Thực hành vi sinh ứng dụng

NỘI DUNG THỰC HÀNH BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP HCM KHOA MÔI TRƯỜNG & CÔNG NGHỆ SINH HỌC BÀI GIẢNG THỰC HÀNH VI SINH ỨNG DỤNG Biên soạn TS Nguyễn Hoài Hương 1 2009 2 Giới[.]

BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP.HCM KHOA MÔI TRƯỜNG & CÔNG NGHỆ SINH HỌC BÀI GIẢNG THỰC HÀNH VI SINH ỨNG DỤNG Biên soạn: TS Nguyễn Hoài Hương - 2009 - Giới thiệu môn học Môn thực hành vi sinh ứng dụng nhằm giúp sinh viên làm quen với phương pháp phân lập, khảo sát vi sinh vật ứng dụng xử lý môi trường, công nghệ lên men Các vi sinh ứng dụng thường phân lập từ mơi trường tự nhiên, chúng có khả sử dụng chất khác nhau, chuyển hóa vật chất tự nhiên Nguồn phân lập chúng từ đất, nước, động vật, thực vật hay thực phẩm Phân lập, xác định chức năng, định danh chúng bước đầu đưa chúng vào ứng dụng Trong khuôn khổ thực hành môn vi sinh ứng dụng sinh viên phân lập vi sinh vật chủ yếu từ môi trường đất Đất chất thuận lợi phát triển loại vi sinh vật khác Số lượng vi sinh g đất có tới hàng trăm triệu, chí hàng tỉ tế bào Hoạt động sống vi sinh vật đất có liên quan đến nhiều q trình xảy đất, trước hết vịng tuần hồn vật chất tự nhiên chu trình carbon, chu trình nitơ, phospho lưu huỳnh Các bước chung thực hành Phát nhóm vi sinh vật mẫu đất bao gồm đại diện số nhóm phân loại Nghiên cứu số đặc điểm sinh trưởng hình thái tế bào học tế bào đại diện thuộc vi sinh vật phân lập NỘI DUNG THỰC HÀNH BÀI 1: VI KHUẨN AMƠN HĨA BÀI 2: VI KHUẨN NITRAT HĨA BÀI 3: VI KHUẨN PHẢN NITRAT HÓA BÀI 4: VI KHUẨN CỐ ĐỊNH NITƠ BÀI 5: VI SINH VẬT PHÂN GIẢI CELLULOSE BÀI 1: VI KHUẨN AMƠN HĨA I Lý thuyết Q trình amơn hóa q trình phân giải protein hợp chất hữu khác có chứa nitơ tạo thành amoniac Các vi sinh vật có khả amơn hóa bao gồm nhiều lồi sinh bào tử khơng sinh bào tử, có khả sử dụng nhiều nguồn vật chất khác Ngồi cịn nhiều loại xạ khuẩn nấm khuẩn ty Tuy vậy, vi sinh vật sử dụng riêng loại protein khơng nhiều Các vi sinh vật có khả tiết men phân giải protein vào môi trường, thủy phân thành amino acid Khi đó, chúng sử dụng amino acid q trình dị hóa hóa Các sản phẩm đặc trưng trình phân giải protein NH3 H2S Quá trình phân giải protein xảy điều kiện hiếu khí kỵ khí Trong điều kiện hiếu khí, hợp chất hữu có chứa nitơ phân giải loài giống Bacillus Pseudomonas, đại diện họ Enterobacteriaceae, xạ khuẩn nấm khuẩn ty Trong đó, vai trị quan trọng chủ yếu giống Bacillus Trong điều kiện kỵ khí lồi giống Clostridium tham gia q trình chuyển hóa Cịn điều kiện thơng khí hạn chế, q trình amơn hóa thực bới lồi vi khuẩn trực khuẩn kỵ khí tùy nghi II Thực hành Việc phát xác định số lượng vi sinh vật amơn hóa thực cách cấy mẫu phân tích vào mơi trường lỏng rắn canh thịt-peptone Việc cấy lên môi trường thạch tiến hành dịch huyền phù trùng Pasteur nhằm tiêu diệt tế bào sinh dưỡng giữ lại bào tử đại diện thuộc giống Bacillus – giống đặc trưng cho q trình amơn hóa Ngồi ra, việc cấy lên môi trường thạch cho phép nhận định đặc tính khác khuẩn lạc vi khuẩn khác Mơi trường - hóa chất Mơi trường canh thịt- peptone: Cao thịt 5g Peptone 10g Nước 1000ml Môi trường thạch: Trộn vào môi trường lỏng 2% thạch Dung dịch pha loãng mẫu: dung dịch nước muối sinh lý tiệt trùng Giấy lọc loại thấm acetate chì Giấy quỳ đỏ Các loại thuốc nhuộm quan sát vi sinh vật: thuốc nhuộm Gram thuốc nhuộm bào tử, Thuốc thử Nessler Dụng cụ Các dụng cụ pha chế môi trường Các dụng cụ cấy, khử trùng Kinh hiển vi Tiến hành thí nghiệm Chuẩn bị mơi trường: Môi trường canh thịt-peptone phân vào khoảng 1/3 chiều cao ống nghiệm, khử trùng atm, 15 Các dải giấy quỳ giấy lọc thấm acetat chì cho vào đĩa petri, hấp khử trùng 0,5 atm Môi trường thạch canh thịt-peptone: sau hấp khử trùng phân vào đĩa petri, giữ 30OC Chuẩn bị mẫu: Mẫu đất pha với nước để thu dịch huyền phù  Ủ vi sinh vật mơi trường lỏng: Cấy từ dịch pha lỗng nồng độ 105 – 1010 Lấy 1ml dịch pha loãng cấy vào ống nghiệm có chứa mơi trường canh thịt-peptone khử trùng Dùng kẹp lấy dải giấy quỳ giấy lọc thấm acetatechì gài vào nút ống nghiệm Ủ nhiệt độ 28-30OC ngày đêm  Ủ vi sinh vật mơi trường thạch: Cấy từ dịch pha lỗng nồng độ 102 – 105 Lấy 0,5ml dịch pha loãng cho vào đĩa petri có chứa mơi trường khử trùng Dùng que trang trải lên bề mặt thạch Ủ nhiệt độ 28-30OC ngày đêm Mỗi môi trường tiến hành thêm mẫu đối chứng Quan sát ghi nhận kết Đối với môi trường lỏng, quan sát: Sự đục môi trường Sự tạo bông, kết cạn Nổi váng bề mặt Phản ứng sinh hóa: Màu kết tủa với thuốc thử Nessler: Nhỏ giọt thuốc thử Nessler lên đĩa sứ trắng, thêm que cấy đầy đất vườn ủ peptone broth Quan sát màu kết tủa: Màu vàng nhạt – ammoniac Vàng sậm – nhiều ammoniac Nâu – nhiều ammoniac Sự sinh NH3 làm giấy quỳ hóa xanh Sự sinh H2S làm giấy lọc thấm acetate chì hóa đen So sánh đối chứng thí nghiệm Độ lỗng pha Đục mơi Tạo bơng Tạo cặn Sinh NH3 Sinh H2S trường Nhận xét mức độ, tỷ lệ xuất cao 1g mẫu Chọn độ pha lỗng có tỷ lệ vi sinh vật cao làm tiêu soi kính hiển vi Trên mơi trường thạch, ghi nhận: Số lượng khuẩn lạc đĩa độ pha loãng Số khuẩn lạc đặc trưng Quan sát hình thái khuẩn lạc, mơ tả, ghi nhận vào bảng Độ loãng pha Số khuẩn lạc Số khuẩn lạc Hình đặc trưng thái Xuất khuẩn lạc bào tử Khả di động Chọn đĩa có nhiều khuẩn lạc đặc trưng làm tiêu soi kính hiển vi So sánh hình thái quan sát tiêu từ môi trường lỏng môi trường thạch BÀI 2: VI KHUẨN NITRAT HÓA I Lý thuyết Nitrat hóa q trình oxi hóa NH thành HNO3, cung cấp lượng cho vi sinh vật hoạt động Q trình oxi hóa xảy với q trình đồng hóa CO Hầu hết vi sinh vật tự dưỡng hóa vơ thuộc loại hiếu khí bắt buộc có khả thực q trình Nitrat hóa qua giai đoạn: Đầu tiên giai đoạn oxi hóa NH3 thành nitrit số đại diện thuộc nhóm vi khuẩn nitrit hóa: Nitrosomonas, Nitrosocystis, Nitrosococcus, Nitrosolobus, Tất chúng giống mặt sinh lý, sinh hóa, khác mặt hình thái học cấu trúc tế bào Các đại diện giống Nitrosomonas không sinh nội bào tử, tế bào nhỏ bé hình bầu dục Trên môi trường lỏng, Nitrosomonas trải qua số pha, phát triển tùy thuộc số điều kiện Hai pha chủ yếu pha di động- tế bào có hay chùm tiên mao pha tập đoàn khuẩn keo-các tế bào khơng di động Giai đoạn q trình nitrat hóa oxi hóa nitrit thành nitrat số vi khuẩn: Nitrobacter winogradski, N agilis, Nitrospina gracilis, Nitrococcus mobilis Tế bào đặc trưng Nitrobacter dịch nuôi thường có dạng hình que trịn, hình hạt đậu, hình trứng, di động khơng di động Khi điều kiện khơng thuận lợi chúng hình thành tập đoàn khuẩn keo Nitrospina gracilis trực khuẩn thẳng, mảnh dẻ, có dạng hình cầu, khơng di động, có đặ trưng hình thành tập đồn khuẩn keo Nitrococcus mobilis có dạng hình trịn, có tiên mao Vi khuẩn nitrat hóa khơng sử dụng chất hữu chuyển hóa cách chặt chẽ việc oxi hóa chất-NH3 nitrit II Thực hành Việc phát xác định số lượng vi khuẩn nitrat hóa thực cách cấy dịch huyền phù cần phân tích lên môi trường chọn lọc vô Winogradski Nguồn C mơi trường CO2 có khơng khí thành phần CaCO Nguyên liệu lượng nguồn N cho vi khuẩn gây giai đoạn đầu q trình nitrat hóa NH muối amon, vi khuẩn gây giai đoạn hai nitrit Điều kiện cần thiết phát triển vi khuẩn nitrat hóa việc thơng khí đầy đủ vào mơi trường ni cấy Số lượng vi khuẩn nitrat hóa xác định phương pháp pha lỗng tới hạn Mơi trường- hóa chất Thành phần mơi trường Winogradski: (NH4)2SO4 g/l K2HPO4 g/l MgSO4 0,5 g/l FeSO4 0,4 g/l NaCl g/l Chia vào bình thủy tinh 50ml, cho vào bình CaCO3 Hấp khử trùng atm Dung dịch pha loãng mẫu Các loại thuốc nhuộm quan sát vi sinh vật Tinh thể diphenylamin H2SO4 đậm đặc Tiến hành thí nghiệm Chuẩn bị môi trường: Môi trường hấp khử trùng phân vào ống nghiệm Xác định vi sinh vật mơi trường lỏng: Pha lỗng mẫu 102 - 105 Mỗi độ pha loãng lấy 1ml mẫu cấy vào ống nghiệm có chứa mơi trường đả khử trùng Ủ 28-30OC 2-3 tuần Làm ống nghiệm đối chứng Quan sát ghi nhận kết quả: Ở độ pha loãng, ghi nhận thay đổi môi trường ống nghiệm Những ống nghiệm ghi nhận có vi khuẩn phát triển, cần tiến hành thử nghiệm định tính Phản ứng định tính nitrat: Lấy vài tinh thể diphenylamin hòa tan giọt H 2SO4 đậm đặc Sau thêm giọt dịch cần kiểm tra Tiến hành sứ trắng thấy xuất màu xanh thẩm Ghi nhận kết vào bảng Ống nghiệm Độ pha loãng số 102 103 NO2- NO3- NO2- 104 NO3- NO2- 105 NO3- NO2- NO3- Chọn ống nghiệm có kết dương tính làm tiêu quan sát kính hiển vi Cần lưu ý chọn hạt CaCO3, xung quanh hạt này, tỷ lệ vi khuẩn cao Miêu tả, so sánh hình thái tế bào vi khuẩn quan sát (hình dạng, khả di động, khả tạo tập đoàn khuẩn keo) Nhận xét loài chiếm ưu BÀI VI KHUẨN PHẢN NITRAT HÓA I Lý thuyết Phản nitrat hóa q trình vi sinh vật thực việc khử nitrat thành nitrogen phân tử, đồng thời oxi hóa chất hữu đường, rượu, axit hữu co thành CO H2O với chất nhận điện tử cuối NO3 Năng lượng sinh oxi hóa chất vi sinh vật sử dụng trình hoạt động sống Q trình phản nitrat hóa xảy điều kiện hiếu khí lẫn kỵ khí, đặc biệt mạnh điều kiện kỵ khí Các vi sinh vật thực trình phân bố rộng rãi tự nhiên Phần lớn chúng thuộc loại dị dưỡng hóa hữu cơ, kỵ khí tùy nghi gồm số giống Pseudomonas, Achromobacter, Micrococcus … II Thực hành Việc phát vi khuẩn phản nitrat hóa xác định số lượng chúng thực phương pháp cấy mẫu lên môi trường chứa hợp chất C dạng oxi hóa, có nitrat hợp chất khác cần cho trình sinh tổng hợp tế bào Khi đó, đáng ý số vi khuẩn nitrat sử dụng nitrat nguồn lượng chủ yếu nhất, tức dùng chúng làm chất nhận electron không dùng làm nguồn N trao đổi kiến tạo, khơng thể khử NH3 thành NH4+ Vì vậy, mơi trường ni cấy vi khuẩn phản nitrat hóa, người ta cho thêm peptone, asparagin muối amon hạn chế lưu khí q trình ni cấy Số lượng vi khuẩn xác định phương pháp pha lỗng tới hạn Mơi trường- hóa chất Môi trường Giltay: Dung dịch A: Asparagine: 1g KNO3: 1g Nước máy: 0.25l Dung dịch B: KNO3: 8,5g K2HPO4: 1g MgSO4: 1g CaCl2: 0,2g 10 FeCl2: vết Nước máy: 0,25l Hòa 0,25l dung dịch A 0,25l dung dịch B, sau thêm nước máy đến 1L dung dịch mơi trường Giltay hồn tất Tiến hành thí nghiệm Chuẩn bị môi trường: môi trường Giltei với thành phần phân vào ống nghiệm, hấp khử trùng 0,5 atm Xác định vi sinh vật môi trường lỏng: Pha loãng mẫu 103- 108 Lấy 1ml mẫu cấy sâu vào đáy ống nghiệm có chứa mơi trường khử trùng Ủ 28-30OC ngày đêm Làm ống nghiệm đối chứng Quan sát ghi nhận kết Dấu hiệu chủ yếu cho phát triển vi khuẩn nitrat hóa sinh khí, làm đục giảm pH mơi trường Quan sát ống nghiệm độ pha loãng khác ghi nhận vào bảng Kiểm tra việc khử nitrat môi trường phản ứng sinh hóa với diphenylamin Độ pha lỗng Đục mơi trường Sinh khí pH mơi trường NO3- 103 105 107 109 Chọn ống nghiệm cho kết tốt làm tiêu bản, quan sát kính hiển vi ghi nhận hình thái học vi khuẩn phản nitrat hóa phân lập Kiểm tra việc khử nitrat môi trường phản ứng sinh hóa với diphenylamin: Lấy vài tinh thể diphenylamine hòa tan vào giọt H2SO đặc, sau thêm vào giọt dịch nghiên cứu Nếu có mặt nitrate xuất màu xanh thẫm 11 BÀI VI SINH VẬT CỐ ĐỊNH NITƠ I Lý thuyết Cố định N khả đồng hóa N phân tử số vi sinh vật dùng làm nguồn kiến tạo tế bào Các vi sinh vật cố định N sống tự do, có nhiều đất, nước gồm số loài thuộc giống Clostridium, Azotobacter, Pseudomonas, Bacillus, Aerobacter, vi khuẩn quan năng, vi khuẩn sinh metan, vi khuẩn khử sulfat, nấm, tảo lam… Ngoài khả cố định N cịn có vi khuẩn nốt sần sống cộng sinh rễ họ đậu Chúng có ý nghĩa quan trong việc chuyển N vô thành N hữu cơ, đặc biệt vai trị vi khuẩn nốt sần, lồi giống Clostridium Azotobacter II Thực hành Các loài Azotobacter thuộc loài vi sinh vật cố định nitrogen hoạt động Một số loài nghiên cứu Az Chroococum-đặc trưng đất đồng cỏ, Az Agilis Az Vinelandii ao hồ Các loài khác đặc điểm sinh trưởng mơi trường đặc, kích thước, hình thái tế bào số đặc điểm sinh lý khác Az Chroococum tạo khuẩn lạc nhầy, lồi lan, lúc đầu không màu, sau chuyển thành màu nâu tối đen không lan màu sang mơi trường Az Agilis Az Vinelandii có khuẩn lạc trong, nhầy, sinh sắc tố huỳnh quang màu vàng lục lam lục, có khuếch tán vào mơi trường Khi cịn non, tế bào Azotobacter hình que đầu trịn đứng riêng lẽ xếp thành đơi chồng chất, tế bào chất nhuộm màu đồng đều, có khả di động nhờ chu mao Chiều dài tế bào thay đổi 2-3 đếm 4-6 μm, lớn tế bào Az Agilis Dần dần, tế bào hình que chuyển thành hình cầu hình bầu dục với đường kính μm, hình dạng khơng cố định Khi tiên mao rụng tế bào trở nên bất động, bọc bao nhầy, tế bào chất xuất dạng hạt với nhiều chất dinh dưỡng mỡ, glycogen… Ở tế bào Az Chroococcum Az Vinelandii tế bào trịn phủ lớp vỏ nhầy chuyển thành kén Hình dạng tế bào chu kỳ biến đổi Azotobacter phụ thuộc tuổi giống điều kiện phát triển Tất loài Azotobacter sống dị dưỡng, dùng nhiều nguồn cacbon khác nhau, monosacharit, disacharit, polysacharit (dextrin, tinh bột), nhiều rượu acid hữu cơ, hợp chất thơm…Nguồn nitrogen Nitrogen phân tử, muối amon, nitrate, nitrit, aminoaxit Tùy thuộc nồng độ hợp chất có nitrogen mơi trường mà q trình cố định nitrogen phân tử bị ức chế nhiều hay Đồng thời Azotobacter có nhu cầu lớn P Ca Azotobacter nhận lượng từ trình oxi hóa hợp chất hữu thành CO2 H2O 12 Phần lớn loài Azotobacter phát triển pH lớn 6, không gặp chúng đất chua Đối với đất chua, đặc trưng lồi Az Indicum phát triển môi trường với pH Azotobacter cần độ ẩm cao so với nhiều vi khuẩn khác nên gặp chúng vùng đất khô hạn Việc phát Azotobacter thực môi trường chọn lọc Thompson-Sherman không chứa nitrogen hợp chất, điều kiện hiếu khí độ ẩm cao Mơi trường- hóa chất Thành phần môi trường Thompson-Sherman (N2-free glucose) tăng sinh K2HPO4: 1g MgSO4: 0,2g FeSO4: 0,2g CaCl2: 0,1g Na2MoO4: 0,001g Glucose: 10g Nước máy: 1000ml Thành phần môi trường Thompson-Sherman (N2-free glucose) phân lập K2HPO4: 1g MgSO4: 0,2g CaCl2: 0,1g Na2MoO4: 0,001g Glucose: 10g Nước máy: 1000ml Agar: 3% thể tích mơi trường Chuẩn bị mơi trường Thompson-Sherman với thành phần trên, hấp khử trùng 121OC 15 phút atm Tiến hành thí nghiệm - Giai đoạn tăng sinh: Cân 1g đất cho vào erlen có 50ml môi trường Thompson-Sherman tăng sinh hấp khử trùng với thành phần Ủ 4-7 ngày 30OC - Giai đoạn sau tăng sinh: Kiểm tra hình dạng, kích thước tế bào vi khuẩn có sinh khối tăng sinh kính hiển vi quang học Nếu có hình thái khuẩn lạc, chuyển sang mơi trường phân lập 13 - Giai đoạn phân lập: Cấy sinh khối vi khuẩn vào môi trường Thompson-Sherman phân lập phân vào đĩa petri hấp khử trùng Ủ 3-5 ngày, 30OC Quan sát ghi nhận kết Quan sát ghi nhận hình thái vi khuẩn đặc trưng sau giai đoạn tăng sinh Hình Bào tử dạng Kích Sự thước xếp tế tế bào Có roi Di động Bao Hình nhầy vẽ tế bào bào Loại Loại Ghi nhận loại khuẩn lạc khác xuất sau giai đoạn phân lập Mô tả khuẩn lạc Khuẩn Hình lạc loại dạng Bề mặt Độ Màu sắc Huỳnh Khuếch tán Số lượng quang màu vào khuẩn lạc loại môi trường Loại Loại Chọn khuẩn lạc đặc trưng làm tiêu giọt ép đề quan sát bao nhầy Soi kính hiển vi vật kính 40X đề kiểm tra hình thái vi khuẩn: kích thước lớn, thường đứng thành đơi có bao nhầy Ghi nhận đặc điểm vào bảng Hình dạng tế bào Bào tử Kích Sự Bao Hình thước xếp tế nhầy vẽ tế bào bào Loại Loại BÀI 5:VI SINH VẬT PHÂN GIẢI CELLULOSE 14 I Lý thuyết Cellulose thành phần cấu tạo thành tế bào thực vật Việc tổng hợp cellulose có quy mơ phức tạp hẳn việc tổng hợp hợp chất khác Do đó, vi sinh vật phân giải cellulose có vai trị đặc biệt quan trọng chu trình tuần hồn Cacbon Sự phân giải tiến hành điều kiện hiếu khí lẫn kỵ khí, mơi trường kiểm acid, độ ẩm thấp cao nhiệt độ khác Tất vi sinh vật tham gia vơ hóa cellulose thuộc loại dị dưỡng hóa hữu cơ, có enzyme cellulosase xúc tác việc phân giải cellulose thành cellobioase glucose Vi sinh vật dùng hợp chất sinh làm nguồn cacbon nguồn lượng Trong điều kiện hiếu khí, vi sinh vật tham gia vào trình gồm niêm khuẩn, số đại diện vi khuẩn không sinh bào tử sinh bào tử, xạ khuẩn, nấm Trong đó, quan trọng niêm khuẩn Niêm khuẩn có tế bào hình que nhỏ bé (03-0,4 x 0,7-10μm) uốn cong, thường có đầu nhọn, thành tế bào mỏng nhuộm màu so với vi khuẩn khác Trên chất đặc niêm khuẩn có chuyển động trượt, tiết chất nhầy không đồng bề mặt tế bào Vài lồi niêm khuẩn có tiên mao, có chu kỳ phát triển phức tạp Đầu tiên, tế bào hình que từ từ dầy lên, biến thành tế bào dạng nghỉ, hình cầu bầu dục, kích thước khác Niêm khuẩn phân giải cellulose chủ yếu gồm giống Cytophaga, Sporocytophaga, Sorangium sống đất acid, trung tính kiềm Các lồi thuộc giống Cytophaga có tế bào đầu nhọn, khơng sinh vi kén Các lồi giống Sporocytophaga có hình thái tương tự Cytophaga khác chỗ có khả sinh vi kén Các loài thuộc giống Sorangium trực khuẩn đầu nhọn, có khả hình thành kén Trên bề mặt vật liệu có cellulose, niêm khuẩn phát triển dạng thể nhầy, khơng có hình dạng xác định, lan rộng, khơng màu có màu vàng, da cam, đỏ tương ứng với chỗ cellulose bị phân giải nhiều hay Ngồi niêm khuẩn, đất cịn có lồi phân giải cellulose thuộc giống Cellvibrio, tế bào uống cong, di động nhờ tiên mao, không sinh nội bào tử, khuẩn lạc khơng màu có màu vàng lục Chúng dùng cellulose cạn kiệt nguồn cacbon khác khả phân giải không mạnh mẽ niêm khuẩn Trong đất chua, vai trò phân giải nấm thuộc giống Chaelomium, Trichoderma, Fusarium, Aspergillus II Thực hành Hầu hết tất loài phân giải cellulose thuộc nhóm hiếu khí ưa ẩm 15 Việc phát xác định sô lượng vi sinh vật phân giải cellulose điều kiện hiếu khí tiến hành cách cấy dịch huyền phù nghiên cứu lên đĩa chứa mơi trường chọn lọc Hutchinson có nguồn cacbon xellulose Nuôi cấy điều kiện hiếu khí Mơi trường hóa chất Mơi trường Hutchinson (g) KNO3 2,5 K2HPO4 1,0 MgSO4 0,3 CaCl2 0,1 NaCl 0,1 FeCl3 0,01 Agar 3% Nước máy 1000ml Tiến hành thí nghiệm Chuẩn bị đĩa petri có môi trường Hutchinson với thành phần trên, hấp khử trùng atm Giấy lọc cắt thành khoanh trịn kích thước tương ứng đĩa petri Hấp khử trùng atm Mẫu đất pha với nước máy để lấy dịch huyền phù Cấy 0,1 ml dịch huyền phù từ độ pha loãng 101 đến 1010, trang lên bề mặt que cấy trang Sau dùng kẹp sắt khử trùng lửa gấp khoanh giấy lọc vô trùng đặt áp sát lên bề mặt Mỗi độ pha loãng lập lại lần Đậy nắp đĩa petri đặt vào bình hút ẩm Ni cấy 28-30OC 12-14 ngày đêm Quan sát ghi nhận kết Quan sát đếm số lượng khuẩn lạc vi sinh vật mọc khoanh giấy lọc đĩa petri Xác định xem khuẩn lạc nhóm vi sinh vật (niêm khuẩn, xạ khuẩn hay nấm khuẩn ty) chiếm ưu giấy lọc Để phân biệt khuẩn lạc nhỏ xạ khuẩn nấm, quan sát kính hiển vi với vật kính 8X Nhận xét khác loại vi sinh vật phát Khuẩn lạc loại Hình dạng Kích thước Màu sắc Mức độ phân Số khuẩn lạc giải cellulose loại ghi nhận (khuẩn lạc/đĩa) Loại Loại 16 Mô tả khác khuẩn lạc khác niêm khuẩn, ghi nhận dấu hiệu Chọn khuẩn lạc đặc trưng làm tiêu với sợi cellulose từ chỗ giấy lọc bị phân giải nhiều Lưu ý hình dạng tế bào sinh dưỡng vi kén bào tử nấm mốc Khuẩn lạc loại Tế bào sinh dưỡng Vi kén Hình vẽ tế bào Hình vẽ vi kén (nếu có) Loại Loại 17 ... thiệu môn học Môn thực hành vi sinh ứng dụng nhằm giúp sinh vi? ?n làm quen với phương pháp phân lập, khảo sát vi sinh vật ứng dụng xử lý môi trường, công nghệ lên men Các vi sinh ứng dụng thường... động vật, thực vật hay thực phẩm Phân lập, xác định chức năng, định danh chúng bước đầu đưa chúng vào ứng dụng Trong khuôn khổ thực hành môn vi sinh ứng dụng sinh vi? ?n phân lập vi sinh vật chủ... chung thực hành Phát nhóm vi sinh vật mẫu đất bao gồm đại diện số nhóm phân loại Nghiên cứu số đặc điểm sinh trưởng hình thái tế bào học tế bào đại diện thuộc vi sinh vật phân lập NỘI DUNG THỰC HÀNH