THỰC HÀNH VI SINH ỨNG DỤNG

Môn thực hành vi sinh ứng dụng nhằm giúp sinh viên làm quen với các phương pháp phân lập, khảo sát các vi sinh vật được ứng dụng trong xử lý môi trường, công nghệ lên men .

BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP.HCM

KHOA MÔI TRƯỜNG & CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BÀI GIẢNG

THỰC HÀNH

VI SINH ỨNG DỤNG

Biên soạn: TS Nguyễn Hoài Hương

2009

-Giới thiệu môn học

Môn thực hành vi sinh ứng dụng nhằm giúp sinh viên làm quen với các phương pháp phân lập, khảo sát các vi sinh vật được ứng dụng trong xử lý môi trường, công nghệ lên men Các vi sinh ứng dụng thường được phân lập từ môi trường tự nhiên, chúng có khả năng sử dụng các cơ chất khác nhau, chuyển hóa vật chất trong tự nhiên Nguồn phân lập chúng có thể từ đất, nước, động vật, thực vật hay thực phẩm Phân lập, xác định chức năng, định danh chúng là bước đầu đưa chúng vào ứng dụng Trong khuôn khổ bài thực hành môn vi sinh ứng dụng sinh viên phân lập vi sinh vật chủ yếu từ môi trường đất Đất là một trong những cơ chất thuận lợi nhất đối với sự phát triển của các loại vi sinh vật khác nhau Số lượng vi sinh trong 1 g đất có tới hàng trăm triệu, thậm chí hàng tỉ tế bào Hoạt động sống của vi sinh vật đất có liên quan đến nhiều quá trình xảy ra trong đất, trước hết là các vòng tuần hoàn của vật chất trong tự nhiên như chu trình carbon, chu trình nitơ, phospho và lưu huỳnh

Các bước chung của bài thực hành là

1 Phát hiện các nhóm vi sinh vật trong mẫu đất bao gồm đại diện của một số nhóm phân loại

2 Nghiên cứu một số đặc điểm sinh trưởng và hình thái tế bào học tế bào của các đại diện thuộc

vi sinh vật phân lập được

NỘI DUNG THỰC HÀNH

BÀI 1: VI KHUẨN AMÔN HÓA

BÀI 2: VI KHUẨN NITRAT HÓA

BÀI 3: VI KHUẨN PHẢN NITRAT HÓA

BÀI 4: VI KHUẨN CỐ ĐỊNH NITƠ

BÀI 5: VI SINH VẬT PHÂN GIẢI CELLULOSE

BÀI 1: VI KHUẨN AMÔN HÓA

I Lý thuyết

Quá trình amôn hóa là quá trình phân giải protein và các hợp chất hữu cơ khác có chứa nitơ tạo thành amoniac Các vi sinh vật có khả năng amôn hóa bao gồm nhiều loài sinh bào tử hoặc không sinh bào tử, có khả năng sử dụng nhiều nguồn vật chất khác nhau Ngoài ra còn nhiều loại xạ khuẩn

và nấm khuẩn ty Tuy vậy, những vi sinh vật chỉ sử dụng riêng một loại protein thì không nhiều Các vi sinh vật này có khả năng tiết men phân giải protein vào môi trường, thủy phân thành các amino acid Khi đó, chúng sử dụng các amino acid này trong quá trình dị hóa và đổng hóa Các sản phẩm đặc trưng của quá trình phân giải protein là NH3 và H2S

Quá trình phân giải protein có thể xảy ra trong các điều kiện hiếu khí và kỵ khí Trong điều kiện

hiếu khí, các hợp chất hữu cơ có chứa nitơ được phân giải bởi các loài trong giống Bacillus và

Pseudomonas, các đại diện trong họ Enterobacteriaceae, các xạ khuẩn và nấm khuẩn ty Trong đó,

vai trò quan trọng và chủ yếu nhất là giống Bacillus Trong điều kiện kỵ khí thì các loài trong giống

Clostridium tham gia quá trình chuyển hóa này Còn trong điều kiện thông khí hạn chế, quá trình

amôn hóa được thực hiện bới các loài vi khuẩn và trực khuẩn kỵ khí tùy nghi

II Thực hành

Việc phát hiện và xác định số lượng các vi sinh vật amôn hóa được thực hiện bằng cách cấy các mẫu phân tích vào môi trường lỏng và rắn canh thịt-peptone

Việc cấy lên môi trường thạch được tiến hành bằng dịch huyền phù đã thanh trùng Pasteur nhằm

tiêu diệt các tế bào sinh dưỡng và chỉ còn giữ lại bào tử của các đại diện thuộc giống Bacillus – giống

đặc trưng nhất cho quá trình amôn hóa

Ngoài ra, việc cấy lên môi trường thạch cho phép nhận định được các đặc tính khác nhau của khuẩn lạc các vi khuẩn khác nhau này

1 Môi trường - hóa chất

Môi trường canh thịt- peptone:

Cao thịt 5g

Môi trường thạch:

Trộn vào môi trường lỏng 2% thạch

Dung dịch pha loãng mẫu: dung dịch nước muối sinh lý tiệt trùng.

Giấy lọc loại thấm acetate chì

Giấy quỳ đỏ

Các loại thuốc nhuộm quan sát vi sinh vật: thuốc nhuộm Gram và thuốc nhuộm bào tử,

Thuốc thử Nessler

2 Dụng cụ

Các dụng cụ pha chế môi trường

Các dụng cụ cấy, khử trùng

Kinh hiển vi

3 Tiến hành thí nghiệm

Chuẩn bị môi trường:

Môi trường canh thịt-peptone được phân vào khoảng 1/3 chiều cao ống nghiệm, khử trùng ở 1 atm, 15 min

Các dải giấy quỳ và giấy lọc thấm acetat chì được cho vào đĩa petri, hấp khử trùng ở 0,5 atm Môi trường thạch canh thịt-peptone: sau khi hấp khử trùng được phân vào các đĩa petri, giữ ở

30OC

Chuẩn bị mẫu:

Mẫu đất được pha với nước để thu dịch huyền phù

• Ủ vi sinh vật trên môi trường lỏng:

Cấy từ các dịch pha loãng nồng độ 105 – 1010

Lấy 1ml dịch pha loãng cấy vào ống nghiệm có chứa môi trường canh thịt-peptone đã khử trùng ở trên

Dùng kẹp lấy các dải giấy quỳ và giấy lọc thấm acetatechì gài vào giữa nút bông và ống nghiệm

Ủ ở nhiệt độ 28-30OC trong 3 ngày đêm

• Ủ vi sinh vật trên môi trường thạch:

Cấy từ các dịch pha loãng nồng độ 102 – 105

Lấy 0,5ml dịch pha loãng cho vào các đĩa petri có chứa môi trường đã khử trùng ở trên

Dùng que trang trải đều lên bề mặt thạch

Ủ ở nhiệt độ 28-30OC trong 3 ngày đêm

Mỗi môi trường tiến hành thêm 1 mẫu đối chứng

4 Quan sát và ghi nhận kết quả

Đối với môi trường lỏng, quan sát:

Sự đục môi trường

Sự tạo bông, kết cạn

Nổi váng trên bề mặt

Phản ứng sinh hóa:

Màu kết tủa với thuốc thử Nessler: Nhỏ một giọt thuốc thử Nessler lên đĩa sứ trắng, thêm một que cấy đầy đất vườn ủ trong peptone broth Quan sát màu kết tủa:

Màu vàng nhạt – ít ammoniac

Vàng sậm – nhiều ammoniac

Nâu – rất nhiều ammoniac

Sự sinh NH3 làm giấy quỳ hóa xanh

Sự sinh H2S làm giấy lọc thấm acetate chì hóa đen

So sánh đối chứng và thí nghiệm

loãng

Đục môi trường

Tạo bông Tạo cặn Sinh NH3 Sinh H2S

Nhận xét mức độ, tỷ lệ xuất hiện cao nhất trong 1g mẫu

Chọn một độ pha loãng có tỷ lệ vi sinh vật cao nhất làm tiêu bản và soi kính hiển vi

Trên môi trường thạch, ghi nhận:

Số lượng khuẩn lạc trên 1 đĩa ở mỗi độ pha loãng

Số khuẩn lạc đặc trưng

Quan sát hình thái khuẩn lạc, mô tả, ghi nhận vào bảng

loãng

Số khuẩn lạc Số khuẩn lạc

đặc trưng

Hình thái khuẩn lạc

Xuất hiện bào tử

Khả năng di động

Chọn một đĩa có nhiều khuẩn lạc đặc trưng nhất làm tiêu bản và soi kính hiển vi

So sánh hình thái quan sát được giữa tiêu bản từ môi trường lỏng và môi trường thạch

BÀI 2: VI KHUẨN NITRAT HÓA

I Lý thuyết

Nitrat hóa là quá trình oxi hóa NH3 thành HNO3, cung cấp năng lượng cho vi sinh vật hoạt động Quá trình oxi hóa này xảy ra cùng với quá trình đồng hóa CO2 Hầu hết các vi sinh vật tự dưỡng hóa năng vô cơ thuộc loại hiếu khí bắt buộc đều có khả năng thực hiện quá trình này

Nitrat hóa qua 2 giai đoạn:

Đầu tiên là giai đoạn oxi hóa NH3 thành nitrit bởi một số đại diện thuộc nhóm vi khuẩn nitrit hóa:

Nitrosomonas, Nitrosocystis, Nitrosococcus, Nitrosolobus, Tất cả chúng đều giống nhau về mặt sinh

lý, sinh hóa, chỉ khác nhau về mặt hình thái học và cấu trúc tế bào

Các đại diện của giống Nitrosomonas không sinh nội bào tử, tế bào nhỏ bé hình bầu dục Trên môi trường lỏng, Nitrosomonas trải qua một số pha, phát triển tùy thuộc một số điều kiện Hai pha

chủ yếu là pha di động- tế bào có 1 hay chùm tiên mao và pha tập đoàn khuẩn keo-các tế bào không

di động

Giai đoạn 2 của quá trình nitrat hóa oxi hóa nitrit thành nitrat bởi một số vi khuẩn:

Nitrobacter winogradski, N agilis, Nitrospina gracilis, Nitrococcus mobilis.

Tế bào đặc trưng của Nitrobacter trong dịch nuôi thường có dạng hình que tròn, hình hạt đậu,

hoặc hình trứng, có thể di động hoặc không di động Khi điều kiện không thuận lợi chúng có thể hình

thành những tập đoàn khuẩn keo Nitrospina gracilis là những trực khuẩn thẳng, mảnh dẻ, thỉnh

thoảng có dạng hình cầu, không di động, và có đặ trưng là hình thành những tập đoàn khuẩn keo

Nitrococcus mobilis thì có dạng hình tròn, có tiên mao.

Vi khuẩn nitrat hóa không sử dụng các chất hữu cơ và chuyển hóa một cách chặt chẽ đối với việc oxi hóa cơ chất-NH3 và nitrit

II Thực hành

Việc phát hiện và xác định số lượng vi khuẩn nitrat hóa được thực hiện bằng cách cấy dịch huyền phù cần phân tích lên môi trường chọn lọc vô cơ Winogradski Nguồn C duy nhất trong môi trường này là CO2 có trong không khí và trong thành phần của CaCO3 Nguyên liệu năng lượng và nguồn N cho các vi khuẩn gây ra giai đoạn đầu của quá trình nitrat hóa là NH3 và muối amon, còn đối với vi khuẩn gây ra giai đoạn hai là nitrit

Điều kiện cần thiết đối với sự phát triển của vi khuẩn nitrat hóa là việc thông khí đầy đủ vào môi trường nuôi cấy Số lượng vi khuẩn nitrat hóa được xác định bằng phương pháp pha loãng tới hạn

1 Môi trường- hóa chất

Thành phần môi trường Winogradski:

(NH4)2SO4 2 g/l

Chia vào các bình thủy tinh 50ml, cho vào mỗi bình một ít CaCO3 Hấp khử trùng ở 1 atm

Dung dịch pha loãng mẫu

Các loại thuốc nhuộm quan sát vi sinh vật

Tinh thể diphenylamin

H2SO4 đậm đặc

2 Tiến hành thí nghiệm

Chuẩn bị môi trường: Môi trường đã hấp khử trùng được phân vào các ống nghiệm

Xác định vi sinh vật trên môi trường lỏng:

Pha loãng mẫu 102 - 105

Mỗi độ pha loãng lấy 1ml mẫu cấy vào ống nghiệm có chứa môi trường đả khử trùng ở trên

Ủ ở 28-30OC trong 2-3 tuần

Làm 1 ống nghiệm đối chứng

3 Quan sát và ghi nhận kết quả:

Ở mỗi độ pha loãng, ghi nhận sự thay đổi môi trường trong ống nghiệm

Những ống nghiệm nào ghi nhận có vi khuẩn phát triển, cần tiến hành thử nghiệm định tính

Phản ứng định tính nitrat: Lấy vài tinh thể diphenylamin hòa tan trong 1 giọt H2SO4 đậm đặc Sau đó thêm 1 giọt dịch cần kiểm tra Tiến hành trên bản sứ trắng sẽ thấy xuất hiện màu xanh thẩm

Ghi nhận kết quả vào bảng

Ống nghiệm

số

Độ pha loãng

NO2- NO3- NO2- NO3- NO2- NO3- NO2- NO

3-Chọn ống nghiệm có kết quả dương tính làm tiêu bản quan sát dưới kính hiển vi Cần lưu ý chọn được cả những hạt CaCO3, vì xung quanh hạt này, tỷ lệ vi khuẩn là cao nhất Miêu tả, so sánh hình

thái các tế bào vi khuẩn quan sát được (hình dạng, khả năng di động, khả năng tạo tập đoàn khuẩn keo) Nhận xét loài nào chiếm ưu thế nhất

BÀI 3 VI KHUẨN PHẢN NITRAT HÓA

I Lý thuyết

Phản nitrat hóa là quá trình vi sinh vật thực hiện việc khử nitrat thành nitrogen phân tử, đồng thời oxi hóa các chất hữu cơ như đường, rượu, axit hữu co thành CO2 và H2O với chất nhận điện tử cuối cùng là NO3 Năng lượng sinh ra khi oxi hóa cơ chất được vi sinh vật sử dụng trong quá trình hoạt động sống của mình

Quá trình phản nitrat hóa có thể xảy ra trong điều kiện hiếu khí lẫn kỵ khí, nhưng đặc biệt mạnh trong điều kiện kỵ khí

Các vi sinh vật thực hiện quá trình này phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên Phần lớn chúng thuộc

loại dị dưỡng hóa năng hữu cơ, kỵ khí tùy nghi gồm một số giống Pseudomonas, Achromobacter,

Micrococcus …

II Thực hành

Việc phát hiện vi khuẩn phản nitrat hóa và xác định số lượng của chúng được thực hiện bằng phương pháp cấy mẫu lên môi trường chứa hợp chất C ở dạng oxi hóa, có nitrat và các hợp chất khác cần cho quá trình sinh tổng hợp của tế bào Khi đó, đáng chú ý là một số vi khuẩn nitrat sử dụng nitrat như nguồn năng lượng chủ yếu hoặc duy nhất, tức dùng chúng làm chất nhận electron nhưng không dùng làm nguồn N trong trao đổi kiến tạo, vì không thể khử NH3 thành NH4+ Vì vậy, trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn phản nitrat hóa, người ta cho thêm peptone, asparagin hoặc muối amon và hạn chế lưu khí trong quá trình nuôi cấy

Số lượng vi khuẩn được xác định bằng phương pháp pha loãng tới hạn

1 Môi trường- hóa chất

Môi trường Giltay:

Dung dịch A:

Asparagine: 1g

Nước máy: 0.25l Dung dịch B:

KNO3: 8,5g

K2HPO4: 1g MgSO4: 1g

CaCl2: 0,2g FeCl2: vết Nước máy: 0,25l Hòa 0,25l dung dịch A và 0,25l dung dịch B, sau đó thêm nước máy đến 1L dung dịch môi trường Giltay hoàn tất

2 Tiến hành thí nghiệm

Chuẩn bị môi trường: môi trường Giltei với thành phần như trên được phân vào các ống nghiệm, hấp khử trùng 0,5 atm

Xác định vi sinh vật trên môi trường lỏng:

Pha loãng mẫu 103- 108

Lấy 1ml mẫu cấy sâu vào đáy ống nghiệm có chứa môi trường đã khử trùng ở trên

Ủ ở 28-30OC trong 7 ngày đêm

Làm 1 ống nghiệm đối chứng

3 Quan sát và ghi nhận kết quả

Dấu hiệu chủ yếu nhất cho sự phát triển của vi khuẩn nitrat hóa là sự sinh khí, làm đục và giảm pH của môi trường

Quan sát các ống nghiệm ở các độ pha loãng khác nhau và ghi nhận vào bảng

Kiểm tra việc khử nitrat trong môi trường bằng phản ứng sinh hóa với diphenylamin

Độ pha loãng Đục môi trường Sinh khí pH môi trường NO3

-103

105

107

109

Chọn 1 ống nghiệm cho kết quả tốt nhất làm tiêu bản, quan sát kính hiển vi và ghi nhận hình thái học của các vi khuẩn phản nitrat hóa phân lập được

Kiểm tra việc khử nitrat trong môi trường bằng phản ứng sinh hóa với diphenylamin:

Lấy vài tinh thể diphenylamine hòa tan vào một giọt H2SO 4 đặc, sau đó thêm vào một giọt dịch nghiên cứu Nếu có mặt nitrate sẽ xuất hiện màu xanh thẫm

BÀI 4 VI SINH VẬT CỐ ĐỊNH NITƠ

I Lý thuyết

Cố định N là khả năng đồng hóa N phân tử của một số vi sinh vật và dùng làm nguồn kiến tạo tế

bào Các vi sinh vật cố định N sống tự do, có nhiều trong đất, nước gồm một số loài thuộc giống

Clostridium, Azotobacter, Pseudomonas, Bacillus, Aerobacter, vi khuẩn quan năng, vi khuẩn sinh

metan, vi khuẩn khử sulfat, nấm, tảo lam… Ngoài ra khả năng cố định N còn có ở các vi khuẩn nốt sần sống cộng sinh trong rễ các cây họ đậu Chúng có ý nghĩa quan trong trong việc chuyển N vô cơ

thành N hữu cơ, đặc biệt là vai trò của vi khuẩn nốt sần, các loài trong giống Clostridium và

Azotobacter.

II Thực hành

Các loài Azotobacter thuộc loài vi sinh vật cố định nitrogen hoạt động nhất Một số loài được nghiên cứu hơn cả là Az Chroococum-đặc trưng trên đất đồng cỏ, Az Agilis và Az Vinelandii trong

ao hồ Các loài này khác nhau về đặc điểm sinh trưởng trên môi trường đặc, kích thước, hình thái tế

bào và một số đặc điểm sinh lý khác Az Chroococum tạo những khuẩn lạc nhầy, lồi hoặc lan, lúc đầu không màu, sau chuyển thành màu nâu tối hoặc đen nhưng không lan màu sang môi trường Az

Agilis và Az Vinelandii thì có khuẩn lạc trong, nhầy, sinh sắc tố huỳnh quang màu vàng lục hoặc lam

lục, và có sự khuếch tán vào môi trường Khi còn non, tế bào Azotobacter hình que đầu tròn đứng

riêng lẽ hoặc xếp thành từng đôi chồng chất, tế bào chất nhuộm màu đồng đều, có khả năng di động

nhờ chu mao Chiều dài tế bào thay đổi 2-3 đếm 4-6 μm, trong đó lớn nhất là tế bào của Az Agilis

Dần dần, các tế bào hình que chuyển thành hình cầu hoặc hình bầu dục với đường kính 4 μm, hình dạng không cố định Khi đó tiên mao rụng đi và tế bào trở nên bất động, bọc bao nhầy, tế bào chất

xuất hiện dạng hạt với nhiều chất dinh dưỡng mỡ, glycogen… Ở tế bào Az Chroococcum và Az

Vinelandii các tế bào tròn có thể phủ lớp vỏ nhầy và chuyển thành kén Hình dạng tế bào và chu kỳ

biến đổi của Azotobacter phụ thuộc tuổi của giống và điều kiện phát triển.

Tất cả các loài Azotobacter đều sống dị dưỡng, dùng nhiều nguồn cacbon khác nhau,

monosacharit, disacharit, polysacharit (dextrin, tinh bột), nhiều rượu và acid hữu cơ, các hợp chất thơm…Nguồn nitrogen có thể là Nitrogen phân tử, cũng có thể là muối amon, nitrate, nitrit, aminoaxit Tùy thuộc nồng độ các hợp chất có nitrogen này trong môi trường mà quá trình cố định

nitrogen phân tử sẽ bị ức chế nhiều hay ít Đồng thời Azotobacter có nhu cầu lớn đối với P và Ca

Azotobacter nhận được năng lượng từ quá trình oxi hóa các hợp chất hữu cơ thành CO2 và H2O