báo cáo thực hành lý sinh 2

Để một phản ứng hóa học xảy ra thì cácnguyên tử, phân tử của chất tham gia phảithay đổi, sắp xếp lại cấu trúc của nó và hìnhthành nên một trật tự cấu trúc mới trong sảnphẩm của phản ứng.

Lý thuyết

Động học nghiên cứu tốc độ của phản ứng (hay quá trình) và sự phụ thuộc của nó vào các yếu tố như nhiệt độ, nồng độ và sự có mặt của chất xúc tác hoặc ức chế Để một phản ứng hóa học xảy ra thì các nguyên tử, phân tử của chất tham gia phải thay đổi, sắp xếp lại cấu trúc của nó và hình thành nên một trật tự cấu trúc mới trong sản phẩm của phản ứng Muốn vậy, nguyên tử hoặc phân tử phải có một năng lượng tối thiểu để vượt qua hàng rào lực đẩy giữa các lớp vỏ điện tử để liên kết với nhau, do đó năng lượng hoạt hóa là năng lượng tối thiểu cần thiết để nguyên tử, phân tử có thể tham gia vào phản ứng Kí hiệu là Ehh

Theo Maxwell – Boltzmann, sự phân bố phân tử theo năng lượng có dạng như trên hình 1 Những phân tử nào có năng lượng bằng hoặc lớn hơn E (làhh những phân tử có năng lượng nằm bên phải đường thẳng Z ) là có khả năng thame gia vào phản ứng tạo thành sản phẩm

Khi nhiệt độ thay đổi, làm thay đổi động năng do chuyển động nhiệt của các phân tử Do đó tổng năng lượng của các phân tử cũng thay đổi Chẳng hạn khi nhiệt độ tăng lên (T > T ) thì năng lượng của các phân tử tăng lên, phân tử có2 1 năng lượng bằng hoặc lớn hơn Ehh sẽ nhiều hơn, thể hiện ở đường cong phân bố Maxwell – Boltzmann dịch sang bên phải, do vậy chúng có khả năng tham gia vào phản ứng nhiều hơn làm cho tốc độ phản ứng tăng lên.Để tăng tốc độ của phản ứng hoá học, ta thường tăng nhiệt độ Mối liên quan giữa tốc độ và phản ứng và nhiệt độ được biểu diễn qua phương trình Arhenius

(1.1) trong đó: K – tốc độ của phản ứng; E – năng lượng hoạt hóa; P – yếu tố lập hh thể; R – hằng số khí; Z – hệ số va chạm; T – nhiệt độ tuyệt đối Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của lnK vào đại lượng được thể hiện trên hình 2 Đồ thị này có ý nghĩa quan trọng, dựa vào nó chúng ta có thể xác định được giá trị năng lượng hoạt hóa của một quá trình:

(1.2) Năng lượng hoạt hóa còn có thể được xác định thông qua một đại lượng khác, đại lượng Q10 Đại lượng Q hay còn10 được gọi là hệ số Van’t Hoff Đại lượng này là tỷ số giữa hai hằng số tốc độ của phản ứng ở điều kiện chênh lệch nhau 10 độ Censius (10 C) o

(1.3) Trong đó: K – hằng số tốc độ của phản ứng ở nhiệt độ ban đầu T ; K – 1 1 2 hằng số tốc độ của phản ứng ở nhiệt độ T2 = T +10; 1 Đại lượng Q có nghĩa quan trọng Nó cho biết hằng số tốc độ của phản ứng 10 tăng hay giảm bao nhiêu lần khi nhiệt độ thay đổi 10 C Biểu thức toán học thể o hiện mối liên quan giữa năng lượng hoạt hóa của quá trình đại lượng Q10 như sau:

(1.4) Trong hệ sinh học Q chính là tốc độ của phản ứng hoá học của một cơ quan 10 trong cơ thể Trong thí nghiệm này Q chính là tần số co bóp của tim ếch 10

Trong hệ sinh học, Q xấp xỉ 1,7; trong hệ hoá học Q từ 2-4 bởi vì mọi phản 10 10 ứng trong cơ thể chỉ xảy ra trong một phạm vi giới hạn nhiệt độ nhất định Nếu tăng nhiệt độ vượt ngưỡng cho phép thì thành phần các enzim xúc tác các phản ứng bị biến đổi làm cho phản ứng không thể xảy ra.

Trong thực nghiệm chúng ta có thể xác định đại lượng Q và do vậy việc tính giá10 trị năng lượng hoạt hóa của một quá trình (nhất là quá trình sinh học) trở nên dễ dàng Mục đích của bài thực tập là xác định năng lượng hoạt hóa của quá trình co bóp tim ếch tách rời.

Mục tiêu

1 Xác định được đối tượng nghiên cứu của động học;

1 Nắm vững năng lượng hoạt hóa của một phản ứng (một quá trình);

2 Mô tả mối liên quan giữa hằng số tốc độ của phản ứng với nhiệt độ;

3 Nắm vững bản chất của đại lượng Q và ý nghĩa của nó; 10

4 Thành thạo phương pháp cô lập tim ếch và tính năng lượng hoạt hóa của một quá trình sinh học.

1.3.1 Dụng cụ, hóa chất và vật liệu:

- 1 kéo to - 1 kéo con - 1 chọc tủy - 1 khay mổ - 10 đinh ghim - 4 cốc thủy tinh - 4 canuyl - 1 cuộn chỉ - 2 khăn lau dùng để mổ - 4 con ếch / nhóm

- 1 bàn xốp để ghim ếch - 2 công tơ hút - 3 bình tam giác có nút cao su dài hai lỗ

- 1 nồi cách thủy - 1 khay (chậu) nước đá - 2 nhiệt kế loại 0 – 50 C o - 1 lít dung dịch Ringer dung cho động vật biến nhiệt

Dùng kim chuyên dụng chọc tủy ếch Bước 2: Cách mổ ếch

- Đặt ếch lên bàn mổ, dung ghim cố định bốn chi ếch vào bàn mổ

Để quan sát tim ếch, sử dụng kéo cẩn thận mở rộng khoang ngực ếch, cắt bỏ màng bao tim để thấy rõ tim ếch với hai động mạch tách từ động mạch chủ, một sang trái, một sang phải Tiếp tục lật tim ếch lên để quan sát tĩnh mạch chủ nằm ở dưới.

- Dùng kéo panh nhỏ, luồn sợi chỉ dài chừng 15-20cm xuống dưới hai động mạch và tĩnh mạch chủ Cẩn thận trong khi luồn chỉ qua tĩnh mạch vì thành tĩnh mạch rất mỏng nên dễ bị rách

- Thắt chặt tĩnh mạch chủ và động mạch phía phải của ếch

Dùng chỉ nhẹ nhàng kéo động mạch trái lên, tạo một đường cắt vát nhỏ Sau đó, luồn canuyl chứa dung dịch Ringer (dung dịch sinh lý máu lạnh) qua lỗ nhỏ vào sâu trong tâm thất Khi tim co bóp đẩy máu lên, máu sẽ xuất hiện trong canuyl, chứng tỏ canuyl đã luồn đúng vào tâm thất.

Rút máu trong ống thông tĩnh mạch bằng ống hút, sau đó tiếp tục thụt rửa tim bằng dung dịch Ringer Thực hiện thụt rửa tim cho đến khi toàn bộ máu trong tim được thay thế hoàn toàn bằng dung dịch Ringer.

- Thắt chặt chỉ, buộc động mạch trái vào canuyl rồi dung kéo con cắt rời tim ra khỏi lồng ngực ếch, quả tim sau khi tách rời khỏi cơ thể mà vẫn đập, đẩy cột dung dịch sinh lý trong canuyl lên xuống nhịp nhàng thì việc tách rời (hay cô lập) tim ếch mới đạt yêu cầu

- Gắn canuyl có tim ếch và nhiệt kế vào hai lỗ nhỏ của nút bình tạo ẩm sao cho bầu thủy ngân của nhiệt kế và mỏm tim ở một độ cao như nhau Bình ẩm là bình tam giác thủy tinh có chứa dung dịch sinh lý để tạo độ ẩm cho tim cô lập hoạt động tốt hơn Nếu kỹ thuật tách tốt ta có một quả tim cô lập đập nhịp nhàng tới 8 giờ liên tục.

1 Xác định đại lượng Q và năng lượng hoạt động của quá trình 10 co bóp tim ếch tách rời

- Chuẩn bị ba bình ẩm chứa khoảng 50ml dung dịch Ringer ở 3 nhiệt độ khác nhau

Bình 1 Đặt ở nhiệt độ của phòng thí nghiệm

Bình 2 Đặt trong máy điều nhiệt có nhiệt độ cao hơn nhiệt độ phòng 10 o C

Bình 3 Đặt vào chậu nước đá để hạ nhiệt độ xuống thấp hơn nhiệt độ phòng 10 C o

- Khi nhiệt độ đã ổn định, đặt tim ếch cô lập vào bình ẩm ở nhiệt độ phòng, đếm số nhịp đập của tim trong thời gian 1 phút, đó chính là hằng số tốc độ của quá trình co bóp tim ếch tách rời (K ) đếm ít nhất 3 lần để lấy giá trị T trung bình

Lưu ý: Có thể xác định hằng số tốc độ của quá trình bằng cách xác định thời gian mà tim đập được 20 nhịp Suy ra 60 giây đập được bao nhiêu nhịp Làm như vậy có thể tiết kiệm được thời gian hơn

- Tiến hành tương tự như trên ở nhiệt độ cao hơn và thấp hơn 10 C so o với nhiệt độ phòng để xác định được KT+10 và KT-10 Cần chú ý mỗi lần thay đổi nhiệt độ phải chờ 3 phút cho tim thích ứng với điều kiện nhiệt độ mới trong bình ẩm

- Áp dụng công thức để tính đại lượng Q10 trong điều kiện tăng nhiệt độ :

Từ đó tính năng lượng hoạt hóa của quá trình co bóp tim ếch tách rời trong điều kiện này là:

(T1, T2 chuyển thành nhiệt độ tuyệt đối)Còn ở điều kiện giảm nhiệt độ thì:

Và năng lượng hoạt hóa là:

1.4 KẾT QUẢ THỰC HÀNH: Đo ở nhiệt độ phòng T( độ C ta được kết quả như sau:

Bảng tổng hợp số liệu trung bình

Hằng số tốc độ K Đại lượng

Tim ếch ở nhiệt độ 38 C đập mạnh hơn ở tim ếch nhiệt độ 28 C và đập yếu o o hơn ở nhiệt độ 18 C Như vậy ta thấy khi tăng nhiệt độ thì tốc độ đập của tim ếch o cũng tăng lên do năng lượng của các phân tử tăng lên, số phân tử có năng lượng bằng hoặc lớn hơn E nhiều hơn.hh

1 Phan Sỹ An (Chủ biên), Lý sinh Y học, NXB Y học, Hà Nội, 2005

2 Lương Duyên Bình (Chủ biên), Vật lý đại cương (3 tập), NXB Giáo dục Việt Nam, Hà Nội, 2010.

3 Nguyễn Thị Quỳ, Lý sinh học (Phần thực tập), NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội, 2002.

Bài 2 TÍNH TH}M MỌT CHI•U CỦA DA ẾCH

Màng tế bào có tính chất là hệ thống mở, nghĩa là chúng có khả năng vận chuyển các chất từ bên trong tế bào ra bên ngoài và ngược lại Đồng thời, màng tế bào cũng tham gia đào thải các chất thải ra bên ngoài môi trường, giúp tế bào duy trì sự cân bằng nội môi và hoạt động bình thường.

Da ếch là một trong những đối tượng kiểm tra tính thấm 1 chiều

Hình 2-1 Cấu tạo mô da ếch

1 Màng cutin; 2 Lớp tế bào sừng; 3 Các lớp tế bào sinh truở ng biểu mô; 4 Lớp tế bào màng nền; 5 Các sắc tố; 6 Lớp mô liên kết

Da ếch cấu tạo từ 2 lớp:

Lớp ngoài : Là tế bào biểu mô cấu tạo từ 3-8 lớp tế bào, lớp ngoài cùng lớp màng cutin có nguồn gốc ở tuyến nhầy của da ếch.

Lớp thứ 2 : Là lớp tế bài sừng

Lớp thứ 3: Là lớp tế bào hình tròn xếp thưa nhau nhờ đó tạo nên khoảng gian bào.

Lớp thứ 4:Là lớp tế bào hình lăng trụ, có nhân hình ovan, sắp xếp 1 cách xít nhau.

Lớp tế bào biểu ô luôn luôn phát triển để thay đổi, chngs có khả năng hấp thụ ạnh,phản ứng axit yếu.

Lớp trong:Là lớp mô liên kết chứa các sắc tố màu đen, chúng có đặc điểm hấp thụ yếu, phản ứng kiềm yếu,đặc biệt với một số chất nhuộm có tính kiềm yếu như xanh methylen, da ếch chỉ cho thấm từ trong da ngoài.

Ngày nay ngoài thực bào, uống bào (còn gọi là ẩm bào) có hai co ch ế vận chuyển vật chất qua màng tế bào đã được làm sáng tỏ, đó là:

Là co ch ế vận chuyển vật chất qua màng theo tổng các loại gradient, không tiêu tốn năng lượng Quá trình vận chuyển này diễn ra nhu mộ t quá trình khuếch tán, tuân theo định luật Fick

Cơ chế vận chuyển tích cực là cơ chế vận chuyển vật chất qua màng ngược tổng gradien có tiêu phí năng lượng của quá trình trao đổi chất Cơ chế này gắn liền với hoạt động của các chất mang là các phân tử lypoprotein trong thành phần cấu trúc màng.

1 Nắm vững thế nào là tính thấm cu‰a tế bào mô.

2 Nắm vững cơ sở của hiện tượng màng có tính thấm choŠn lọc.

3 Mô tả hai co ch ế vận chuyển vật chất qua màng tế bào.

4 Gia‰i thích được hiện tượng thấm một chiều của tế bào và mô

5 Nắm vững phương pháp dùng chất màu để nghiên cứu tính thấm.

2.3.THỰC HÀNH 2.3.1.Dụng cụ, hóa chất và vật liệu

- 1 kéo to sắc - 1 cuộn chi‰

Kết quả

Đo ở nhiệt độ phòng T( độ C ta được kết quả như sau:

Bảng tổng hợp số liệu trung bình

Hằng số tốc độ K Đại lượng

Nhiệt độ môi trường ảnh hưởng trực tiếp đến tốc độ đập của tim ếch Ở nhiệt độ 38 độ C, tim ếch đập mạnh hơn so với nhiệt độ 28 độ C, và đập yếu hơn ở nhiệt độ 18 độ C Điều này xảy ra do sự thay đổi nhiệt độ dẫn đến sự thay đổi năng lượng của các phân tử, làm tăng số lượng phân tử có năng lượng đủ để vượt qua ngưỡng năng lượng kích thích (E) cần thiết cho quá trình co bóp tim.

2 Lương Duyên Bình (Chủ biên), Vật lý đại cương (3 tập), NXB Giáo dục Việt Nam, Hà Nội, 2010.

Bài 2 TÍNH TH}M MỌT CHI•U CỦA DA ẾCH

Màng tế bào là một hệ thống mở vì vậy mà chúng có khả năng trao đổi các chất từ trong ra ngoài và ngược lại , đồng thời đào thải các chất cặn bã ra ngoài môi trường.

Lớp trong:Là lớp mô liên kết chứa các sắc tố màu đen, chúng có đặc điểm hấp thụ yếu, phản ứng kiềm yếu,đặc biệt với một số chất nhuộm có tính kiềm yếu như xanh methylen, da ếch chỉ cho thấm từ trong da ngoài.

Cơ chế vận chuyển tích cực là cơ chế vận chuyển vật chất qua màng ngược tổng gradien có tiêu phí năng lượng của quá trình trao đổi chất Cơ chế này gắn liền với hoạt động của các chất mang là các phân tử lypoprotein trong thành phần cấu trúc màng.

2.3.THỰC HÀNH 2.3.1.Dụng cụ, hóa chất và vật liệu

Để chế tạo mô hình lá phổi, bạn sẽ cần:- Một khay mổ hoặc bàn mổ- Bốn ống thủy tinh hình trụ dài 7-8 cm- Bốn nắp đậy bằng lá nhôm hoặc nhựa, với một lỗ được đục ở giữa cho vừa ống thủy tinh.

- 6 cốc thủy tinh loaŠi 100ml

2.3.2.Chu€n bị túi da ếch - 1 máy so màu để xác định mật độ quang học của dung dịch

Để thực hiện nhuộm cấy vi khuẩn cần có những vật tư và hóa chất sau: 100ml cồn 90 độ, 100ml dung dịch xanh methylen 0,05% trong dung dịch sinh lý, 100ml dung dịch sinh lý dành cho động vật biến nhiệt, 2 pipet loại 5-10ml cùng giá để pipet.

- 2 khăn lau dùng để mổ - 2 con ếch

Mỗi nhóm bắt hai con ếch, dung kim choŠc tủy ếch cho ếch bất động Cẩn thận lấy da cu‰a bốn bắp chân ếch sao cho không biŠ thủng để làm các túi da ếch

Dùng hai chiếc, một để nguyên, chiếc kia lộn ngược laŠi cho biểu mô vào trong rồi ngâm vào dung diŠch sinh lý cho da ếch giữ nguyên trạng thái sinh lý bình thường hai chiếc còn lại làm nhu tr ên nhung ngâm trong cồn 96 o với thời gian là 120 phút nhằm giết chết da ếch

Dùng chỉ buộc một đầu của những túi da ếch đã chuẩn bị trên vào các ống thủy tinh hình trụ, còn đầu kia buộc túm laŠi cho dung diŠch sinh lý vào túi để kiểm tra xem túi có bị rò rỉ không Nếu không, đổ dung diŠch sinh lý đi rồi cho 5ml dung diŠch xanh methylen 0,1% vào và nhúng các túi này vào các cốc đựng một luợ ng 100ml dung diŠch sinh lý bằng nhau

Chú ý sao cho mức xanh methylen trong túi cao bằng mức dung diŠch sinh lí trong cốc.

Quan sát hin tng thâm cua xanh methylen qua các túi ch Đặt các cốc có túi da ếch trên vao bình ổn nhiệt độ 22 C trong 40 phút Sau o đó nhận xét bằng mắt thường xem Xanh methylen khuyếch tán từ trong ra ngoài theo chiều nào: từ mô liên kết ra biểu mô hay ngược laŠi từ biểu mô ra mô liên kết Đồng thời so sánh với những túi đã ngâm trong cồn xem có nhận xét gì, ghi các nhận xét vào vở và báo cáo kết qua‰ với cán bộ hướng dẫn thực hành. Đ%nh lng Xanh methylen đã thâm qua da ch

Sau khi đặt các túi da ếch vào bình ổn nhiệt, trong khi chờ đợi kết qua‰, nhanh nhóng chuẩn bị các dung diŠch xanh methylen có các nồng độ: 0,002; 0,004;

0,006; 0,008; 0,01; 0,02% trong dung dịch sinh lí Dung máy so màu xác định mật độ quang học (D) của các dung diŠch vừa pha Dựng đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc mật độ quang học vào nồng độ, ta có đồ thị chuẩn

 Xác định lương xanh methylen đã thấm qua da

Sau 40 phút (hoặc lâu hon n ếu có thời gian) nhấc bỏ các túi da ếch ra kho‰i các cốc, dung đũa thủy tinh khuấy đều dung diŠch trong cốc rồi đêm xác định mật độ quang học trên máy so màu, Dựa vào đồ thị chuẩn xác định nồng độ xanh methylen đã thấm qua da ra ngoài

 Bình 1: Màu xanh nhiều methylen thấm qua khá nhiều

 Bình 2: Màu xanh nhiều lượng methylen thấm qua nhiều

 Bình 3: Màu xanh ở lớp da, có methylen thấm qua

 Bình 4: Màu trắng trong, Không có methylen thấm qua

Tính thấm một chiều của da ếch

Lý thuyết

Màng tế bào là một hệ thống mở vì vậy mà chúng có khả năng trao đổi các chất từ trong ra ngoài và ngược lại , đồng thời đào thải các chất cặn bã ra ngoài môi trường.

Lớp trong là một lớp mô liên kết chứa các sắc tố màu đen có khả năng hấp thụ yếu và phản ứng kiềm yếu Đặc biệt, với một số chất nhuộm có tính kiềm yếu như xanh methylen, da ếch chỉ cho thấm từ trong da ngoài.

Vận chuyển tích cực là cơ chế chuyển động vật chất qua màng ngược theo chiều gradien nồng độ, tiêu tốn năng lượng do quá trình trao đổi chất Quá trình này liên quan đến hoạt động của các chất mang, là những phân tử lypoprotein nằm trong thành phần cấu trúc màng.

Mục tiêu

Thực hành

- 1 khay mổ hoặc bàn mổ - 4 ống thủy tinh hình trụ có chiều dài 7-8 cm - 4 nắp đậy lá nhôm hoặc nhựa, ở giữa được đục một lỗ có đường kính bằng đường kính ống thủy tinh

- 6 cốc thủy tinh loaŠi 100ml

2.3.2.Chu€n bị túi da ếch - 1 máy so màu để xác định mật độ quang học của dung dịch

Chuẩn bị các vật tư sau để nhuộm Gram:* 100ml cồn 90 độ* 100ml dung dịch xanh methylen 0,05% trong dung dịch sinh lý* 100ml dung dịch sinh lý dùng cho động vật biến nhiệt* 2 pipet loại 5-10ml và giá để pipet

- 2 khăn lau dùng để mổ - 2 con ếch

Mỗi nhóm bắt hai con ếch, dung kim choŠc tủy ếch cho ếch bất động Cẩn thận lấy da cu‰a bốn bắp chân ếch sao cho không biŠ thủng để làm các túi da ếch

Dùng hai chiếc, một để nguyên, chiếc kia lộn ngược laŠi cho biểu mô vào trong rồi ngâm vào dung diŠch sinh lý cho da ếch giữ nguyên trạng thái sinh lý bình thường hai chiếc còn lại làm nhu tr ên nhung ngâm trong cồn 96 o với thời gian là 120 phút nhằm giết chết da ếch

Dùng chỉ buộc một đầu của những túi da ếch đã chuẩn bị trên vào các ống thủy tinh hình trụ, còn đầu kia buộc túm laŠi cho dung diŠch sinh lý vào túi để kiểm tra xem túi có bị rò rỉ không Nếu không, đổ dung diŠch sinh lý đi rồi cho 5ml dung diŠch xanh methylen 0,1% vào và nhúng các túi này vào các cốc đựng một luợ ng 100ml dung diŠch sinh lý bằng nhau

Chú ý sao cho mức xanh methylen trong túi cao bằng mức dung diŠch sinh lí trong cốc.

Quan sát hin tng thâm cua xanh methylen qua các túi ch Đặt các cốc có túi da ếch trên vao bình ổn nhiệt độ 22 C trong 40 phút Sau o đó nhận xét bằng mắt thường xem Xanh methylen khuyếch tán từ trong ra ngoài theo chiều nào: từ mô liên kết ra biểu mô hay ngược laŠi từ biểu mô ra mô liên kết Đồng thời so sánh với những túi đã ngâm trong cồn xem có nhận xét gì, ghi các nhận xét vào vở và báo cáo kết qua‰ với cán bộ hướng dẫn thực hành. Đ%nh lng Xanh methylen đã thâm qua da ch

Sau khi đặt các túi da ếch vào bình ổn nhiệt, trong khi chờ đợi kết qua‰, nhanh nhóng chuẩn bị các dung diŠch xanh methylen có các nồng độ: 0,002; 0,004;

0,006; 0,008; 0,01; 0,02% trong dung dịch sinh lí Dung máy so màu xác định mật độ quang học (D) của các dung diŠch vừa pha Dựng đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc mật độ quang học vào nồng độ, ta có đồ thị chuẩn

 Xác định lương xanh methylen đã thấm qua da

Sau 40 phút (hoặc lâu hon n ếu có thời gian) nhấc bỏ các túi da ếch ra kho‰i các cốc, dung đũa thủy tinh khuấy đều dung diŠch trong cốc rồi đêm xác định mật độ quang học trên máy so màu, Dựa vào đồ thị chuẩn xác định nồng độ xanh methylen đã thấm qua da ra ngoài.

Kết quả

 Bình 1: Màu xanh nhiều methylen thấm qua khá nhiều

 Bình 2: Màu xanh nhiều lượng methylen thấm qua nhiều

 Bình 3: Màu xanh ở lớp da, có methylen thấm qua

 Bình 4: Màu trắng trong, Không có methylen thấm qua

Giải thích

Với cấu tạo của da ếch , lớp tế bào biểu mô ở ngoài là lớp có tính hấp thụ cao và có tính axit yếu Ngược lại, lớp mô liên kết có tính chất hấp thụ yếu và kiềm kiém.Với dung dịch kiềm yêu methylen nên lớp tế bào biểu mô và lớp liên kết có tính hấp thụ khác nhau Vì tế bào biểu mô có tính hấp thụ cao và axit yếu sẽ hấp thụ mạnh dung dịch kiềm yếu methylen và đưa dung dịch ra ngoài Còn lớp mô liên kết có tính hấp thụ yếu và kiềm yếu nên hấp thụ tốt đưa dung dịch methylen và lớp mô liên kết sẽ hấp thụ và giữ lại.

Bình 1 bị lộn ngược lại nên lớp mô liên kết sẽ ở ngoài và chúng có tính hấp thụ yếu nên bình k có màu xanh.

Bình 2 lớp da ếch giữ nguyên nên lớp tế bào biểu mô ở ngoài và hấp thụ tốt methylen nên bình có màu xanh. Đối với bình 3 và 4: Cồn đã giết chết tế bào trên da ếch Làm cho dung dịch tự do khuếch tán theo 2 chiều

Như vậy tính thấm của da ếch từ trong ra ngoài tế bào cao hơn tính thấm từ ngoài vào trong

Tài liệu tham khảo

Xác định độ bền của màng tế bào hồng cầu

Lý thuyết

Chúng ta biết màng tế bào có một ý nghĩa đặc biệt quan trọng trong đời sống của tế bào U.B.Frank – một nhà lý sinh nổi tiếng đã nói rằng: “Mọi hoạt động sống đều diễn ra trên “sân khấu” – màng” Màng ở đây được hiểu theo một ý nghĩa rộng, gồm các loại màng có mặt ở bên trong tế bào (màng nội bào) và màng sinh chất, màng bao quanh tế bào.

Màng sinh chất giữ nhiệm vụ bảo vệ, trao đổi thông tin và vật chất giữa tế bào với môi trường bên ngoài.

Tế bào hồng cầu là một đối tượng điển hình để chúng ta nghiên cứu cấu tạo, tính chất và chức năng của màng tế bào.

Trên hình 3.1 là hình ảnh chung về tế bào hồng cầu người quan sát qua kính hiển vi điện tử Tế bào có bề mặt lõm để tăng diện tích tiếp xúc với môi trường ngoài Hồng cầu trưởng thành là một loại tế bào không nhân Cấu tạo màng tế bào hồng cầu, nhìn chung giống như màng sinh chất của các loại tế bào khác, gồm các protein màng tế bào – lớp lipit kép – protein khảm vào nhau Có một điểm khác biệt là ở bề mặt bên trong màng tế bào hồng cầu tồn tại một mạng lưới vật chất có nguồn gốc là protein dạng sợi và được gọi là spectrin Spectrin chiếm một tỉ lệ là 30% tổng số protein của màng và là phức hợp của hai sợi polypeptit có trọng lượng phân tử khoảng 220.000 – 240.000Da (dalton) Cùng với một vài loại protein khác, spectrin tham gia vào quá trình biến đổi hình dạng hồng cầu thông qua việc co ngắn hay duỗi dài dạng sợi của mình Bằng cách đó tế bào hồng cầu có thể biến đổi hình dạng giúp cho nó đi qua được các mao mạch nhỏ li ti, ở khắp cơ thể Đặc biệt là ở lách, những tế bào hồng cầu đã già hoặc bị thoái hóa chức năng, khả năng đàn hồi co giãn các sợi spectrin kém, không có khả năng đi qua mao mạch kiểm soát của cơ quan màng và bị lách tiêu hủy.

Hình 3.1 - Tế bào hồng cầu người quan sát qua kính hiển vi điển tử Ở trạng thái sinh lí bình thường, màng hồng cầu khá bền vững Thể tích của tế bào thường không thay đổi và được điều tiết bởi tỉ lệ lượng các chất hòa tan bên trong và bên ngoài tế bào Chúng ta biết, lượng các ion của các muối hòa tan trong tế bào là một hằng số ổn định Do đó thể tích tế bào phụ thuộc vào lượng ion của môi trường bên ngoài Chúng ta biết có ba loại môi trường: môi trường ưu trương, môi trường đẳng trương và môi trường nhược trương.

Trong điều kiện đẳng trương, màng tế bào hồng cầu giữ được sự ổn định Ở môi trường ưu trương, tế bào co lại dưới tác động của áp suất thẩm thấu từ bên ngoài Ngược lại, trong môi trường nhược trương, tế bào trương phồng và vỡ do áp suất thẩm thấu từ bên trong gây ra, khiến nước tràn vào và giải phóng các chất tế bào ra ngoài Độ bền của màng hồng cầu phụ thuộc vào nồng độ dung dịch muối trong môi trường nhược trương, tại đó không xảy ra hiện tượng hồng cầu bị tan.

Trong bài thực tập này, chúng ta tìm hiểu phản ứng khác nhau của tế bào động vật (hồng cầu) khi tiếp xúc với ba môi trường nêu trên và xác định độ bền của màng hồng cầu.

Mục tiêu

1.Phân biệt môi trường ưu, nhược và đẳng trương

2 Phản ứng của tế bào động vật trong các loại môi trường đó

3 Thành phần cấu trúc nào của màng tế bào hồng cầu giúp nó có thể thay đổi thể tích trong một giới hạn nhất định.

4 Nắm được khái niệm độ bền của màng tế bào hồng cầu và ý nghĩa.

5 Thành thạo phương pháp sử dụng dung dịch nhược trương xác định độ bền của màng tế bào hồng cầu.

Thực hành

1.Dụng cụ, hóa chất và vật liệu

- 10 ống nghiệm loại 10ml - 1 máy so màu

- 500 ml nước cất - 250 ml dung dịch sinh lý máu nóng pH = 7,4

- 3 pipet loại 5 ml - Tế bào hồng cầu động vật máu nóng

- 1 pipetman 100μl , giấy thấm, khăn lau.

2.Các bước tiến hành i Lấy mẫu tế bào hồng cầu

Dùng citrat natri hoặc heparin để lấy máu chống đông Rửa tế bào hồng cầu bằng cách quay li tâm (1200 vòng/phút trong 5 phút) máu chống đông trong dung dịch sinh lý PBS 9 0 /00 (có pH = 7,4) ba lần

Trước khi li tâm dùng ống hút sục nhẹ nhàng cho hồng cầu phân bố đều trong dung dịch, tránh bị vỡ Sau lần li tâm thứ ba, phân tán đều hồng cầu trong dung dịch PBS nói trên sao cho có mật độ là 5.10 tế bào/ml 6 ii Xác định độ bền của màng tế bào hồng cầu

Chuẩn bị 10 ống li tâm, đánh số từ 0 đến 10 Pha vào mỗi ống nghiệm 5ml dung dịch muối NaCl tương ứng với các nồng độ 0; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7;

0,8; 0,9%, sau đó thêm vào mỗi ống nghiệm 500μl dịch hồng cầu đã chuẩn bị trên Để các ống nghiệm vào tủ ấm 37 C trong 15 phút rồi li tâm 3000 vòng/phút Sau 0 khi li tâm, quan sát màu của dịch Màu đỏ là màu của huyết sắc tố thoát ra sau khi màng tế bào hồng cầu bị vỡ Nồng độ thấp nhất của các ống không có màu đỏ là giới hạn bền của màng tế bào hồng cầu.

Kết quả

Màu sắc Đỏ Đỏ Hồng nhạt Trắng Trắng Trắng Trắng Trắng Trắng Trắng

Giải thích

Do nồng độ NaCl trong môi trường nhiều hơn so với trong tế bào hồng cầu làm cho nước đi vào làm thề tích tế bào tăng, chúng trương phồng lên rồi bị vỡ ra, và giải phóng các chất ra ngoài môi trường gây ra hiện tượng huyết tiêu.

Lượng nước đi vào các ống nghiệm giảm dần từ ống 1 đến ống 10 (vì nồng độ NaCl tăng dần từ ống 1 đến ống 10 và thể tích ở mỗi ống nghiệm không đổi) nên các tế bào trong ống 1 bị vỡ nhiều nhất làm cho dung dịch có màu đậm nhất

Ngược lại ở ống 4 tuy nước đi từ môi trường vào trong tế bào nhưng chưa đủ để gây ra hiện tượng huyết tiêu tức là tế bào hồng cầu trương lên tới mức tối đa nhưng chưa vỡ.

 Nồng độ nhược trương lớn nhất chưa đủ gây ra hiện tượng huyết tiêu là 0,4%

Các ống 4,5,6,7,8,9,10 hồng cầu không bị vỡ ra lắng xuống đáy dung dịch trong suốt dần.

Khi ly tâm, tế bào hồng cầu nguyên vẹn và tế bào hồng cầu bị vỡ sẽ bị lắng xuống dưới đáy Tuy nhiên tế bào hồng cầu bị vỡ có kích thước nhỏ dễ khuyếch tán nên tạo ra màu đỏ của dung dịch Càng nhiều tế bào hồng cầu bị vỡ, lượng tế bào khuyếch tán càng nhiều và dung dịch có màu càng đậm Trong khi tế bào hồng cầu nguyên vẹn lắng đọng dưới đáy và không khuyếch tán được do quá trình ly tâm.

Đo kích thước tế bào trên kính hiển vi

Lý thuyết

Để đo kích thước các vạch nhỏ khi quan sát dưới kính hiển vi như hạt phấn hoa, tế bào hay kích thước sợi bông, sợi tóc, không thể đo trực tiếp bằng thước đo chiều dài thông thường mà phải đo gián tiếp qua thước đo được gắn vào thị kính của kính hiển vi, gọi là trắc vi thị kính (thước đo thị kính).

- Loại đơn giản là một miếng kính hình tròn, ở giữa có một vạch dài 5mm được chia ra làm 50 khoảng cách đều nhau Khi sử dụng được đặt vào một cái gờ giữa hai thấu kính của thị kính.

- Loại cải tiến được dùng phổ biến trong các phòng thí nghiệm là loại AM-9-

2 Nó được cấu tạo từ một thị kính 15x và một hệ thống chia vạch để đo Hệ thống chia vạch gồm một kính phẳng cố định, trên đó khắc các vạch cách đều nhau đánh số từ 0 đến 8 Ngoài ra, còn một kính di động có khắc hai vạch chéo nhau đi kèm với hai vạch song song Kính di động này được gắn liền với một trống chia độ bên ngoài Xung quanh vòng tròn trống chia độ được chia thành 100 vạch bằng nhau Khi vặn trống chia độ hết một vòng (đi hết 100 vạch) thì sẽ làm dịch chuyển 1 vạch trên kính cố định (dịch được 1mm) Như vậy mỗi vạch trên trống chia độ tương ứng với 1/100 vạch ở kính cố định.

Thước đo vật kính là một phiến kính có kích thước 26 x 76 x15mm Ở chính giữa phiến kính có khắc một thước đo dài 1mm thành 100 vạch bằng nhau.

Chiều dài mỗi vạch là 0,01mm (10àm) Thước đo này được bảo vệ bởi một miếng kính nhỏ, tròn bằng cách gắn lên trên thước đo Xung quanh thước đo được đánh dấu bằng một vòng tròn màu đen Thước này đặt lên bàn kính hiển vi để xác định độ dài của mỗi vạch chia trên thước đo thị kính đã được dùng để đánh dấu khoảng cách, hoặc kích thước vật muốn đo.

Để đo kích thước vật quan sát dưới kính hiển vi ở độ phóng đại nhất định, cần xác định chiều dài thực tế của mỗi đơn vị khoảng cách trên thước đo thị kính Khi quan sát vật ở độ phóng đại đó, đặt thước đo vật kính lên bàn kính hiển vi, điều chỉnh sao cho vạch đầu thước đo thị kính trùng với vạch đầu thước đo vật kính, rồi đếm số khoảng cách trên thước đo thị kính ứng với bao nhiêu khoảng cách trên thước đo vật kính.

Ví dụ 1 Ở độ phóng đại 32 (thị kính 10x, vật kính 3,2) thì 5 khoảng cách ở thước đo thị kính (ký hiệu là a) trùng khít hoàn toàn với 22 khoảng cách của thước đo vật kính (ký hiệu b) Như vậy, mỗi khoảng cỏch của thước đo vật kớnh cú độ dài 10àm, thỡ chiều dài một khoảng cách trên thước đo thị kính ở độ phóng đại trên là :

Khi đã biết độ dài một khoảng của thước đo thị kính, lấy thước đo vật kính ra và thay bằng tiêu bản vật cần đo lên bàn kính hiển vi, xác định xem vật đó có độ dài là mấy khoảng của thước đo thị kính.

Vật cần đo hoặc tế bào vi sinh vật có độ dài là ba khoảng của thước đo thị kính ở cùng độ phóng đại nêu trên (là 32) thì giá trị độ dài của nó là :

Muốn đo được chính xác, người ta thường đo nhiều lần rồi lấy giá trị trung bình.

- Nếu dùng thước đo thị kính loại AM-9-2 ta làm như sau : Nhìn vào thị kính, điều chỉnh trống chia độ cho giao điểm của vạch chéo chạy về số 0. Đồng thời điều chỉnh cho giới hạn thứ nhất của vật cần đo rơi vào trùng giao điểm trên Tiếp theo, vặn trống chia độ cho giao diểm của vạch chéo chạy sang điểm giới hạn thứ hai của vật đo Đọc số chẵn trên thước đo cố định của thị kính và số lẻ trên trống chia độ.

Chiều dài của vật cần đo được đo bằng cách xác định số vạch trên thước cố định và trống chia độ tương ứng với chiều dài của vật Trong trường hợp này, chiều dài của vật tương ứng với ba vạch trên thước cố định và 25 vạch trên trống chia độ Nếu độ phóng đại của hệ thống đo bằng 44, thì chiều dài thực tế của vật có thể được tính bằng cách chia chiều dài đo được cho độ phóng đại.

Mục tiêu

1 Quan sát thước đo vật kính và biết được giá trị độ dài của mỗi vạch 2 Cách đo kích thước tế bào trên kính hiển vi

3 Xác định được hệ số dài của một khoảng thị kính và kích thước trung bình của tế bào hồng cầu

Thực hành

- Kính hiển vi - Thước đo thị kính AM-9-2 - Thước đo vật kính - Tiêu bản tế bào ung thư sarcoma 180 nhuộm eosin hoặc giemsa.

Bước 1 : Quan sát tế bào trên tiêu bản.

Bước 2 : Tiến hành đo kích thước của 40 tế bào ở các vị trí khác nhau trên tiêu bản bằng cách đo sử dụng máy đo gắn với máy vi tính (cách 1) và cách đo trực tiếp (cách 2)

Bước 3 : Sử dụng quy tắc toán thống kê tính kích thước trung bình của tế bào.

Kết quả

Tính kích thước trung bình của tế bào theo quy tắc của toán thống kê sinh học

Số liệu 33,06px 117,8px 50,33px 35,23px 32,2px 30,48px

Số liệu 31,06px 48,09px 34,93px 31px 23,02px 32,76px

Số liệu 23,02px 36px 40,25px 38,18px 35,36px 31,89px

Số liệu 17,89μm 18,91μm 21,37μm 11,12μm 0,92μm 14,77μm 2 Đo trực tiếp (Thị kính 15x, vật kính 40x, 4,44 vạch = 100 μm)

Số liệu 1 vạch 1,5 vạch 0,8 vạch 1,2 vạch 1 vạch

Số liệu 0,9 vạch 1,1 vạch 0,8 vạch 2 vạch 1,5 vạch

3 Các thông số thống kê: a Kích thước tế bào trung bình: = ,013 μm b Phương sai mẫu hiệu chỉnh: s = 2 =82.51851 c Độ lệch chuẩn: σ = = 9.08397

Xác định thế Dzeta của tế bào bằng phương pháp vi điện di

Lý thuyết

Trong hệ dị thể, đặc biệt là đối tượng sinh học, sự chuyển động tương đối giữa pha phân tán và môi trường phân tán tạo ra hiệu điện thế giữa chúng Hiện tượng này có thể xảy ra do ảnh hưởng của điện trường không đổi, chênh lệch áp suất thủy tĩnh hoặc gradient trọng lực.

Những hiện tượng này được gọi là các hiện tượng điện động học Một trong các hiện tượng điện động học là điện di Điện di là sự chuyển động của pha phân tán so với môi trường phân tán dưới tác dụng của điện trường không đổi Chẳng hạn trong hệ dị thể gồm các tế bào nấm men và môi trường sống của chúng thì các tế bào được coi là pha phân tán, nó sẽ chuyển động khi có tác dụng của dòng điện một chiều bên ngoài so với môi trường sống của nó – môi trường phân tán Sở dĩ tế bào có thể di chuyển định hướng được vì chúng có điện tích bề mặt Nếu trên bề mặt tích điện dương thì chúng sẽ chuyển động về phía cực âm của điện trường ngoài, ngược lại nếu tích điện âm thi chúng sẽ chuyển động về phía cực dương

Điện di là quá trình di chuyển của các hạt phân tán trong dung dịch dưới tác động của điện trường, khi các hạt phân tán này có dấu điện trái với dấu điện tích bề mặt của điện cực.

Sở dĩ trên bề mặt của pha phân tán có điện tích là do 2 nguyên nhân cơ bản sau:

1 Do chúng có khả năng hấp phụ các ion lên bề mặt;

2 Do chúng có khả năng ion hóa các nhóm phân li của phân tử cấu thành nên chúng

Những ion bám chặt trên bề mặt hạt được gọi là ion tạo th Chúng có ái lực đối với các ion khác dấu phân bố trong môi trường phân tán Loại ion này được gọi là ion ngh%ch Càng xa bề mặt các ion tạo thế, lượng ion phân bố càng thưa dần.

Do lực hút tĩnh điện giữa hai loại ion tạo thế và ion nghịch đã tạo nên trên bề mặt hạt một lớp điện kép Chiều dày lớp điện kép này phụ thuộc vào nồng độ của dung dịch, điện tích của hạt và nhiệt độ môi trường, nó có thể biến thiên từ vài A đến vài μm 0

Cấu trúc lớp điện tích kép khá phức tạp, có thể cho rằng ngoài các ion tạo thế gắn chặt trên bề mặt hạt còn có một số các ion nghịch bám xung quanh do lực hút tĩnh điện

Lớp chất lỏng của môi trường có các ion nghịch bám quanh bề mặt hạt, chuyển động cùng với hạt dưới tác động của điện trường ngoài được gọi là lớp hâp ph Lớp chất lỏng của môi trường ion nghịch còn lại được gọi là lớp khuch tán Khi hạt chuyển động trong điện trường giữa lớp hấp phụ và lớp khuếch tán xuất hiện một bước nhảy điện thế Điện thế này được gọi là thế điện động hay thế Dzeta, ký hiệu là ζ.

Dấu của thế ζ do dấu của ion tạo thế quyết định, còn giá trị của thế ζ tỷ lệ với hiệu số điện thế do ion tạo thế với ion nghịch trong lớp hấp thụ Nói một cách khác, giá trị của thế ζ bằng giá trị thế do các ion nghịch trong lớp khuếch tán tạo nên Vì vậy lượng ion nghịch trong lớp khuếch tán càng lớn thì thế ζ càng cao. ζ - điện thế của mỗi loại tế bào ở trạng thái sinh lý bình thường là một đại lượng cố định Khi bị tổn thương hay biến đổi trạng thái thì giá trị thế ζ thay đổi Dựa vào giá trị ζ điện thế có thể đánh giá về trạng thái chức năng của tế bào.

Không có một phương pháp nào có thể đo giá trị thế ζ một cách trực tiếp Người ta thường sử dụng phương pháp vi điện di để xác định giá trị ζ một cách gián tiếp.

Nguyên lý phương pháp vi điện di: Dựa trên chuyển động của tế bào trong điện trường không đổi để xác định tốc độ di động (v) của tế bào Tốc độ di động phụ thuộc vào thế điện động (ζ) của tế bào, có thể tính toán theo công thức f = q.E, trong đó f là lực làm hạt tích điện q chuyển động dưới tác dụng của điện trường E.

Khi chuyển động, hạt chịu tác dụng của lực cản f , theo định luật Stocxơ thì:2 f2 = 6πηvr (đối với hình cầu) f2 = 4πηvr (đối với hạt có dạng gần giống với hình cầu) trong đó: η – độ nhớt của môi trường trong đó hạt chuyển động (puazơ); v - tốc độ chuyển động của hạt (μm/s); r – bán kính của hạt.

Khi hạt chuyển động đều thì f1=f2 nghĩa là q.E=6πηvr Đối với một hạt hình cầu có thể xem: q = ζεr trong đó: ζ – điện thế trên bề mặt hạt hình cầu; ε – hằng số điện môi; r – bán kính của hạt.

Ta có thể viết: ζεrE = 6πηvr ζ = (hay ζ = ) Để cho đơn giản, coi môi trường phân tán là nước thì hằng số điện môi ε = 81; η = 0,01 puazơ Theo công thức trên thì thế ζ được tính bằng đơn vị tĩnh điện (đvtđ) Thay các giá trị vào ta sẽ được biểu thức để tính giá trị thế ζ đối với các tế bào nấm men: ζ = 140 (mV)

Ta biết tốc độ v = (s- quãng đường, t-thời gian hạt đi được quãng đường S) gradient điện thế E = (V/cm) (u- hiệu điện thế giữa hai đầu cầu aga hình chữ L trong buồng đo, l-khoảng cách giữa hai đầu cầu đó).

Mục tiêu

1 Hiểu được khái niệm vi điện di

2 Giải thích được tại sao một số tế bào rời và đa số các đại phân tử sinh vật lại chuyển động được dưới tác dụng của điện trường.

3 Hiểu được nguồn gốc điện tích trên bề mặt tế bào.

4 Phân biệt được các khái niệm: ion tạo thế, ion nghịch, lớp hấp phụ và lớp khuyếch tán.

5 Hiểu được bản chất và ý nghĩa của thế điện động (thế Dzeta)

6 Thành thạo phương pháp xác định thế Dzeta điểm đẳng điện của loại tế bào rời và dấu của điện tích bề mặt.

Thực hành

- 1 kính hiển vi quang học có trắc vi vật kính và trắc vi thị kính - Nguồn điện một chiều 150 von + điện cực bằng đồng và dây dẫn - 1 khóa 6 chốt để đảo mạch

- 2 cầu agar hình chữ U - 1 panh

- 1 buồng đo điện di - 2 cầu agar hình chữ L - 2 công tơ hút - 2 pipet loại 2ml và 5 ml

- Giấy thấm, khăn lau thấm nước - 1 ống tế bào nấm men - 250ml dung dịch KCl bão hòa - 250 ml dung dịch CuSO 10%4

- 250 ml dung dịch axit citric 0,1M

- 2 đĩa đồng hồ loại to

- 1 đồng hồ đo điện vạn năng

- 1 mẩu giấy kẻ oli dài 5-> 7cm

1 Mắc mạnh điện theo hình :

2 Pha dung dịch Măc-in-ven và dung dịch đệm Măc-in-ven

Pha dung dịch Măc-in-ven có các pH = 2,4; 4,0; 5,2; 6,2; 7,0 bằng cách trộn hai dung dịch Na2HP04 0.2M và dung dịch acid citric 0,1M theo tỉ lệ Lấy dung dịch pH vừa pha trên trộn với dung dịch glucose 8% tỉ lệ 1:9 sẽ được dung dịch đệm măc-in-ven có pH tương ứng. pH Na2HPO4 0,2M (μl) Acid Citric 0,1M (μl) Glucose 8% (μl)

3 Xác định dấu điện tích bề mặt tế bào và giá trị thế dezta của chúng4 Xác định điểm đẳng điện của tế bào

Kết quả

STT pH S(cm) L(cm) U(mV) t(s) ζ Kết luận về điểm đẳng điện

Với pH càng tăng thì thì tế bào di chuyển càng chậm và thế ζ của chúng càng nhỏ.Vì vậy điểm đẳng điện của chúng là pH >= 7.0

Giải thích

pH của dung dịch càng tăng thì thế ζ của tế bào càng giảm do vời pH càng thấp tức nồng độ ion H càng cao thì điện tích Q chạy qua tế bào càng nhiều Trong + khi khoảng cách giữa 2 lớp hấp phụ và lớp khuyếch tán không đổi, điện thế Q được chuyển đến tế bào giảm dần từ pH thấp đến pH cao do vậy thế ζ của giảm dần.

Định lượng protein bằng phương pháp quang phổ hấp thụ

Mục tiêu

1 Hiểu được phản ứng của thuốc nhuộm Commasie xanh và ứng dụng trong xét nghiệm nồng độ.

2 Biết được thao tác sử dụng máy và đọc kết quả quang phổ kế.

3 Hiểu được áp dụng định luật Lambert-Beer trong việc xác định nồng độ chất.

Thực hành

- Dung dịch BSA (1mg/ml)

- Dung dịch thuốc nhuộm xanh Commasie 1x - protein với nồng độ chưa xác định

- B1: Pha dung dịch protein chuẩn (BSA) có nồng độ 10mg/ml trong PBS.

- B2: Pha dung dịch thuốc thử Bradford

+ Pha 0,1g G250 và 50ml methanol rồi pha loãng đến 500ml được dung dịch A

+ Pha 100ml 85% H 3 PO 4 được dung dịch B + Trộn dung dịch A với B rồi lọc ta được dung dịch Bradford - B3: Dùng pipet hút 0; 0.2 ml dung dịch BSA vào ống falcon up tới 1ml PBS.

- B4: Thêm dung dịch nhuộm vào ống falcon theo tỉ lệ 1:9.

- B5: Tắt đèn, để phản ứng diễn ra Tối thiểu 5 phút và không quá 20 phút.

- B6: Đo bằng quang phổ kế ở 595nm để xác định độ hấp thụ A (absortion)

Nếu quang phổ kế không phát hiện bất kỳ tín hiệu nào trong mẫu trắng, thì giá trị trung bình của mẫu trắng sẽ được lấy làm giá trị nền Giá trị này sẽ được trừ đi khỏi giá trị của mẫu chuẩn và mẫu cần đo để khử nhiễu và hiệu chỉnh tín hiệu, mang lại kết quả chính xác hơn.

- Xây dựng đường chuẩn với độ hấp thụ ở bước sóng 595nm ở trục y và nồng độ ở trục x Xác định nồng độ dung dịch mẫu chưa biết bằng đường chuẩn Nếu mẫu đã được pha loãng ta xác định nồng độ mẫu bằng cách nhân với hệ số pha loãng đã dùng.

Kết quả

Dung dịch Mức độ hấp thụ quang (Absortion) Giá trị trung bình

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 f(x) = 0.04 x + 0 R² = 1 Đ ườ ng chu n nồồng đ BSA ẩ ộ Đ ườ ng chu n nồồng đ BSA ẩ ộ Linear (Đ ườ ng chu n nồồng đ ẩ ộ BSA )

Nồồng đ dung d ch (mg/ml) ộ ị Đ h ấấ p t h qua ng b c són g 5 95nm ộ ụ ở ư ớ

Dựa vào kết quả trên, ta xây dựng được đường chuẩn có công thức Y = 0,0357x+ 0,0026 với hệ số tương quan = 0,9999

Với y = 0,058 thay vào phương trình trên ta dc x = 1,552 Như vậy nồng độ dung dịch trong mẫu được đo là 1,552 mg/ml.

3 Bradford, Marion (1976) "A Rapid and Sensitive Method for the Quantification of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye

Binding" (PDF) Analytical Biochemistry : 248–254 72 doi: 10.1006/abio.1976.9999 – via Google Scholar.

4 https://en.wikipedia.org/wiki/Bradford_protein_assay

Quan sát hiện tượng huỳnh quang

Lý thuyết

Nguồn năng lượng chủ yếu của sinh vật trên trái đất là năng lượng bức xạ mặt trời Dưới tác dụng của ánh sáng mặt trời sự sống đã phát sinh, duy trì và phát triển Để tồn tại và tiến hóa, sinh vật thu nhận năng lượng từ ánh sáng mặt trời rồi chuyển hóa nó sang dạng năng lượng khác cần thiết cho sự sống qua những phản ứng đặc hiệu. Ánh sáng là bức xạ điện từ trường lan truyền trong không gian với vận tốc vô cùng lớn (trong chân không vận tốc ánh sáng đạt 300,000 km/s) Ánh sáng được chia thành 3 vùng cơ bản:

- Vùng nhìn thấy (vùng khả kiến) có bước sóng (λ) từ 400 – 700nm.

- Vùng tử ngoại có λ = 200 – 400nm.

- Vùng hồng ngoại có λ = 700 – 1000nm.

Trong hệ sinh vật, các loài có vùng khả kiến không giống nhau Ví dụ, với người vùng khả kiến có λ = 400 – 700nm nhưng với côn trùng vùng khả kiến lại có λ – 320 – 500nm.

Quá trình hấp thụ ánh sáng của vật chất có phương trình : A + hv A * là quá trình vật lý lượng tử thuần túy với cơ sở là sự tương tác giữa vectơ điện của lượng tử ánh sáng với nguyên tử hoặc phân tử.Nguyên tử (phân tử) chỉ hấp thụ lượng tử có bước sóng (λ) xác định với năng lượng tương ứng với hiệu năng lượng ( E)  giữa hai trạng thái, trạng thái cơ bản và trạng thái kích thích của nguyên tử (phân tử) có phương trình như sau:

E = hc/λ Trong đó: h: hằng số Plan c: tốc độ ánh sáng λ: bước sóng của ánh sáng- Giai đoạn hấp thụ lượng tử ánh sáng và giai đoạn khử trạng thái kích thích điện tử của phân tử, đặc trưng chung cho tất cả các phản ứng quang sinh học:

- Đường A, a: Khi phân tử hấp thụ năng lượng ánh sáng để chuyển từ mức năng lượng cơ bản ban đầu (S ) lên mức năng lượng cao hơn (S hoặc S )0 1 2

- Theo cơ học lượng tử thì không có bước chuyển phát xạ (phát sóng ánh sáng) khi phân tử chuyển từ mức S về mức S và cũng không có bước chuyển 2 0 thẳng từ mức S lên mức triplet (bước cấm).0

- Khi phân tử chuyển từ mức S về mức cơ bản S sẽ phát huỳnh quang (b) 1 0 hoặc chuyển từ mức triplet về mức cơ bản S sẽ phát lân quang (c).0

- Các đường 1, 2, 3, 4 là phân tử thải hồi năng lượng dưới dạng tỏa nhiệt ra môi trường.

Quá trình phân tử hấp thụ năng lượng ánh sáng để chuyển lên trạng thái kích thích và sau đó trở về trạng thái ban đầu là một quá trình bất thuận nghịch.

Cảm giác màu sắc là một chuỗi của quá trình sinh lý và tâm lý phức tạp khi bức xạ trong vùng khả kiến chiếu vào võng mạc của mắt Ánh sáng chiếu vào một chất nào đó nó đi qua hoàn toàn thì đối với mắt ta chất đó không màu (thí dụ, thủy tinh hấp thụ các bức xạ với bước sóng nhỏ hơn 360 nm nên nó trong suốt với các bức xạ khả kiến) Một chất hấp thụ hoàn toàn tất cả các tia ánh sáng thì ta thấy chất đó có màu đen Nếu sự hấp thụ chỉ xảy ra ở một khoảng nào đó của vùng khả kiến thì các bức xạ ở khoảng còn lại khi đến mắt ta sẽ gây cho ta cảm giác về một màu nào đó Chẳng hạn, một chất hấp thụ tia màu đỏ (λ = 610 – 730) thì ánh sáng còn lại gây cho ta cảm giác lục.

Sơ đồ biểu diễn các mức năng lượng của phân tử và các bước chuyển giữa các mức năng lượng đó.

Mục tiêu

1 Nắm được bản chất ánh sáng.

2 Hiểu được quy luật hấp thụ ánh sáng

Thực hành

- 2 dịch chiết thực phẩm - Đèn UV

- Kính lọc với các chiết suất khác nhau

- Nhỏ 2 giọt dịch chiết thực phẩm lên giấy lọc- Tắt đèn phòng, bật đèn UV pha quan sát giấy lọc thấm dịch chiết qua kính lọc với các chiết suất khác nhau.

Kết quả

Giải thích

Mỗi kính lọc chỉ cho bước song trong dải cho phép đi qua (ví dụ kính lọc 420nm cho phép bước sóng từ 410nm đến 430nm đi qua) Do vậy ta thu được dải hình ảnh ứng với dải bước sóng chiếu đến theo vùng ánh sáng khả kiến từ 400-700nm 2 giọt dịch chiết thực phẩm hấp thụ ánh sáng khác giấy lọc hấp thụ ánh sáng nên khi chiếu lên tia UV ta thu được bước song phát ra là khác nhau Với kính lọc 650nm ta không thu được gì nữa vì kính lọc không cho ánh sáng không lọt qua.

2 Bài giảng Lý Sinh học chương 6, thầy Đỗ Minh Hà.