báo cáo thực tập hóa sinh

Trang 1 TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘIBÁO CÁO THỰC TẬP HÓA SINHSinh viên thực hiện: Trang 2 MỤC LỤCBÀI 5: HOẠT ĐỘNG CỦA CÁC DỊCH TIÊU HÓA – CHIẾT XUẤT, THỦY PHÂN LECITHIN...3Thí nghiệm 5.1:

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

BÁO CÁO THỰC TẬP HÓA SINH

Sinh viên thực hiện:

HÀ NỘI – 2023

MỤC LỤC

BÀI 5: HOẠT ĐỘNG CỦA CÁC DỊCH TIÊU HÓA – CHIẾT XUẤT, THỦY

PHÂN LECITHIN 3

Thí nghiệm 5.1: Hoạt động của lipase dịch tụy 3

Thí nghiệm 5.2: Định lượng acid clohydric dịch vị 4

Thí nghiệm 5.3: Xác định hoạt độ pepsin dịch vị 5

Thí nghiệm 5.4: Chiết xuất, thủy phân và xác định thành phần lecithin 6

BÀI 6: XÁC ĐỊNH MỘT SỐ SẢN PHẨM CHUYỂN HÓA TRONG MÁU 7

Thí nghiệm 6.1 Định lượng protein huyết thanh bằng phương pháp đo nitrogen-KJENDAHL 7

Thí nghiệm 6.2 Định lượng protein toàn phần trong huyết thanh 8

Thí nghiệm 6.3 Định lượng ure máu bằng phương pháp Bousquet 9

Thí nghiệm 6.4 Định lượng bilirubin toàn phần trong huyết thanh (phương pháp JENDRASIK) 10

Thí nghiệm 6.5 Định lượng acid uric trong huyết thanh 12

BÀI 7 XÁC ĐỊNH MỘT SỐ THÀNH PHẦN CHUYỂN HÓA TRONG NƯỚC TIỂU 13

Thí nghiệm 7.1 Định lượng amylase trong nước tiểu 13

Thí nghiệm 7.2 Tìm protein trong nước tiểu 14

Thí nghiệm 7.3 Tìm chất cetonic trong nước tiểu (phản ứng Lestradet) 15

Thí nghiệm 7.4 Tìm sắc tố mật trong nước tiểu (phản ứng Harison) 16

Thí nghiệm 7.5 Đo 10 thông số nước tiểu (phương pháp bán định lượng bằng thanh thử) 17

2

BÀI 5: HOẠT ĐỘNG CỦA CÁC DỊCH TIÊU HÓA – CHIẾT

XUẤT, THỦY PHÂN LECITHIN

Thí nghiệm 5.1: Hoạt động của lipase dịch tụy

1 Nguyên tắc

Trong điều kiện tối thích (môi trường kiềm, lipid được nhũ tương hóa) lipase xúc tác sự thuỷ phân triacyl glycerol trong sữa tạo glycerol và acid béo Sự có mặt của acid béo giải phóng làm thay đổi pH của môi trường, có thể nhận biết được nhờ chỉ thị phenolphtalein

2 Tiến hành

- Cho lần lượt vào 2 ống nghiệm:

Phenolphtalein 1% (giọt) 1 1

- Đặt vào nhiệt độ 37 C trong 30 phút Quan sát sự thay đổi màu.o

3 Kết quả

4 Giải thích

- Trong sữa có lipid đã được nhũ tương hóa nên khi cho phenolphthalein vào thì

cả hai ống đều không đổi màu Đến khi nhỏ từ từ Na2CO3 vào hai ống thì màu chuyển hồng (vì Na2CO3 có môi trường kiềm)

- Tiếp theo khi cho nước cất vào ống 2 và dịch tụy vào ống 1, thì ống 2 vẫn không đối màu, còn ống 1: vì trong dịch tụy có enzyme thủy phân lipid thành

3

glycerol và acid béo (môi trường acid) làm thay đổi pH của môi trường từ môi trường kiềm sang môi trường trung tính nên sẽ làm mất màu hồng

Thí nghiệm 5.2: Định lượng acid clohydric dịch vị

1 Nguyên tắc

Định lượng HCI bằng NaOH chuẩn độ với sự có mặt của 2 chỉ thị mầu khác nhau:

- p-dimethylaminoazobenzen (thuốc thử Toffer) chuyển màu ở pH 2,3 – 4,2 từ màu đỏ sang màu da cam dùng để xác định nồng độ HCI tự do

- phenolphtalein chuyển màu ở pH 8,2 – 10,0 từ không màu sang màu hồng dùng để xác định độ acid toàn phần

2 Tiến hành

- Cho vào bình nón 5 mL dịch vị mẫu 1 hoặc 2 Thêm 2 giọt thuốc thử Toffer và

2 giọt dung dịch phenolphtalein

- Chuẩn độ các mẫu dịch vị bằng NaOH 0,1N:

+ Bước 1: → màu đỏ cam: n1 mL

+ Bước 2: → màu vàng chanh: n mL (khó quan sát)2

+ Bước 3: → màu hồng: n mL 3

* Cách tính kết quả

- Theo quy ước, độ acid dịch vị là thể tích NaOH 0,1M (A mL) sử dụng để chuẩn độ 100 ml dịch vị

- Nồng độ HCl tự do được tính dựa vào lượng NaOH thu được trong bước chuẩn

độ 1

- Muốn xác định nồng độ HCI kết hợp phải biết nồng độ HCI toàn phần dựa vào trung bình cộng của lượng NaOH thu được trong bước chuẩn độ 2 và 3

- Trên thực tế, dựa vào lượng NaOH chuẩn độ đến bước 3 để xác định độ acid toàn phần do bước 2 khó quan sát

- Chú ý: Trong các trường hợp thiếu toan hay vô toan, phải sử dụng phương pháp chuẩn độ kiềm dư để xác định sự thiếu hụt acid đối với khả năng trung hoà bicarbonat và mucin của dịch vị, được tiến hành như sau:

+ Chuẩn độ HCI toàn phần của dịch vị bằng cách nhỏ NaOH 0,1N xuống dịch vị cho tới khi chuyển mẫu phenolphtalein Ghi số NaOH cần dùng

+ Thêm HCI 0,1N hayH SO2 4 0,1N cho tới khi chuyền màu thuốc thử Toffer Sau

đó dùng NaOH chuẩn độ lượng acid đưa vào Từ đó suy ra mức độ thiếu hụt acid (kiềm dư)

3 Kết quả

n1 (mL) HCl tự do n (mL)3 HCl toàn

phần

4 Biện luận kết quả

- Bình thường độ acid nằm trong khoảng 40 – 60 đơn vị, trong đó nồng độ HCI

tự do là 20-40 đơn vị và nồng độ HCI kết hợp là 5 -20 đơn vị

4

→ Mẫu 1 bình thường Mẫu 2 có hiện tượng tăng acid dịch vị.

- Trong trường hợp bệnh lý, độ HCI có thể bằng 0 hoặc tăng, hoặc giảm + Hiện tượng vô toan và không có pepsin (achilia) thường gặp trong ung thư dạ dày

+ Hiện tượng thiểu toan gặp trong viêm dạ dày do giảm tiết acid

+ Hiện tượng tăng acid gặp trong viêm dạ dày do tăng tiết acid và thường đi kèm với loét dạ dày tá tràng

- Nếu kết hợp với xét nghiệm acid lactic dương tính chứng tỏ có hiện tượng viêm hay ung thư dạ dày do giảm tiết acid Vì vậy đây là các xét nghiệm quan trọng để chẩn đoán các bệnh viêm loét dạ dày tá tràng

Thí nghiệm 5.3: Xác định hoạt độ pepsin dịch vị

1 Nguyên tắc

- Biểu thị hoạt độ của pepsin bằng lượng protein được thuỷ phân bởi ergym trong những điều kiện xác định về nhiệt độ và thời gian

- Nhờ có HCI, pepsinogen được hoạt hóa thành pepsin hoạt động có tác dụng thuỷ phân các liên kết peptid có nhóm NH- của acid amin thơm

2 Tiến hành

- Cho vào 3 ống nghiệm

Thuốc thử (mL) Ống 1 Ống 2 Ống 3

- Đặt vào tủ ẩm 37° C trong 1h

- Cho vào mỗi ống 3 mL CCl COOH 10% Lắc kỹ, ly tâm lấy tủa3

- Cho vào mỗi ống:

Thuốc thử Gornall: 2mL

Nước cất: 3mL

- Để ở nhiệt độ thường (22°-26°C) trong 30 phút

- Soi quang kế ở λ = 530 nm, cuvette 1 cm

- Ghi mật độ quang của từng ống (E , E , E )1 2 3

3 Kết quả

E1 = 0,228, E = 0,001, E = 0,1262 3

→ Lượng protein bị thủy phân

Hoạt độ pepsin ứng với 100mL dịch vị

4 Biện luận kết quả

Bình thường: Hoạt độ pepsin lúc đói là khoảng 242 mg%

→ mẫu thử có thể là mẫu dịch vị lúc đói

Thí nghiệm 5.4: Chiết xuất, thủy phân và xác định thành phần lecithin.

5

1 Nguyên tắc

- Lecithin được chiết xuất từ lòng đỏ trứng dựa vào tính chất tan trong alcol nóng nhưng không tan trong aceton của nó Trong môi trường acid nóng, lecithin bị thuỷ phân giải phóng glycerol, acid béo, H3PO4 và cholin

- Xác định acid béo: Sau khi để nguội, xuất hiện trên bề mặt dịch thủy phân những giọt dầu, đó là các acid béo

- Xác định glycerol: Khi đun nóng với chất khử nước (KHSO ), glycerol mất 2 4

phân tử H O biến thành acrolein được nhận biết bằng:₂

+ Mùi mỡ cháy

+ Phản ứng khử Ag O → Ag kim loại (do nhóm chức aldehyd).2

- Xác định H3PO4 bằng thuốc thử amoni molybdat và HNO tạo amoni 3

phosphomolybdat màu vàng chanh

- Xác định cholin bằng phản ứng tạo tinh thể periodure cholin có dạng mảnh hình kim màu nâu trên kính hiển vi quang học (với dung dịch lod bão hoà trong KI)

2 Tiến hành: Xác định H3PO4

- Trong 1 ống nghiệm cho:

Dịch thuỷ phân: 10 giọt

Thuốc thử molybdat: 3 giọt

- Đun sôi trực tiếp hoặc cách thuỷ, dung dịch dần dần có màu vàng chanh và có tủa amoni phosphomolybdat

3 Kết quả

4 Kết luận: Lòng đỏ trứng có H3PO4 (trong lecithin có thể có H3PO4)

6

BÀI 6: XÁC ĐỊNH MỘT SỐ SẢN PHẨM CHUYỂN HÓA

TRONG MÁU

Thí nghiệm 6.1 Định lượng protein huyết thanh bằng phương pháp đo nitrogen-KJENDAHL

1 Nguyên tắc

 Dùng H2SO4 đặc để vô cơ hóa các nguyên liệu động vật hay thực vật (huyết thanh, dịch nghiền tổ chức…) Các chất hữu cơ bị đốt cháy tạo

CO2, nước và amoniac dưới dạng (NH4)2SO4 Cho NaOH phản ứng với sulfat amon để giải phóng NH được cất kéo chuyển tới bình nón đựng 3

H SO2 4 chuẩn độ Chuẩn độ H2SO4 thừa bằng NaOH chuẩn độ

 Làm song song với mẫu trắng

 Hiệu số giữa kết quả chuẩn độ của mẫu thử và mẫu trắng chính là lượng acid thực tế đã phản ứng với NH giải phóng→xác định hàm lượng 3

nitơ→lượng protein có trong nguyên liệu

2 Tiến hành

a Vô cơ hóa

 Cho vào bình phản ứng

Huyết thanh pha loãng 1/10 1,0ml

Hỗn hợp xúc tác 0,5g

H2SO4 đặc 1,0ml

 Đun từ từ hỗn hợp trên ngọn lửa trong hốt Khi hỗn hợp chuyển sang dịch lỏng có thể đun mạnh Đặt một phễu nhỏ trên miệng bình để cản hơi acid Sau khoảng 15 phút dung dịch sẫm màu rồi trong dần Khi dung dịch hoàn toàn trong xanh là quá trình vô cơ hóa đã hoàn thành

b Chuẩn bị máy định lượng Kjeldahl

Máy định lượng gồm 2 phần:

- Bình phản ứng (1) đựng dung dịch cần định lượng đã vô cớ hóa, Bình này được nối với một phễu (2)

có khóa Mohr (3)

- Ống sinh hàn (4) có đầu trên nối với bình (1) và đầu dưới nhúng vào dung dịch H2SO4 chuẩn độ chứa trong bình nón (5)

7

c Cất hơi amoniac

 Bình phản ứng sau khi đã vô cơ hóa để nguội→thêm 80ml nước cất 2 lần (bình to) hoặc 5ml nước cất 2 lần (bình nhỏ) + 2 giọt phenolphtalein 1% + vài viên đá bọt→lắp bình vào máy và đảm bảo máy hoàn toàn kín

 Cho bình (5) 10,0ml H2SO4 N/50 + 1 giọt chỉ thị màu Tashiro Lắp đầu dưới ống sinh hàn nhúng vào dung dịch H2SO 4

 Đổ vào phễu (2) 5ml NaOH 40% rồi mở từ từ khóa (3), giữ lại 1 ít NaOH trên phễu rồi đóng khóa (3)

 Đun bình phản ứng có màu hồng bằng đèn cồn, amoniac giải phóng được cất kéo hơi nước vào bình nón Cất khoảng 15 đến 20 phút, hạ bình nón

và cất thêm 3 phút Tráng phần cuối ống sinh hàn bằng nước cất 2 lần cho chảy vào bình nón

 Tiến hành cất như trên với mẫu trắng (thay huyết thanh bằng nước cất)

d Định lượng amoniac

 Chuẩn độ N/50 thừa bằng NaOH N/50

 Chỉ thị chuyển từ tím sang xanh

 Ghi số ml NaOH N/50 dùng cho mẫu thử (n ) và mẫu trắng (n )1 2

 Hiệu số giữa lượng acid ứng với mẫu trắng và mẫu thử chính là lượng acid thực tế đã phản ứng với NH giải phóng từ mẫu.3

3 Tính kết quả

1ml N/50 ứng với 0,28mg N

N g%= (0,00028 x n x 100)/0,1=0,28 x n⇒

n: hiệu số giữa lượng acid ứng với mẫu trắng và mẫu thử

N: hàm lượng nitơ trong dung dịch mẫu amoni oxalat 1 ml chứa 1 mg

N

4 Nhận xét

 Ưu điểm:

+ Độ chính xác rất cao

+ Khả năng tái sản xuất rất tốt

+ Có thể đo được mọi mẫu

 Nhược điểm

+ Khó để thước đo chính xác nito vì tất cả nitơ không ở dạng protein + Với các loại protein khác nhau thì cần các yếu tố hiệu chỉnh khác nhau do trình tự axit amin khác nhau

+ Việc sử dụng axit sunfuric đậm đặc ở nhiệt độ cao sẽ ít nhiều gây ra một mối nguy hại đáng kể và chất xúc tác cũng vậy

Thí nghiệm 6.2 Định lượng protein toàn phần trong huyết thanh

1 Nguyên tắc của phương pháp Gornall

 Dựa trên nguyên tắc phản ứng biuret Các liên kết peptid của protein khi phản ứng với trong môi trường kiềm sẽ cho phức màu tím, độ đậm màu tỷ

lệ thuận với nồng độ protein trong mẫu thử

8

 Tiến hành định lượng song song với ống mẫu có hàm lượng protein đã xác định

2 Tiến hành

Trắng Thử Mẫu Huyết thanh pha loãng ½ (ml) 0,1

Dung dịch protein mẫu 35g/l (ml) 0,1 Thuốc thử Gornall (ml) 4 4 4

Lắc đều, để 30 phút ở nhiệt độ phòng

Soi quang kế ở bước sóng λ=540nm so sánh với ống trắng

3 Tính kết quả

protein máu g/l = Ethử /E x 35 x 2 = 89mẫu

4 Phân tích, đánh giá kết quả

 Bình thường nồng độ protein trong huyết thanh là 65-85 g/l

 Kết quả: 89 g/l có bệnh lý⇒

 Thay đổi trong:

 Tăng: mất nước do bỏng, nôn, tả, ỉa chảy liên tục, thiểu năng thượng thận, u tủy, viêm khớp, viêm đa khớp…

 Giảm: đói hay tắc ruột, suy gan, thận hư nhiễm mỡ, phù, rối loạn chức năng tổng hợp protein ở gan do ảnh hưởng chất độc hóa học,

do bệnh lý khối u ác tính hay nhiễm khuẩn kéo dài, cơ thể mất protein do chảy máu, tăng tính thấm thành mạch, suy thận, có thai…

Thí nghiệm 6.3 Định lượng ure máu bằng phương pháp Bousquet

1 Nguyên tắc

 Ure khi phản ứng với diacetylmonoxim (DAM) với sự có mặt của chất oxy hóa (FeCl ) và ở môi trường acid nóng sẽ cho sản phẩm ngưng tụ 3

màu hồng Màu của phản ứng sẽ được tăng cường nếu cho thêm thiosemicarbasid (TSC)

2 Tiến hành

a Khử tạp máu

Cho vào 1 ống nghiệm (ống thử):

Huyết thanh 0,5ml

Acid trichloracetic 4,5ml

Khuấy kỹ, ly tâm lọc lấy nước trong

Cho vào ống mẫu:

Dung dịch urea mẫu 0,5ml

9

Dung dịch trichloracetic 4,5ml

Lắc đều

b Phản ứng màu

Chuẩn bị 3 ống nghiệm:

Trắng Thử Mẫu Acid trichloracetic (ml) 0,2

Dung dịch trong ống thử 0,2

Dung dịch DAM-TSC (ml) 3 3 3 Dung dịch Clorua feric (ml) 3 3 3

Lắc đều các ống, đun sôi cách thủy 10 phút, lấy ra làm nguội

Đo quang ở λ=520nm, đối chiếu với ống trắng

3 Tính kết quả

Ure máu (mmol/l) = E /E x 5 = 12thử mẫu

4 Phân tích kết quả

 Bình thường nồng độ ure trong máu 1,7-8,3 mmol/l

 Kết quả: 12 mmol/l có bệnh lý⇒

 Thay đổi bệnh lý:

 Tăng: suy thận cấp hoặc mạn, trình trạng sốt cao, bỏng, ngộ độc…

 Giảm: suy gan giai đoạn cuối

Thí nghiệm 6.4 Định lượng bilirubin toàn phần trong huyết thanh (phương pháp JENDRASIK)

1 Nguyên tắc

 Dùng dung dịch cafein benzoat để hòa tan bilirubin tự do Bilirubin phản ứng với thuốc thử diazo (acid diazophenylsunfonic) tạo azobilirubin màu hồng có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 530nm Cường độ màu tỉ lệ thuận với nồng độ bilirubin

2 Tiến hành

Cho vào 3 ống nghiệm

Thuốc thử (ml) Chứng Mẫu Thử Trắng Dung dịch bilirubin mẫu 1

10

Dung dịch cafein benzoat 3,5 3,5 3,5 3,5 Dung dịch diazo 1 0,5

Lắc đều để yên 20 phút

So màu ở λ=530nm so với ống chứng Cuvet 0,5cm

Chú ý:

 Đối với huyết thanh vàng nhiều, cần pha loãng bằng NaCl 0,9%

 Trường hợp định lượng bilirubin liên hợp, chỉ được để 5-10 phút trước khi soi quang kế vì nếu để lâu bilirubin tự do sẽ phản ứng và cho màu Nồng

độ bilirubin tự do là hiệu số kết quả của bilirubin toàn phần và bilirubin liên hợp

3 Tính kết quả

Nồng độ bilirubin = (E - thử Echứng ) /Emẫu x 5mg% x 17,1= 49 (µmol/l)

4 Phân tích kết quả

 Bình thường, bilirubin toàn phần trong máu là 8-20 µmol/l trong đó: bilirubin tự do chiếm 75% (6-15 µmol/l)

bilirubin liên hợp chiếm 25% (2-5 µmol/l)

 Trong lâm sàng, xét nghiệm bilirubin máu dùng để chẩn đoán phân biệt các bệnh vàng da

 Nếu bilirubin trong máu > 27 µmol/l là biểu hiện có vàng da

 Kết quả: 49 µmol/l có vàng da.⇒

 Trong vàng da do dung huyết và vàng da sinh lý ở trẻ sơ sinh, bilirubin tự

do tăng trong máu

Trẻ sơ sinh có hiện tượng vàng da do trẻ có số lượng hồng cầu trong máu lớn, hồng cầu chứa HbF nên đời sống hồng cầu ngắn →hồng cầu vỡ ra→ giải phóng các yếu tố bên trong hồng cầu → chuyển hóa tăng bilirubin tự do Mà chức năng gan của trẻ còn kém, đồng thời khả năng bài tiết mật của gan cũng chưa trưởng thành → không chuyển hết bilirubin tự do thành bilirubin kết hợp nên bilirubin

tự do ứ lại trong máu

 Trong vàng da do tắc mật, bilirubin liên hợp tăng là chủ yếu

Cơ chế: do tắc mật → mật không xuống ruột được→ trở lại máu → ngấm vào

da và niêm mạc → gây vàng da

 Trong vàng da do viêm gan là do tổn thương tế bào gan dẫn đến tăng nồng

độ bilirubin cả tự do và liên hợp

Cơ chế: khi tế bào gan bị tổn thương → các mao quản mật chứa bilirubin liên hợp bị vỡ ra → trào ngược vào máu + qua trình tổn thương viêm phù nề chèn ép các mao quản và tiểu quản mật trong gan → ứ bilirubin liên hợp Đường mật

11

trong gan bị chèn ép → giảm khả năng thu nhận bilirubin tự do của tế bào gan lành → ứ bilirubin tự do

Thí nghiệm 6.5 Định lượng acid uric trong huyết thanh

1 Nguyên tắc

 Acid uric một sản phẩm thoái hóa của base purin (adenin và guanin), được định lượng dựa theo phản ứng sau:

Uricase

Acid uric + H O + O ————> Alantoin + CO + H2 2 2 2O2

Peroxidase

2 H2O2 + ADPS + 4-aminoantipyrin ————> Quinoneimin + 4 H O2

ADPS: N-ethyl N-(3-sulfopropyl)-3-methoxyanilin.

Nồng độ acid uric trong huyết thanh tỷ lệ thuận với mật độ quang đo được ở bước sóng 546 nm của quinoneimin tạo thành

2 Tiến hành

 Đưa thuốc thử về nhiệt độ phòng Sau đó, pha hóa chất theo bảng sau:

Trắng Chuẩn Thử

 Trộn kỹ và ủ khoảng 5 phút ở 37 C Sau đó bắt đầu quá trình đo ở bước o

sóng 546 nm Kết quả hiển thị trên máy đo bán tự động

Chú ý: nếu nồng độ acid uric quá cao (>20 mg/dL) thì cần phải pha loãng huyết thanh trước khi tiến hành pha hóa chất (ống thử)

3 Phân tích kết quả

 Bình thường acid uric trong máu: ở nam là 202 – 416 µmol/l

ở nữ là 143 – 399 µmol/l

 Kết quả: 139 µmol/l có bệnh lý⇒

 Acid uric máu tăng trong bệnh gout, suy thận, nhiễm độc chì và thủy ngân

 Acid uric máu giảm trong bệnh Willson, cơn liệt chu kỳ và xanthin niệu

12