Báo Cáo Thực Hành Vi Sinh Đại Cương.pdf

Trang 1

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG THƯƠNG TP HCM KHOA SINH HỌC & MÔI TRƯỜNG

BÁO CÁO THỰC HÀNH

VI SINH ĐẠI CƯƠNG

TP Hồ Chí Minh, 2023

Trang 2

BÀI 1 AN TOÀN SINH HỌC VÀ THIẾT BỊ - DỤNG CỤ PHÒNG THÍNGHIỆM VI SINH VẬT

1.1.An toàn phòng thí nghiệm vi sinh vật học

1.1.1 Các cấp độ an toàn của phòng thí nghiệm vi sinh vật (mô tả vắn tắt)

Phòng thí nghi m an toàn c p 1 (Biosafety Level 1_BSL-1):ệấ là phòng thí nghiệm sinh học được trang b máy móc thi t bị ệ ị ở mức cơ bản đểphụ ụ giảc v ng d y trung hạ ọc,đạ ọi h c Trong ó, cácđ đố ượit ng vi sinh vậtđược thườ đượng c biết trước và an toàn.Điều kiện thực hành thường khôngđược trang bị cấp c u, thứ ường có b n r a và t y t ồ ử ủ ế

Phòng thí nghi m an toàn sinh hệọc c p 2 (Biosafety Level 2_BSL-2):ấ được trang tr máy mócị thiết bị ởmức cơ ản đểb phục vụ ảng dgi ạy đạ ọi h c và nghiên c u Trang bứ ị ảo v cá nhânb ệ được t ng că ường chẳng hạn như t m chắn tia nấ ước, bảo vệ mặt, áo choàng và g ăng tayđể giảm nguy cơnhiễm vi sinh v t qua khí dung, gi t b n ho c ti p xúc tr c ti p qua da Ngoài ra,ậ ọ ắ ặ ế ự ế phòng thí nghiệm đượ ắp đặ ồc l t b n r a tay và xử ử lý chất thải để giảm ô nhiễm môi trường.

Phòng thí nghi m an toàn sinh h c c p 3 (Biosafety Level 3_BSL-3):ệọ ấ được lắp đặt trang thi t bế ị phù h p cho vi c chợ ệ ẩn đoán, nghiên cứu các vi sinh vật gây bệnh trong iều ki n phòng ngđ ệ ừa an toàn sinh h c nh : qu n áo b o họ ư ầ ả ộ đặc bi t làm vi c trong phòng có hệ ệ ệ thống ki m soát thôngể tin và lu ng không khí theo áp su t âmồ ấ đểtránh vi sinh v t gây bậ ệnh thoát khỏi vòng thí nghiệm Các phòng cònđược ng n cách qua nhi u l p phòng khác nhau.ă ề ớ Điều này giúp giảm thiểu mức độnhiễm qua khí dung, giọt bắn…

Phòng thí nghi m an toàn sinh h c c p 4 (Biosafety Level 4_BSL-4):ệọ ấ được lắp đặt trang thi t bế ị phù h p cho vi c chuợ ệ ẩn đoán, nghiên c u vi sinh v t nguy hi m có tính truy n nhi m cao (HIV,ứ ậ ể ề ễ Covid-19, Ebola,…).

1.1.2 Quy tắc an toàn của phòng thí nghiệm Vi sinh vật học mức độ an toàn cấp 1

- Khi làm vi c trong phòng thí nghiệ ệm vi sinh vật học phải tuyệtđối giữ vệ sinh, tôn tr ng tínhọ ngăn n p và tr t tắ ậ ự của phòng thí nghiệm.

- M i cá nhân hoỗ ặc m i nhóm làm viỗ ệc độc l p, chậ ỉ được sử dụng các d ng c , trang thiụ ụ ết bị của nhóm, n u thi u ph i h i cán bế ế ả ỏ ộ phụtrách ho c giáo viên ph trách khôngặ ụ đượ ực t ý sử dụng c a ngủ ười khác.

- Khôngăn u ng, hút thu c trong phòng thí nghiố ố ệm VSV.

- M c áo blouse, eo kh u trang trong thặ đ ẩ ời gian thực hành Giặt áo blouse trong x phòng và javel sau m i bu i th c hành.ỗ ổ ự

- Không dùng mi ng hút bệ ằngống hút (pipette)để định lượng VSV hay hóa chấ mà phải dùng quả bóp cao su khi thao tác hút bằngống hút.

2Thực hành vi sinh vật học

Trang 3

- H p Petriộ đã đổmôi trường ho c sau nuôi c y VSV, không mặ ấ ởnắp, dùng tay để s và dùng mũiờ để ngửi.

- Khi l tay làmỡ đổVSV ra nơi làm việc, dùng khăn hay gi y t m c n 70%ấ ẩ ồ đểlau và lau s ch l iạ ạ bằng kh n hay gi y t m c n 70% khác.ă ấ ẩ ồ

- Khi sử dụng que cấy đểgieo c y VSV c n phấ ầ ải được kh trùng b ng cáchử ằ đốt trên ng n l aọ ử đèn c n tránh vương vãi ra xung quanh.ồ

- Trước và sau khi thao tác trên VSV cần lau tay kỹ bằng cồn 70% Khi thực hiện thao tác này cần phải tránh xa ngọ ửn l ađèn c n khi tay cònồ ướt.

- C n ghi chú tên chầ ủng VSV và ngày tháng thí nghiệm lên các d ng cụ ụ chứa mô trường nuôi cấy VSV.

- T t c các ch t th i và môi trấ ả ấ ả ường ch a ho c nhi m VSV cứ ặ ễ ần được h p kh trùng trấ ử ước khi đemđổ vào thùng rác Các dụng cụ nhiễm VSV cầ đượn c ngâm trong dung dịch sát khuẩn trước khi rửa.

- Khôngđổ thạch vào b n r a và ng thoát nồ ử ố ước.

- Sau khi làm vi c xong, ph i v sinh n i làm vi c c a mình, v sinh các d ng c máy móc, d ngệ ả ệ ơ ệ ủ ệ ụ ụ ụ cụ thí nghi m R a tay sệ ử ạch và sát trùng bằng c n trước khi ra kh i phòng.ồ ỏ

1.2 Các d ng cụụ thường dùng trong phòng thí nghiệm Vi sinh vật học mức độ an toàn cấp 1(trình bày theo thực tế được được h c và th c hành trên lọựớp):

Dụng cụ bằng th y tinh:ủ

Ống nghiệm (test tubes): được dùngđể chứa môi trường nuôi c y và nuôi VSV Môi trấ ường có thể ở ạng l ng hay rd ỏ ắn Miệngống nghi m có thể được đậy b ng nút bông không th m nệ ằ ấ ước, bằng silicon, gi y nhôm hay n p v n Trong trấ ắ ặ ường h p nuôi cấy VSV, ngườợ i ta thường sử dụng nút bông thay cho nắp v n Khi phân tích VSV thườặ ng sử d ngống nghi m có n p v n để hạnụ ệ ắ ặ ch viế ệc thoát h i nơ ước làm sai l ch th tích trong ng nghi m pha loãng b c 10.ệ ể ố ệ ậ

Đĩa Petri (Petri dishes): Gồm nắp lớn đậy lên n p nhỏ có hình tròn, đường kính 6, 8, 10, 12 cm.ắ Đĩa Petriđược gói lại bằng gi y trấ ước khi em h p kh trùng b ng nhiđ ấ ử ằ ệt ẩm hay sấy bằng nhiệt khô Hiện nay, trên thị trường có các loại đĩa Petri bằng nhựa vô trùng bán s n, r t ti n l i vàẵ ấ ệ ợ thườngđược sử ụng trong phòng phân tích VSV Khác với đĩa thuỷ tinh có thể tái sử dụngd nhiều lần,đĩa nhựa được chế ạo để sử ụng 1 l n.t d ầ

Bình tam giác (erlenmeyers): cònđược g i là bình nón dùngọ để chứa môi trường nuôi c y (lòngấ hay r n) hay dung môi, hóa chắ ất trong pha chế môi trường.

Đèn cồn (Alcohol bunners): là loại đènđược được đốt b ng cằ ồn 90°, toà nhiệt tạo ra một vùng không gian xung quanh vô trùng.Đèn c n còn có thồ ể được dùngđể khửtrùng các lo i que c yạ ấ bằng cách hơ hayđốt trên ng n lọ ửa đèn c n.ồ

Trang 4

Phiến kính (lame) và lá kính (lamelle): Phiến kính là miếng thuỷ tinh hình chữ nhật, có độ trong

suốt cao, dày 2 mm dùng ểchứa gi t VSVọ ở ạng thái s ng hay nhutr ố ộm màu khi quan sát chúng bằng kính hi n vi.ể

Lá kính là mi ng th y tinh hình vuông, cóế ủ độtrong suốt cao dày 0,1-0,2 mm dùng để đậy lên gi tọ VSV trên phi n kínhế đểquan sát tr ng thái s ng c a t bào VSV.ạ ố ủ ế

Phiến kính lõm: Phiến kính lõmđượ ấc c u tạo bằng th y tinh, trong su t, phủ ố ả giữa được khoét sâu hình c u lõm Khi sầ ử dụng phi n kính này phế ải kết h p với lá kín hoặc phiến kính Phiến kínhợ lõmđược sử dụng trong tiêu bản phòng ẩm.

Phiến kính và lá kính khi mới mua về cầnđược làm s ch b ng cách ngâm tron NaOH 10% trongạ ằ 10 phút, r a b ng nử ằ ước, r a b ng HCl 20% và sau cùng r a s ch b ng nử ằ ử ạ ằ ước Phi n kính ã sế đ ử dụngđể quan sát đểnhuộm màu cần đượ ửc s lý b ng các ngâm trong dung dằ ịch sulfochromate (100 g H2SO4 dd, 50 g K2Cr2O7 và 1000 ml nướ cất) trước khi r a s ch b ng nử ạ ằ ước và tráng lại bằng nướ ấc c t Sau khi quan sát Vsy trạng thái s ng, lá kính cố ầnđượ ử ạc r a l i bằng nướ ửc r a chén hay xà phòng, làm khô và ngâm trong cồn 96%.

Các lo i d ng cạ ụụ thuỷtinh khác: các lo i c c thu tinh (becher),ạ ố ỷ ốngđong, hút

Các lo i que cạấy.

Que c y thấẳng: dùng để cấy đâm sâu trong ng nghi m thố ệ ạchđứng.

Que c y vòng:ấ dùng cấy ria trên mặt th ch hay phân lạ ập VSV trên bề mặt thạch hoặc cấy chuyền trên môi trường l ng.ỏ

Que c y móc:ấ dùngđể cấy các lo i n m m c Que c y móc Que trang (tr i): dùngạ ấ ố ấ ả để trải gi tọ sinh kh i VSV trên bố ề mặt thạch.

Que trang (trải): dùngđể trải gi t sinh kh i VSV trên bọ ố ề mặt mạch.

Là loại ống hút máy, cóđộchính xácđến µL (tu theo lo i) dùngỳ ạ để định lượng m t thộ ể tích chính xác dung dịch VSV, môi trường nuôi c y (lòng) hay dung dịch hóa ch t Micropipetteấ ấ (pipetman) có nhi u lo i, m i loề ạ ỗ ại đều có d i gi i h n dung tích, nh : 0,110,0 µL; 1 – 20 µL; 20 –ả ớ ạ ư 200 µL; 100 – 1000 µL; 1000 – 5000 µL và 1000 – 10.000 µL (1000 µL = 1 mL) Tùy theo hãng sản xuất mà quy cách dung tích có thayđổi Trong dải dung tích cho phép, người ta có thể điều chỉnh dung tích chính xác nh mong mu n M i lo i micropipetteư ố ỗ ạ đều có loại đầu tip tương ứng.

Cần b m c a micropipette có hai nơ ủ ấc nên khi sử dụng c n lưu ý: (1) nhấn nấc 1 tầ ươngứng v iớ dung tíchđược ch n khi hút d ch; (2) nh n n c hai n vọ ị ấ ấ ấ ượt quá n c 1ấ để đuổi h t d ch còn maoế ị quản ở đầu tip; (3) Không dùng micropipetteđểhút các lo i hóa ch t d bay h i, nh : axetic,ạ ấ ễ ơ ư HCl…

1.3 Các thiết bị thường dùng trong phòng thí nghiệm trong phòng thí nghiệm Vi sinhvật học mức độ an toàn cấp 1 (trình bày theo thực tế được được học và thực hànhtrên lớp)

Trang 5

của thiết bị thực tế được sử dụng.

Cân (lab scale):Thường sử dụng lo i cân kạ ỹ thuật (lo i 2 số lẻ) có độ chính xác đếạ 0,01 g Khi cầ xácđịnh m t lộ ượng chính xác, người ta dùng cân phân tích (loại 4 số lẻ) cóđộchính xãđến 0,0001 g (0,1 mg) Cân c n phầ ải được đặt trên bề mặt ph ng, tránh gió lùa, không bẳ ị rung lắc.

Tủ cấy an toàn sinh học (Biosafety cabinet)

Tủ cấy an toàn sinh học hay cònđược gọi là tủ cấy vô trùng,được dùngđể b o tính vô trùngả khi thao tác v i VSV Luớ ồng khí áp suất dương trong tủ c y vô trấ được lọc bằng màng thô và màng l c tinh 0,2 µm Trong tọ ủ cóđèn UV (Ultra Violet khử trùng môi trường không khí và bề mặt trong tủ cấy Trước khi th c hiện, bật UV từ 15 - 60 phút, bên ngoài tủ phảự iđược che l iạ bằng màn t i màu.ố

Nồi hấp (autoclave)

Nồi h p kh trùng là thi t bấ ử ế ị bắt bu c ph i có trong PTN vi sinh cho phép tiêu tộ ả ất cả các d ngạ sống c a VSV (t bào sinh dủ ế ưỡng, bào t ) N i h p có c u t o 2 l p nên có khử ồ ấ ấ ạ ớ ả năng chịu được áp su t cao Bu ng kh trùng có g n valve thoát khí, áp nhiấ ồ ử ắ ệ ết k Nguồn: Hướng dẫn sử d ngụ nồi h p vô trùng ES-215, ES-315, Tomy Se Hình 1.19 Nấ ồi h p kh trùng Khi sấ ử ử dụng nên dùng nước c t hay nấ ước vô khoáng châm vào n i, tránh b c n Nồ ặ ước phải được châmđến m c quyứ định.

Kính hi n vi quang hểọc (optical microscope): là hệ thống dùng để phóngđại hình nh VSV.

Thườngđộ phóngđại c a kính hi n vi quang hủ ể ọc có thể từ vài chục l n đếầ n 1000 l n.ầ

Lò vi ba

Lò vi ba hay còn gọi là lò vi sóngđượ ử dụng trong các phòng thí nghiệm vi sinh vật cho việcc s nấu môi trường nuôi c y có ch a agar khi cấ ứ ần phân chia vào các vật ch a khác nhau.ứ 1.4.Chuẩn bị dụng cụ, thiết bị và hóa chất (theo thực tế trên lớp)

Dụng cụ:

- Ống nghiệm, ống nghiệm có nắp, hộp Petri, bình tam giác 250mL, bình tam giác nút mài 250 mL, pipette 1 và 10 mL, ống hút nhỏ giọt, cốc thủy tinh 100, 250, 500, 1000 mL, đầu típ 1000 µL, lá kính, phiến kính, giấy lau kính, bao tay cao su, bình tia, đèn cồn, kẹp vi sinh, giá để ống nghiệm, rổ đựng dụng cụ.

Thiết bị:

- Tủ an toàn sinh học, tủ ấm, tủ sấy, tủ lạnh, tủ lạnh âm sâu -40 °C, kính hiển vi quang học, máy lắc, lò vi ba, cân kỹ thuật, nồi hấp khử trùng.

Hoá chất:

Dầu soi kính, dầu lau kính Xylene, dung dịch xanh methylen, lugol, safranin, methyl violtet, bông không thấm nước, bông thấm nước, cồn 96%, giấy nhôm, nấm men bánh mì, men tiêu hóa ( chứa Bacillus subtilis), nước rửa chén, giấy bao gói, thin cột, túi chịu nhiệt (PP_polypropilene).

Trang 6

1.2.Thực hành (theo thực tế thực hành)

1.2.1 Chuẩn bị dung dịch cồn 70% từ cồn 96%

Yêu cầu nội dung trình bày tối thiểu: mục đích sử dụng, cách chuẩn bị.

Tính toán số lượng ml dung dịch cồn 96 độ để hòa tan thành cồn 70 độ bằng cách áp dụng công thức: (70x 100ml)/99 = 72,9ml Như vậy ta cần 72,9ml dung dịch cồn tinh khiết 96% và thêm vào 27.1ml nước cất Ta được tổng là 100ml cồn 70 độ

1.2.2 Sát khuẩn khu vực làm việc trước và sau khi tiến hành thí nghiệm (viết sơ đồvắn tắt các bước thực hiện)

Trước thí nghiệm:

Lấy bông b ng cho m t ít c n vào, sau ó lau s ch trên bă ộ ồ đ ạ ề mặt m t bàn; lau cặ ả những d ng cụ ụ cần thiết để tiến hành thí nghiệm.

- Thao tác đĩa Petri:

+ Mở bao giấy gói các hộp petri.

+ Tay phải cầm dụng cụ (bình tam giác) chứa môi trường + Tay trái lấy nút bông ra và hơ miệng bình trên ngọn đèn cồn.

+ Nghiêng bình và rót nhẹ một chút môi trường vào đĩa petri sau khi tay trái mở hé nắp trên của hộp.

+ Đậy nắp trên lại, xoay tròn hộp petri để môi trường được phân phối đều trên mặt đĩa + Để yên cho môi trường nguội và đông đặc.

+Lật ngược hộp petri để hơi nước bốc ra và khô dần đi - Thao cầm ống nghiệm khi cấy vi sinh hoặc cấy chuyền:

+ Dán nhãn ghi Tên giống vi sinh vật, Ngày cấy vào thành ống nghiệm, dưới nút bông một chút.

+ Tay trái cầm 2 ống nghiệm: 1 ống giống, 1 ống môi trường Tay phải cầm que cấy và khử trùng trên ngọn đèn cồn cho đến khi nóng đỏ dây cấy Dùng ngón út và ngón áp út kẹp nút bông vào lòng bàn tay xoay nhẹ, kéo nút ống giống ra Hơ nóng để khử trùng không khí ở miệng 2 ống nghiệm

Trang 7

- Thao cầm ống nghiệm khi cấy vi sinh hoặc cấy chuyền:

+ Đợi khi que cấy vừa nguội, khéo léo đưa que cấy tiếp xúc với khuẩn lạc trong ống giống Rút que cấy ra, không để que cấy chạm vào thành ống nghiệm và đưa ống vào môi trường để thực hiện các thao tác cấy truyền Khử trùng lại phần không khí nơi miệng 2 ống nghiệm rồi đậy nút bông Khử trùng lại que cấy sau khi đã sử dụng xong

- Sử dụng pipetman (xem yêu cầu trong phần hướng dẫn sử dụng thiết bị): + Cầm pipet ở tư thế thẳng đứng

+ Ấn tới nấc dừng thứ nhất Nhúng đầu tip pipet khoảng 3 – 4mm vào dung dịch +Từ từ thả pittông ra

+ Để cho mẫu, ấn tới nấc dừng thứ nhất

+ Chuyển tất cả phần còn lại của chất lỏng ở đầu tip pipet ra Sau đó, ấn tới nấc dừng thứ hai để phụt hết dung dịch ra khỏi pipt tip.

- Sử dụng pipetman (xem yêu cầu trong phần hướng dẫn sử dụng thiết bị):

1.2.4 Thao tác bao gói dụng cụ (viết sơ đồ vắn tắt các bước thực hiện):

Yêu cầu nội dung trình bày với từng loại dụng cụ: (1) mục đích của việc bao gói dụng cụ; cách thực hiện; và hình ảnhthực tế sau làm nút bông, bao gói…

- Bao giấy đĩa Petri:

Bảng 1.1 Hình kết qủa bao gói của từng sinh viên trong nhóm

Trang 8

- Làm nút bông ống nghiệm, bình tam giác:

Bảng 1.2 Hình kết qủa làm nút bông của từng sinh viên trong nhóm

Trang 9

Trang 10

- Bao gói giấy nắp ống nghiệm, bình tam giác:

Bảng 1.3 Hình kết qủa bao giấy nắp ống nghiệm/bình tam giác của từng sinh viên trong nhóm

Trang 11

1.2.5 Cách sử dụng pipetman và một số thiết bị trong phòng thí nghiệm Vi sinh vậtmức độ an toàn cấp 1(theo tình hình thực tế thiết bị của phòng thực hành)

Yêu cầu nội dung trình bày với pipetman và một số thiết bị trong phòng thí nghiệm Vi sinh vật mức độ an toàn cấp 1:(1) mục đích của việc sử dụng; kiểm tra thiết bị trước khi sử dụng; cách sử dụng thiết bị; vệ sinh và kiểm tra thiết bịsau khi sử dụng.

Nồi hấp khử trùng (Autoclave):

Bước 1: Mỡ nắp nồi hấp và lấy hai cái giỏ inox ra.

Bước 2: Cho nước cất (hoặc vô khoáng) vào nồi hấp sao cho ngập đầu cảm ứng mực nước

(mực nước bằng với tấm đỡ inox ở đáy nồi) khoảng 2 cm.

Trang 12

Bước 3: Cho các dụng cụ và môi trường vào các giỏ Sau đó, cho giỏ inox vào nồi.Bước 4: Kiểm tra ống xả khí phải chìm trong mực nước của bình nhựa chứa nước và khóa

valve xả đáy, valve xả khí (nếu có).

Bước 5: Bật cầu giao điện ở bên hông, cài đặt thông số 121 °C, 15 phút.

Bước 6: Sau khi hấp xong, đèn báo Complete chớp chớp màu đỏ, thì mở nồi hấp ra, chờ

vài phút cho bớt nóng và lấy dụng cụ và môi trường ra 1.

Cảnh báo: chỉ mỡ nắp nồi hấp khi đồng hồ áp suất chỉ về 0 kg/cm², nhiệt độ giấu dưới

Bước 7: Tắt nguồn điện, chờ nồi hấp nguội, xả nước và vệ sinh buồng hấp sau khi sử dụng

Kính hiển vi quang học:

Bước 1: Gi i thi u vớ ệ ề cấu t o và chạ ức n ng că ủa các bộ phận trên kính hiển vi quang h cọ Bước 2: C p nguấ ồn điện cho kính,đ ều đình ngu n sáng,i ồ điều ch nh v phù h p v i ngỉ ị ợ ớ ười quan sát trí kính cho

Bước 3:Đặt tiêu b n lên bàn mả ẫu, dùng ốc di chuyển mẫu v t di chuyển phi n kính đến vùngậ ế muốn quan sát sao cho v trí m u quan sát n m ngay chùm sáng xuyên qua tị ẫ ằ ụ quang Bước 4; Hạ tụ quang (quan sát VSV trạng thái sống),đóng b t ch n sáng, quan sátớ ắ ở vật kính 10X, dùng cố chỉnh thô nâng bàn mang v t m u ch m t i v t kính,ậ ẫ ạ ớ ậ đặt m t vào quan sát, dùng c ch nh thôắ ố ỉ hạ bàn m u xu ng choẫ ố đến khi thấy ảnh VSV r i dùng nút ch nh tinh v n nhồ ỉ ặ ẹ đểxem rõ nhả VSV.

Bước 5:Đểquan sát nh cóả độ phóngđạ ới l n h n, chuy n sang v t kính 40X vàơ ể ậ điều chỉnh cố chỉnh tinhđể tìmảnh rõ Bước 6 Ghi nh n hìnhậ ảnh vàđặcđi m vi sinh vật Bể ước 7 Sau khi quan sát, lau sạch bàn mang v t và vệ sinhđầu v t kính b ng gi y th m d u xylene Bậ ậ ằ ấ ấ ầ ước 8 T tắ nguồn điện, chùm bao bảo vệ và trả lại cho nhân viên phòng thí nghiệm.

Cân kỹ thuật:

Bước 1: Đặt miếng giấy cân lên cân, sau đó đặt nhẹ nhàng mẫu vật lên cân

Bước 2: Trong lúc thực hiện, cần chú ý không được làm những thao tác khuấy, gõ lên vật mẫu

Bước 3: Sau khi cân đã ổn định thì đọc ngay kết quả, như vậy sẽ có kết quả chính xác Bước 4: Sau khi cân xong làm sạch mặt cân, khi vệ sinh cần tắt và lấy bàn cân khỏi đế đỡ mặt bàn cân Sử dụng cọ ngắn với ống hút chân không để vệ sinh cân an toàn.

Lưu ý: Không cân những vật có trọng luợng quá mức của cân, tuyệt đối không đặt mẫu vật

lỏng và bột trực tiếp lên đĩa cân Không dùng những vật cứng, sắt nhọn để lau chùi bụi

Trang 13

bám ở khe đế Đặc biệt khi dời hay di chuyển cân cần phải kiểm tra kỹ lưỡng độ thăng bằng của mặt cân.

Lò vi sóng:

Bước 1: Mở nắp lò, lấy đĩa đặt dưới vĩ nướngBước 2: Đặt mẫu vào bàn xoay

Bước 3: Điều chỉnh chế độ sấy

Bước 4: Phụ thuộc vào mẫu và lượng mẫu cần sấy để điều chỉnh thời gian sấy cho phù hợpBước 5: Lấy mẫu ra

Bước 6: Vệ sinh lòPipetman:

Bước 1: Cầm micropipette ở tư thế thẳng đứng, móc treo trên ngón trỏ, mặt hiển thị số dung tích hướng về phía người sử dụng.

Bước 2: Dùng micropipette cắm vào đầu típ tương ứng.

Bước 3: Ấn nút nhấn đến nấc thứ nhất thì dừng lại, đặt đầu típ chìm vào 3-4mm dung dịch Bước 4: Nhả nút nhấn ra từ từ để pittong hút dịch lên đầu típ

Bước 5: Nhấc đầu típ ra khỏi dung dịch, quan sát có bọt khí hay không( nếu có thì đẩy dịch ra và hút lại) và chờ vài giây không có giọt dư đầu tip thì chuyển qua dụng cụ cần chứa Bước 6: Hạ đầu tip xuống và nhấn nút đẩy dịch ra vật cần chứa đến nấc thứ nhất, khi dịch bị đẩy hết thì mới nhấn nút sang nấc thứ hai để đẩy hết dịch còn mao dẫn trên đầu tip.

1.3.Trả lời câu hỏi

Câu 1 Tại sao cần phải giữ an toàn sinh trong các hoạt động tại phòng thí nghiệm vi sinhvật?

- Phòng thí nghiệm là nơi tiềm ẩn nhiều rủi ro do tiếp xúc với vật liệu ăn mòn và độc hại, dung môi dễ cháy, khí độc, hóa chất dễ nổ hay vi sinh vật nguy hiểm Vì vậy nên luôn cần sự cẩn thận và tuân thủ các hướng dẫn an toàn theo quy định sẽ giúp tránh các rủi ro trong phòng thí nghiệm.

Câu 2 Phòng thí nghiệm vi sinh vật dùng cho buổi thực hành (theo thực tế) thuộc cấp độan toàn cấp mấy? Giải thích

- Phòng thí nghiệm vi sinh vật dùng cho buổi thực hành thuộc mức độ an toàn cấp 1

- Bởi vì ở hòng thí nghiệm được trang bị máy móc thiết bị ở mức độ cơ bản,

điều kiện thực thực hành không được trang bị cấp cứu, thường có bồn rửa và tủ y tế.

Câu 3 Tại sao sử dụng cồn 70% mà không phải cồn có nồng độ cao hơn (ví dụ như cồn96%) để sát khuẩn bàn tay, khu vực thí nghiệm với vi sinh vật trước và sau khi thí nghiệm?

- Bởi vì cồn 70 độ cho tác dụng diệt khuẩn tốt hơn 96 độ Bởi vì cồn 96 độ vừa thoa lên tay đã bay hơi rất nhanh, không đủ thời gian, không đủ thời gian tồn tại trên tay để diệt vi khuẩn Còn những loại cồn dưới 60 độ lại không đảm bảo để sát khuẩn Cồn 70 độ là độ cồn có tốc độ bốc hơi chậm hơn, vừa đủ thời gian để tiêu diệt vi khuẩn và không làm khô da tay khi sát khuẩn.

Câu 4 Tại sao sử dụng bông không thấm nước để làm nút bông ống nghiệm và bình tamgiác dùng để nuôi cấy vi sinh vật? Trong trường hợp không có bông không thấm nước, đềxuất giải pháp thay thế phù hợp.

- Sử dụng bông không thấm nước để làm nút bông ống nghiệm và bình tam giác vì bông không thấm nước có tác dụng ngăn nhiễm vi sinh vật từ ngoài vào môi trường

Trang 14

trước và sau khi cấy vi sinh vật, không bị thấm nước trong quá trình thao tác sau khi hấp khử trùng.

- Trong trường hợp không có bông thấm nước, giải pháp thay thế phù hợp là nắp silicon.

Câu 5 Tại sao sử dụng giấy báo để bao góidụng cụ thí nghiệm như đĩa petri, ốngnghiệm…?Trong trường hợp không có giấy báo để bao gói, đề xuất giải pháp thay thế phùhợp.

- Sử dụng giấy báo để bao gói dụng cụ thí nghiệm như đĩa petri, ống nghiệm, Vì giấy báo ngăn ngừa vi sinh vật nhiễm vào môi trường trước và sau khi cấy để tránh vỡ dụng cụ bằng thủy tinh trong quá trình thao tác, không bị rách trong quá trình hấp lần đầu Trong trường hợp không có giấy báo để bao gói, đề xuất giải pháp thay thế phù hợp là giấy bạc.

Câu 6 Tại sao phải khử trùng dụng cụ thí nghiệm đã được làm nút bông và bao gói (ví dụnhư ống nghiệm thuỷ tinh, bình tam giác thuỷ tinh, đĩa petri thuỷ tinh…) trước khi sử dụngđể nuôi cấy vi sinh vật? Nêu phương pháp được thực hành để khử trùng các dụng cụ này.Trong trường hợp không muốn sử dụng phương pháp đó, hãy đề xuất phương pháp thaythế phù hợp?

- Phải khử trùng dụng cụ thí nghiệm đã được làm nút bông và bao gói trước khi sử

dụng vì trước nuôi cấy phải rửa hấp khử trùng để tạo không gian vô trùng tiêu diệt VSV xung quanh thành dụng cụ giúp kết quả nuôi cấy không bị nhiễm VSV không mong muốn.

Câu 7 Tại sao người ta thường áp dụng khử trùng dụng cụ và môi trường nuôi cấy vi sinhtrong nồi hấp cao áp mà không sử dụng phương pháp khử trùng khác?

- Vì khi khử trùng trong nồi hấp cao áp dễ kiểm soát và theo dõi hơn, đồng thời không độc hại không ăn mòn dụng cụ kim loại, dễ điều khiển và khả năng diệt khuẩn nhanh chóng.

Câu 8 Làm thế nào để nhận biết các dụng cụ đã được hấp khử trùng (tiêu diệt hết tất cảcác dạng vi sinh vật)?

– Dụng cụ sau khi hấp khử trùng sẽ không còn sự có mặt của bất cứ loại vi sinh vật nào Băng dính vặt( dán ở bên ngoài các ống nghiệm hay dụng cụ thí nghiệm chuyển màu rõ ràng, tất cả các dụng cụ đã được bao gói và sau khi hấp khử trùng thì không bị rách.

Trang 15

BÀI 2 KỸ THUẬT PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT2.1 Cơ sở lý thuyết chung

2.1.1 Khái niệm môi trường

Môitrường nuôi c y (môi trấ ường dinh dưỡng)(là h n h p các cỗ ợ ơ chất dinh dưỡngđược pha chế nhân t o nhạ ằm đápứng cho nhu c u sinh trầ ưởng, phát tri n và sinh s n s các s n ph mể ả ử ả ẩ traođổi ch t c a vi sinh v t (VSV) Môi trấ ủ ậ ường dinh dưỡng dùng trong nghiên cứu vi sinh vật và trong quá trình s n xu t các s n ph m c a vi sinh v t Môi trả ấ ả ẩ ủ ậ ường dinh dưỡng là y u tế ố quan trọng trong công nghiệp lên men, công nghiệp sinh tổng hợp nhờ vi sinh vật.

2.1.2 Phân loại môi trường

Môi trường lỏng (liquid media) Môi trường lỏng không chứa chất làm đặc môi trường như: agar, gelatin Môi trường lỏng thường dùng để hoạt hóa, tăng sinh, thử nghiệm sinh hóa, nhân giống thứ cấp, lên men của VSV Ví dụ: Môi trường cao malt lên men bia (lên men chìm), môi trường MRS nuôi cấy vi khuẩn lactic.

Môi trường rắn (solid media) Ngoài các thành phần dinh dưỡng, môi trường rắn là môi trường có thêm thành phần làm đặc (agar, gelatin ) Người ta thường dùng loại môi trường này để phân lập VSV, quan sát khuẩn lạc, định lượng VSV (trong phân tích các chỉ tiêu tổng số vi khuẩn hiếu khí, tổng số nấm men-nấm mốc ) hay nghiên cứu những đặc tính khác của VSV Trong nuôi cấy vi sinh vật thường dùng chất làm đặc là agar với hàm lượng là 15 - 20 g/L Ví dụ: Môi trường thạch Hansen, thạch PGA nuôi cấy nấm men, thạch cao thịt- pepton nuôi cấy vi khuẩn.

Môi trường bán rắn (semi-solid media) Giống như môi trường rắn, nhưng môi trường bán rắn có hàm lượng chất làm đặc ít hơn nên cấu trúc của môi trường mềm và xốp hơn Người ta thường dùng nó trong việc xác định khả năng di động của VSV Môi trường bán rắn thường có hàm lượng agar là 10-12 g/L Ngoài ra, trong công nghệ lên men cũng có loại môi trường bán rắn (dạng sệt) để lên men bề mặt nấm mốc nhưng không có agar mà cấu trúc bán rắn là do hạt ngũ cốc hoặc cám trấu tạo ra Ví dụ: Môi trường thạch mềm Oxford xác định khả năng di động của Listeria monocytogenes

Môi trường lên men rắn (solid state media) Đây là loại môi trường được bổ sung các phế phụ phẩm nông nghiệp như cảm ngô mành, khoai mì nhằm làm giảm chi phí môi trường Các loại môi trường này ở trạng thái rắn nhưng không cần bổ sung agar vào môi trường Các môi trường thường dùng khi nuôi cấy vi sinh vật trên qui mô công nghiệp

2.2 Chuẩn bị dụng cụ, thiết bị và hóa chất (theo thực tế trên lớp)

- Dụng cụ: Ông nghiệm, ống nghiệm có nắp, hộp Petri, bình tam giác 250mL, bình tam giác nút mài 250 mL, pipette 1 và 10 mL, ống hút nhỏ giọt, cốc thủy tinh 100, 250, 500, 1000 mL, bao tay cao su, bình tia, đèn cồn, kẹp vi sinh, giá để ống