Báo Cáo Thực Hành Vi Sinh Vật Học Và Công Nghệ Sinh Học.pdf

Thực hiện đổ môi trường nuôi cấy vào hộp lồng dưới ngọn lửa đèn cồn.. Dùng que trang để trang đều dung dịch mẫu lên trên bề mặt môi trường nuôi cấy.. - Bước 1: Cầm ống nghiệm chứa VSV gi

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI

KHOA SINH HỌC

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH

VI SINH VẬT HỌC VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn: PGS.TS Trần Thị Thúy

Họ và tên các thành viên trong nhóm:

1 Lê Trâm Anh - 715301003

2 Đặng Ngọc Anh - 715301021

3 Phạm Gia Hiển - 715301077

Lớp: K71A – ST2 – Nhóm 5

Năm học: 2023-2024

BÀI 1-2: MÔI TRƯỜNG - PHÂN LẬP – NUÔI CẤY

VI SINH VẬT

ĐIỂM BÁO CÁO THỰC HÀNH

(theo nhóm): NHẬN XÉT CỦA GVHD

1 Chuẩn bị môi trường, dụng cụ cho phân lập:

- Môi trường phân lập (Ghi rõ tên và thành phần môi trường, g/L) :

+ Môi trường 1: Môi trường MPA (phân lập và nuôi cấy vi khuẩn)

STT Tên thành phần Trọng lượng Trong 250ml

+ Môi trường 2: Môi trường Hanxen (phân lập và nuôi cấy nấm men)

STT Tên thành phần Trọng lượng Trong 250ml

+ Môi trường 3: Môi trường Gauze 1 (phân lập và nuôi cấy xạ khuẩn)

STT Tên thành phần Trọng lượng Trong 250ml

+ Môi trường 4: Môi trường Czapek

STT Tên thành phần Trọng lượng Trong 250ml

+ Bình tam giác

+ Cân và giấy cân

+ Cốc và ống nghiệm đựng môi trường có nút bông

+ Đũa thủy tinh, phễu thủy tinh

+ Lò vi sóng.

- Mẫu phân lập: mẫu nước ở bể cá khoa Sinh

2 Các bước trong tiến trình phân lập vi sinh vật

- Mẫu VSV: mẫu nước ở bể cá khoa Sinh

+ Bước 1: Khử trùng khu vực làm việc bằng cồn Sau đó châm đèn cồn.

Thực hiện đổ môi trường nuôi cấy vào hộp lồng dưới ngọn lửa đèn cồn

+ Bước 2: Lật ngược hộp lồng, ghi tên môi trường nuôi cấy

+ Bước 3: Đổ môi trường nuôi cấy đã được chuẩn bị từ Bài 2 vào hộp

lồng Đậy nắp hộp lồng ngay sau khi đổ

+ Bước 4: Lấy 0,5ml nước, cho vào bình tam giác chứa 49,5ml nước

cất vô trùng Lắc đều cho tan Thu được dung dịch pha loãng10 −2 lần

+ Bước 5: Lấy từ trong bình tam giác 1ml dung dịch, pha loãng vào ống

nghiệm chứa 9ml nước cất vô trùng, thu được dung dịch pha loãng

10 −3 lần Dùng bút ghi lại nồng độ pha loãng lên ống nghiệm

+ Bước 6: Lấy 1ml từ 10ml dung dịch thu được từ Bước 5, pha loãng

vào ống nghiệm chứa 9ml nước cất vô trùng, thu được dung dịch pha loãng 10 −4 lần Dùng bút ghi lại nồng độ pha loãng lên ống nghiệm

+ Bước 7: Lấy 1ml từ 10ml dung dịch thu được từ Bước 6, pha loãng

vào ống nghiệm chứa 9ml nước cất vô trùng, thu được dung dịch pha loãng 10 −5 lần Dùng bút ghi lại nồng độ pha loãng lên ống nghiệm

+ Bước 8: Hút 0,1ml (1 - 2 giọt) dung dịch mẫu nồng độ 10 −5 cho vào hộp lồng nuôi cấy

+ Bước 9: Mở que trang đã được thanh trùng dưới ngọn lửa đèn cồn.

Dùng que trang để trang đều dung dịch mẫu lên trên bề mặt môi trường nuôi cấy

+ Bước 10: Lật ngược hộp lồng, ghi: Ngày nuôi cấy, người thực hiện,

nồng độ dung dịch mẫu

+ Bước 11: Nuôi cấy mẫu trong môi trường có nhiệt độ 30 - 37°C trong

3 - 5 ngày

3 Kết quả phân lập vi sinh vật:

3.1 Kết quả đếm khuẩn lạc (CFU/g mẫu)

Môi trường

Nhóm VSV

MPA Gause 1 Hansen Czapek Tổng số mỗi

loại VSV

Tổng số khuẩn

3.2 Tính toán tổng số VSV trong 1gr mẫu (Ghi rõ tên mẫu, độ pha loãng, thể tích trải trên mỗi đĩa) :

- Tổng số khuẩn lạc trong môi trường MPA:

N = 157 0,1×

10 −5 = 157 x 10 CFU/g4

- Tổng số khuẩn lạc trong môi trường Gause 1:

N = 47 × 0,1

10 −5 = 47 x 10 CFU/g4

- Tổng số khuẩn lạc trong môi trường Hansen:

N = 30 0,1×

10 −5 = 30 x 10 CFU/g4

- Tổng số khuẩn lạc trong môi trường Czapek:

N = 130 0,1×

10 −5 = 130 x 10 CFU/g4

3.3 Ảnh chụp các đĩa phân lập của nhóm.

- Môi trường MPA:

- Môi trường Gause I:

- Môi trường Hansen:

- Môi trường Czapek:

4 Cấy chuyển vi sinh vật:

4.1 Phương pháp cấy chấm điểm (Ghi rõ loại VSV, loại que cấy và kĩ thuật cấy)

Cấy chấm điểm cho nấm mốc xạ khuẩn

- Bước 1: Cầm ống nghiệm chứa VSV giữa ngón trỏ và ngón cái

của tay trái, đặt vị trí nằm ngang sao cho mặt môi trường chứa VSV mọc thì quay lên phía trên Tay phải cầm que cấy như cầm bút, khử trùng que cấy trên ngọn lửa đèn cồn

- Bước 2: Mở nút ống nghiệm bằng ngón út và áp út tay phải.

Giữ miệng ống nghiệm gần ngọn lửa đèn cồn

- Bước 3: Để que cấy có đầu hình móc đã nguội rồi lấy một ít

vsv ở ống chứa VSV

- Bước 4: Cấy chấm điểm VSV vào ống có môi trường mới.

- Bước 5: Hơ miệng ống nghiệm và nút bông trên ngọn lửa đèn

cồn

- Bước 6: Nút ống nghiệm lại.

- Bước 7: Khử trùng lại que cấy trên ngọn lửa đèn cồn.

4.2 Phương pháp cấy ziczag (Ghi rõ loại VSV, loại que cấy và kĩ thuật cấy)

Cấy ziczag cho vi khuẩn và nấm men

- Bước 1: Cầm ống nghiệm chứa VSV giữa ngón trỏ và ngón cái

của tay trái, đặt vị trí nằm ngang sao cho mặt môi trường chứa

VSV mọc thì quay lên phía trên Tay phải cầm que cấy như cầm bút, khử trùng que cấy trên ngọn lửa đèn cồn

- Bước 2: Mở nút ống nghiệm bằng ngón út và áp út tay phải Giữ

miệng ống nghiệm gần ngọn lửa đèn cồn

- Bước 3: Để que cấy có đầu hình tròn đã nguội rồi lấy một ít vsv

ở ống chứa VSV

- Bước 4: Cấy VSV theo đường ziczag vào ống có môi trường

mới

- Bước 5: Hơ miệng ống nghiệm và nút bông trên ngọn lửa đèn

cồn

- Bước 6: Nút ống nghiệm lại.

- Bước 7: Khử trùng lại que cấy trên ngọn lửa đèn cồn.

BÀI 4: QUAN SÁT HÌNH THÁI TẾ BÀO

VÀ ĐẾM SỐ LƯỢNG VI SINH VẬT

ĐIỂM BÁO CÁO THỰC

HÀNH (theo nhóm):

NHẬN XÉT CỦA GVHD

1 Quan sát VSV bằng phương pháp làm tiêu bản sống, nhuộm âm:

- Mẫu VSV quan sát: Nấm men - Mn7

- Các bước tiến trình làm tiêu bản sống, nhuộm âm:

+ Bước 1: Nhỏ 1 giọt thuốc nhuộm (tím gentian) lên lam kính + Bước 2: Khử trùng đầu que cấy, để que cấy nguội rồi lấy một ít

VSV ở ống chứa VSV

+ Bước 3: Dùng que cấy đưa vào giọt thuốc nhuộm một ít VSV + Bước 4: Trộn đều

+ Bước 5: Đậy lamen, không để thuốc nhuộm tràn lên trên

+ Bước 6: Giữ khoảng 1 - 2 phút Khi quan sát ở vật kính 100X, nhỏ

giọt dầu lên trên lamen, quan sát

- Kết quả quan sát (hình ảnh hoặc hình vẽ VSV quan sát được):

2 Quan sát VSV bằng phương pháp làm tiêu bản cố định, nhuộm đơn:

- Mẫu VSV quan sát:

+ Nấm men: Mn7

+ Vi khuẩn: Bacillus subtilis

- Các bước tiến trình làm tiêu bản cố định, nhuộm đơn:

+ Bước 1: Chuẩn bị giọt huyền phù (cho 1 loại VSV, trộn đều) + Bước 2: Cố định tiêu bản (để vi sinh vật khô tự nhiên hoặc đưa trên

ngọn lửa đèn cồn rồi để khô tự nhiên) Sau đó đưa qua ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần để cố định VSV

+ Bước 3: Nhuộm fuchsin hoặc tím gentian trong 1 phút (nhỏ trực

tiếp lên mẫu)

+ Bước 4: Rửa nhuộm: Rửa cho thuốc nhuộm trôi hết ra trên phiến

kính

+ Bước 5: Thấm khô tiêu bản Soi ở vật kính x10, x100 (nhỏ dầu

trước khi soi bằng vật kính 100x)

- Kết quả quan sát (hình ảnh hoặc hình vẽ VSV quan sát được):

+ Nấm men: Mn7

(Đặng Ngọc Anh) + Vi khuẩn: Bacillus subtilis

(Đặng Ngọc Anh)

3 Đếm số lượng tế bào nấm men trực tiếp bằng buồng đếm dưới kính hiển vi:

- Quy trình đếm (Ghi rõ quy trình pha loãng, kĩ thuật và nguyên tắc đếm):

+ Pha loãng dịch huyền phù VSV đến 10 −n

+ Nhỏ một giọt dịch huyền phù VSV ở độ pha loãng (n) vào giữa khung đếm và đậy lá kính Di chuyển nhẹ khung đếm cho dịch chiếm đầy khoang Phần dịch thừa sẽ tràn ra hai bên rãnh

+ Đếm số lượng tế bào trong các ô theo đường chéo hoặc theo các góc

ở trung tâm khung đếm Khi đếm nếu tế bào nằm ở ranh giới giữa hai ô thì quy ước chỉ đếm các tế bào nằm ở cạnh trên và phía bên trái của ô đó Thường đếm khoảng 4 - 5 ô lớn ở trung tâm của khung đếm để tính số lượng tế bào trung bình của 1 ô lớn Sau đó dùng công thức để tính số tế bào trong 1ml lúc đầu

- Kết quả đếm số lượng tế bào nấm men trực tiếp bằng buồng đếm dưới kính hiển vi:

+ Ô 1: 164

12 12 6 14

+ Ô 2: 144

+ Ô 3: 105

+ Ô 4: 146

+ Ô giữa: 186

- Tính số lượng tế bào nấm men trong 1 mL dịch ban đầu:

Trung bình các ô: 164 144 105 146 186+ + 5 + + = 149

Số lượng tế bào nấm men trong 1mL dịch ban đầu:

N = (A x 25) : V : n

Trong đó: N: Số lượng tế bào VSV

A: Số lượng tế bào đếm được trong 01 ô lớn (Lấy giá trị trung bình)

n: Độ pha loãng

V: Thể tích 01 ô lớn (2 x 10 −5

¿

N = (A x 25) : V : n = (149 x 25) : (2 x 10 −5 ¿ : 1

2 = 372500000

4 Đếm số lượng tế bào nấm men gián tiếp bằng phương pháp đo độ đục:

- Quy trình đếm (Ghi rõ quy trình pha loãng, các bước thao tác đo độ đục):

+ Bước 1: Lấy 1 ống giống VSV và 4 ống môi trường vô trùng rồi

tiến hành pha loãng mẫu như hình

+ Bước 2: Đo mật độ quang của các ống dịch sinh khối ở các độ pha loãng trên quang phổ kế

- Kết quả đo độ đục:

Độ pha loãng Độ đục (OD 620) %T

1

1

1

1

1

- Lập đồ thị tương quan giữa số lượng tế bào nấm men với độ đục:

Số lượng tế bào nấm men Độ đục (OD ) 620

Đồ thị tương quan giữa số lượng tế bào nấm men và độ đục

OD 620