánh bên của phân tử penicillin G và V trở thành 6-aminopenicillanic acid (6-APA)

• Penicillium chrysogenum tạo ra penicillin G Khi ta cho chất

phenoxyethanol vào bể nuôi cấy, thì nấm sẽ tạo ra penicillin V Khi ta loại nhánh bên hông ra thì ta được sản phẩm 6-APA • Sau đó người ta gắn một nhánh bên khác vào 6-APA để tạo ra

sản phẩm penicillin bán nhân tạo như ampicillin, amoxicillin.• Penicillin G acyclases (còn gọi là amidase) là enzyme nội

bào có trong E coli và trong 1 số vi trùng khác Người ta cố định enzyme này vào vật cố định bằng nối liên kết

Sản xuất amino acid bằng phương pháp enzyme cố định

• Trong kỹ nghệ, người ta sản xuất L-amino acids bằng cách lên men và tổng hợp hóa học Tuy nhiên hợp chất có cả 2 dạng L- và D- (N-acyl-DL-amino acids) và bất hoạt.

• Người ta có thể dùng enzyme aminoacyclase của một loại

mốc để biến dạng DL- trên thành dạng L-amino acid (có hoạt tính) và 1 số N-acyl-DL-amino acids chưa phản ứng Cho số chưa phản ứng này trở về tác động lại với enzyme tiếp tục.

• Người ta thu hoạch L-amino acid bằng cách kết tinh Còn Acetyl-DL-amino acid không phản ứng vẫn còn hòa tan

N-Người ta bơm N- Acetyl-DL-amino acid chưa phản ứng này về trộn chung với lô N-acetyl-DL-amino acid mới và tiếp tục cho qua cột enzyme này.

• Cột aminoacyclase chạy trong 30 ngày vẫn còn hoạt tính

tương đương với khoảng 70% hoạt tính ban đầu Đến ngày 65 thì hoạt tính còn 50%.