Phương pháp thường được áp dụng nhất trong các phòng thí nghiệm PCR chẩn đoán là dùng kỹ thuật điện di để xác định kích thước sản phẩm khuếchđại có đúng như kích thước mong muốn hay khôn
CÁC VẤN ĐỀ CẦN LƯU Ý KHI THỰC HIỆN KỸ THUẬT PCR, CẤU TẠO MÁY PCR
Các vấn đề cần lưu ý thực hiện với kỹ thuật PCR
1.1 Các vấn đề kỹ thuật cần quan tâm khi lấy và gửi mẫu.
Mẫu thử được lấy làm xét nghiêm PCR là mẫu được lấy từ vật chủ tại nơi mà người lấy mẫu cho là có thể có sự hiện diện của nucleic acid của tác nhân đích.
Giữ và chuyên chở mẫu thử đến phòng thí nghiệm trong điều kiện sao cho nucleic acid muốn tìm không bị phân hủy cũng như mẫu thử không bị nhiễm các chất sinh học gây ức chế phản ứng khuếch đại và mẫu thử không bị nhiễm chéo.
1.2 Các vấn đề kỹ thuật trong chuân bị mẫu thử và tách chiếc nucleic acid.
Tách chiếc được tối đa nuceic acid đích dù lượng lượng nucleic acid của tác nhân đích có nhỏ và bị pha lõng quá thấp trong mẫu thử.
Tách chiếc thu được phải tinh khiết, không lẫn các protein hay chất gây ức chế phản ứng khuếch đại.
Tùy thuộc vào loại tác nhân đích (vi khuẩn, virus, vi nấm hoặc tế bào có nhân) và loại axit nucleic cần chiết xuất (DNA hay RNA), cần lựa chọn phương pháp chiết xuất phù hợp để tránh xảy ra tình trạng lẫn tạp chất.
1.3 Các vấn đề kỹ thuật trong khuếch đại nucleic acid đích.
Về nguyên tắc thì phản ứng PCR đạt được độ nhạy rất cao, tuy nhiên trên thực tế thì độ nhạy còn tùy thuộc rất nhiều vào sự thiết kế hay chọn lựa mồi; và thiết bị luân nhiệt; hóa chất; và đặc biệt là enzyme Taq polymerase được sử dụng.
Kiểm tra độ nhạy của các PCR mix là một quy trình quan trọng để đánh giá hiệu suất của hỗn hợp phản ứng khuếch đại Thủ tục này liên quan đến việc thử nghiệm các pha loãng khác nhau của DNA đích trong PCR mix để xác định nồng độ DNA tối thiểu có thể được khuếch đại một cách đáng tin cậy Bằng cách tối ưu hóa độ nhạy của PCR mix, các nhà nghiên cứu có thể cải thiện độ đặc hiệu và hiệu quả của phản ứng khuếch đại, đảm bảo kết quả đáng tin cậy và chính xác.
Kiểm soát được độ nhạy của PCR mix được sử dụng trong mỗi lần làm xét nghiệm. 1.4 Ngừa nhiễm chéo và loại trừ ngoại nhiễm sản phẩm khuếch đại
Muốn sử dụng PCR trong chuẩn đoán, người làm xét nghiệm phải nhận diện được để có các biện pháp kỹ thật ngăn ngừa hay loại trừ nguy cơ ngoại nhiễm làm cho mẫu thử không có tác nhân đích lại bị có kết quả dương tính khi làm xét nghiệm, nghĩa là bị nguy cơ dương tính giả.
1.5 Các vấn đề kỹ thuật trong thử nghiệm điện di trên thạch để đọc kết quả. Đối với phương pháp PCR cổ đển thì muốn đọc được kết quả, người làm thí nghiệm phải làm tiếp thí nghiệm để xác định được trong ống phản ứng có sản phẩm khuếch đại đặc hiệu đặc hiệu hay không Phương pháp thường được áp dụng nhất trong các phòng thí nghiệm PCR chẩn đoán là dùng kỹ thuật điện di để xác định kích thước sản phẩm khuếch đại có đúng như kích thước mong muốn hay không.
Trong một kết quả điện di chuẩn mực cho PCR chẩn đoán còn cần phải có một giếng cho chứng [+] để so sánh kích thước của sản phẩm khuếch đại trong vạch điện di từ các giếng chứa mẫu, và một giếng cho chứng âm để chứng minh quá trình làm xét nghiệm PCR chẩn đoán không bị ngoại nhiễm.
Cấu tạo của máy PCR
2.1 Cấu tạo của máy PCR hiện đại:
Bao gồm: màn hình, bàn phím, vi mạch điều khiển,…
Hình 1.1: Màn hình và bàn phím Hình 1.2: Vi mạch điều khiển
Bộ phận điều khiển đóng vai trò là một bộ phận giao tiếp với người dùng, giúp thiết lặp chương trình và điều khiển hoạt động của thiết bị.
Bao gồm: Biến áp, cầu chì, tụ điện, điện trở, diot,…
Hình 1.3: Biến áp Hình 1.4: Cầu chì Nguồn điện đóng vai trò chuyển đổi dòng điện xoay chiều 220V thành dòng điện một chiều với nhiều mức điện áp khác nhau để cung cấp cho các bộ phận khác nhau của thiết bị.
Bao gồm: nắp nhiệt, block nhiệt, bộ phận gia nhiệt, quạt tản nhiệt, cảm biến nhiệt,…
Hình 2.7: Cấu tạo nắp nhiệt
Bao gồm: điện trở, cảm biến nhiệt,…Nắp nhiệt đóng vai trò gia nhiệt cho phần nắp của tube PCR giúp ngăn cản quá trình bay hơi và ngưng tụ gây hao hụt thể tích phản ứng
Hình 2.8: Bộ phận gia nhiệt Hình 2.9: Quạt tản nhiệt
Bộ phận luân nhiệt đóng vai trò thay đổi nhiệt độ phản ứng liên tục theo chu trình nhiệt được thiết lập.
Nguyên lý cặp nhiệt điện
Thomas Johann Seebeck phát hiện ra rằng hai dây dẫn khác loại nối với nhau và đặt ở hai nhiệt độ khác nhau (tức là có gradient nhiệt) thì tạo ra một điện áp Sự chênh nhiệt dẫn đến dòng nhiệt truyền, làm khuếch tán các hạt mang điện Dòng chảy của các hạt mang điện giữa các vùng nóng và lạnh lại tạo ra một điện áp khác nhau.
Hình 2.10: Nguyên lý cặp nhiệt điện
Jean Charles Athanase Peltier phát hiện ra hiệu ứng ngược lại, rằng một dòng điện chạy qua mối nối nhau của hai dây dẫn khác loại nhau, thì tùy thuộc vào chiều dòng điện, làm cho nó hoạt động như một phần tử làm nóng hoặc làm mát Hiệu ứng được gọi là hiệu ứng Peltier và Bơm nhiệt Peltier hoạt động theo hiệu ứng này.
Các công nghệ được áp dụng phổ biến ở máy PCR
4.1 Công nghệ gradient nhiệt độ:
Block nhiệt được cấu tạo từ 2 sò nóng lạnh trở lên Nhiệt độ trên block được phân bố theo dải gradient hoặc từng vùng riêng biệt Lắp sò ở hai đầu ở hai nhiệt độ khác nhau, nhiệt độ trên block được phân bố theo dải gradient nên khảo sát một lúc 12 nhiệt độ khác nhau. Một con sò thiết lặp được một nhiệt độ, thời gian PCR là 2 tiếng.
Hình 2.12: Công nghệ gradient nhiệt độ 4.2 Công nghệ PCR nhiều vùng nhiệt, nhiều block nhiệt:
Nhiều vùng nhiệt: block nhiệt được cấu tạo từ nhiều Peltier Công nghệ này giúp cài đặt nhiệt độ riêng biệt cho từng vùng trên block.
Nhiều block nhiệt: máy PCR có nhiều block nhiệt riêng biệt, có thể hoạt động độc lập như nhiều máy PCR
Hình 2.13: Máy PCR màn Hình 2.14: Vùng nhiệt hình cảm ứng
THIẾT KẾ PRIMERS VÀ XÁC ĐỊNH CÁC THÀNH PHẦN XÂY DỰNG PHẢN ỨNG PCR, CHƯƠNG TRÌNH NHIỆT
Phản ứng PCR
PCR là một trong những phát minh quan trọng nhất của thế kỉ 20 Phản ứng này nhằm sao chép tạo ra một lượng lớn phân tử ADN đích, giúp xác định, và phát hiện các mầm bệnh lây nhiễm như HIV, viêm gan hoặc phát hiện các thay đổi về mặt di truyền như đột biến PCR được thực hiện thông qua 3 bước: biến tính (denaturing), gắn mồi (annealing), và kéo dài chuỗi (extending) ADN được sử dụng làm khuôn có cấu trúc xoắn kép, khi bị biến tính bởi nhiệt nó tách ra thành 2 mạch đơn, một mạch mang nghĩa (sense) và một mạch đối nghĩa (antisense) Khi nhiệt độ hạ xuống đến nhiệt độ gắn mồi, một mồi sẽ gắn đặc hiệu vào mạch mang nghĩa trong khi một mồi khác sẽ gắn vào mạch đối nghĩa Trong đó, mồi là các trình tự oligonucleotide ngắn có thể bám đặc hiệu vào một vùng trình tự nhất định Mồi sẽ là điểm khởi đầu để các polymerase có thể thực hiển tổng hợp mạch bổ sung mới cũng như xác định đoạn ADN được khuếch đại Do đó, việc thiết kế mồi sẽ quyết định mức độ đặc hiệu và năng suất của phản ứng.
Thiết kế Primer
2.1 Nguyên tắc thiết kế mồi:
1 Độ dài của mồi: Nên nằm trong khoảng từ 15-30 base, độ dài tối ưu là khoảng từ 18-22 base Điều này phụ thuộc vào việc mồi cần đủ dài để gắn đặc hiệu và đủ ngắn để có thể gắn dễ dàng vào khuôn tại nhiệt độ gắn mồi.
Hình 2.2: Hai mạch của ADN
2 Đầu 3’ và 5’ của mồi: Cần thiết kế sao cho đầu 3’ của mồi xuôi sẽ mở rộng về phía mồi ngược và đầu 3’ của mồi ngược sẽ mở rộng về phía mồi xuôi khi được gắn vào 2 mạch bổ sung Nếu ngược lại thì sản phẩm PCR sẽ không thể được tạo ra.
3 Nhiệt độ nóng chảy của mồi Tm Điểm nhiệt độ này được định nghĩa là điểm nhiệt mà : tại đó 50% sợi đôi ADN phân tách nhau và tạo sợi đơn Điểm nhiệt này rất quan trọng ở pha gắn mồi, Tm nên nằm trong khoảng 50-65oC Nhiệt độ nóng của mồi trên 65 độ dễ dẫn đến xu hướng mồi gắn không chính xác Nhiệt độ Tm của hai mồi không chênh lệch nhau quá 2oC, nhiệt độ chênh lệch quá 5oC có thể không thể tạo ra được sản phẩm Công thức tính Tm như sau:
Công thức đơn giản: Tm=4°C x (G + C) + 2°C x (A + T)
Công thức chứa nồng độ muối: Tm = 81.5 +16.6 x (log10[Na+]) + 0.41 (%(G+C)) – 675/n
Trong đó: [Na+] là nồng độ phân tử muối, n là số base của mồi.
4 Nhiệt độ gắn mồi (Ta): Được tính dựa vào nhiệt động nóng chảy của mồi Nhiệt độ gắn mồi thấp có thể dẫn đến lượng sản phẩm PCR được tạo ra thấp, do không đủ số lượng phức hợp lai giữa mồi và khuôn Ngược lại, sản phẩm không đặc hiệu sẽ được tạo ra nhiều nếu nhiệt độ gắn mồi quá thấp Người ta thường tính nhiệt độ gắn mồi theo công thức sau:
Ta = 0.3 x Tm(Mồi) + 0.7 Tm (sản phẩm) – 14.9
5 Mật độ GC Ảnh hưởng đến Tm, do đó mật độ GC nên nằm trong khoảng 50 – 60%.:
6 Kẹp GC: Nên có ít nhất một G hoặc C ở đầu 3’ của mồi để giúp cho đầu 3’của mồi liên kết mạnh hơn Tuy nhiên nên tránh việc trong 5 base đầu 3’ có nhiều hơn 3 G hoặc C do có thể gây liên kết đầu 3’ quá mạnh khiến mồi bắt cặp không đặc hiệu.
7 Lưu ý cấu trúc bậc 2 trong thiết kế mồi. a) Hình thành hiện tượng kết cặp (dimer): Là hiên tương mồi thay vì gắn vào khuôn sẽ gắn vào mồi ngược với nó hoặc với chính nó, tạo ra các sản phẩm PCR có kích thước nhỏ và làm giảm lượng mồi bắt cặp với khuôn Do đó cần tránh tạo ra hiện tượng kết cặp Hình thành dimer giữa hai mồi: b) Cấu trúc kẹp tóc: có thể được hình thành bởi sự tương tác bên trong chính đoạn mồi Cần tránh điều này vì làm giảm hiệu quả của phản ứng PCR.
8 Lặp: là hiện tượng lặp lại nhiều lần trong trình tự mồi của trình tự đôi (VD:
ATATATATAT) hoặc đơn (VD: GGGGG) Điều này có thể gây bắt cặp nhầm do đó số lần lặp tối đa của một mồi là 4 lần lặp cho cả hai trường hợp.
9 Tương đồng chéo: Là hiện tượng mà cặp mồi sẽ khuếch đại một gene khác có trong hỗn hợp ban đầu Để tránh hiện tượng này, mồi sau khi thiết kế cần được đưa lên BLAST để so sánh và kiểm tra độ đặc hiệu.
Vật liệu nghiên cứu và phương pháp thực hiện
Thành phần phản ứng PCR:
DNA mẫu (template) chứa mảnh DNA cần khuếch đại.
Cặp mồi (primer) là các đoạn DNA ngắn (dưới 50bp) để xác định điểm bắt đầu và kết thúc vùng cần khuếch đại.
DNA-polymerase enzym xúc tác cho việc nhân lên của DNA.
Nucleotides (dNTP) là nguyên liệu cho DNA-polymerase tổng hợp DNA mới.
Dung dịch đệm, cung cấp môi trường hóa học cho DNA-polymerase.
Phản ứng PCR được thực hiện trong chu kỳ nhiệt gồm các bước:
Bước 1: Khởi đầu: Đun hỗn hợp ở 96 °C trong vòng 5 phút để đảm bảo sợi DNA cũng như mồi được làm nóng.
Quá trình nhân đôi ADN diễn ra theo nguyên tắc bổ sung và bán bảo toàn Bước 2: biến tính, DNA khuôn được tách thành 2 sợi đơn, tạo điều kiện cho quá trình tổng hợp Bước 3: gắn mồi, mồi gắn vào DNA khuôn ở vị trí có trình tự bổ sung, tạo điểm khởi đầu cho quá trình sao chép.
Bước 4: Kéo dài (Elongation): Các nucleotide được gắn vào chuỗi theo nguyên tắc bổ sung với DNA khuôn.
Bước 5: Lặp lại bước 2-4 (số lần lặp lại là số chu trình nhiệt, tùy thuộc vào từng loại phản ứng PCR).
Chương trình nhiệt cho phản ứng PCR
Một chu kỳ nhiệt của PCR sẽ gồm 3 giai đoạn nhiệt độ (Hình 1):
1 - Giai đoạn biến tính: Nhiệt độ sẽ được đưa lên 94 oC, các liên kết hydro sẽ bị phá vỡ khiến DNA bị biến tính trở thành dạng mạch đơn.
2 - Giai đoạn bắt cặp: Nhiệt độ được hạ xuống 55 - 65 oC, các đoạn mồi sẽ bắt cặp bổ sung vào 2 đầu trình tự mục tiêu.
3 - Giai đoạn kéo dài: Nhiệt độ được đưa lên 72 oC, Taq polymerase sẽ sử dụng dNTP để kéo dài đầu 3' của mồi và tạo ra mạch bổ sung.
Hình 2.3: Chu trình nhiệt của một quy trình PCR
Như vậy, cứ qua một chu kỳ nhiệt, số mạch DNA sẽ được nhân đôi Nếu chu kỳ nhiệt lặp lại liên tục 30 - 40 lần thì số bản sao sẽ là 230 ~ 240 bản sao Số lượng bản sao DNA khổng lồ này khi được gắn các phân tử phát tín hiệu (ví dụ Ethidium Bromide) có thể nhìn thấy bằng mắt thường trên gel điện di dưới ánh đèn UV
ĐIỆN DI VÀ PHÂN TÍCH KẾT QUẢ
Tổng quan tài liệu
Kỹ thuật điện di trên gel là kỹ thuật sử dụng để phân tích các nucleic: DNA, RNA và protein.
Các loại phân tử được phân tách với nhau dựa trên tốc độ di chuyển của chúng trên một loại môi trường bán rắn là gel.
Thông thường đối với DNA là Gel Agarose: xác định độ hiện diện cũng như kích thước của sản phẩm PCR; còn đối với RNA và protein, thường sử dụng Acrylamide do nó có độ phân giải cao hơn.
Sự di chuyển của các phân tử được tạo ra bởi từ trường, các phân tử có kích thước lớn sẽ di chuyển chậm hơn và ngược lại DNA di chuyển từ cực âm (-) sang cực dương (+) Tốc độ di chuyển của DNA phụ thuộc vào: lực của điện trường, thành phần buffer, nồng độ gel, kích thước phân tử DNA.
Hai loại Buffer solution thường sử dụng trong kỹ thuật điện di: TBE và TAE.
TBE: Phân tách tốt các sản phẩm PCR có kích thước dưới 2kb, phù hợp để điện di phát hiện sản phẩm PCR cho các bệnh thông thường hoặc các gen mong muốn.
- Ưu điểm: Thời gian dài không bị nóng gel.
- Nhược điểm: Muối borat sẽ làm ức chế hoạt động của enzyme, ví dụ như enzyme cắt nối… làm giảm tỷ lệ thu hồi DNA từ gel
-> nếu sử dụng cho ứng dụng về sau thì không nên dùng.
TAE: Điện di những sản phẩm có kích thước lớn.
- Ưu điểm: Buffer có thành phần muối acetate không ảnh hưởng, tác động đến những ứng dụng về sau
-> có thể lấy sản phẩm PCR trong gel điện di để cloning tạo dòng.
- Nhược điểm: Trong thời gian dài dễ xảy ra hiện tượng nóng gel -> ko nên kéo dài thời gian với điện thế lớn.
1.2 Các loại chất nhuộm DNA:
Chứ c năng chất nhuộm được sử dụng nhiều nhất trong kỹ thuật điện di
DNA trên gel agarose Chất nhuộm này rất rẻ, có thể phát hiện được 1 ng DNA trên 1 băng và có thể được sử dụng trước hoặc sau quá trình điện di. chất nhuộm axit nucleic huỳnh quang siêu nhạy, cực kỳ ổn định và an toàn với môi trường được thiết kế để thay thế ethidium bromide (EtBr) độc hại cao ( gây ung thư) để nhuộm dsDNA, ssDNA hoặc RNA trong gel agarose hoặc gel thuốc nhuộm huỳnh quang nucleic acid trên gel, bền vững và thân thiện với môi trường GelGreen nhạy hơn SYBR và bền với cả nhiệt phân và thủy phân chất phát huỳnh quang khi gắn vào DNA sợi đôi. Trong phản ứng PCR, DNA polymerase khuếch đại DNA đích tạo nên sản phẩm là các DNA sợi đôi Sản phẩm PCR càng nhiều thì cường độ huỳnh quang phát ra càng cao. Hình 3.1 Thiết bị điện di polyacrylamide. Ánh sáng phát ra ánh sáng huỳnh quang màu cam đỏ phát ra ánh sáng huỳnh quang màu cam đỏ nguồn sáng kích thích màu xanh dương nguồn sáng kích thích màu xanh dương
Mục tiêu
Xác định mẫu DNA của con cừu có trong các tube được chuẩn bị sẵn.
Vật liệu và phương pháp thực hiện
Bộ cung cấp nguồn điện (power source)
Bồn điện di (gel box)
Khay gel (casting tray), lược gel (combs)
Dung dịch đệm điện di (TAE hoặc TBE)
GelRed (Loading dye + sample dye).
Sau khi thu được sản phẩm ly trích, có thể tiến hành kiểm tra kết quả ly trích bằng phương pháp điện di trên agarose dựa trên đặc tính tích điện âm của DNA, vì vậy, khi được đặt vào điện trường trong dung dịch có pH trung tính, DNA sẽ bị hút về cực dương và bị đẩy khỏi cực âm.
Trong quá trình điện di, các phân tử DNA sẽ được phân loại theo kích thước, các phân tử sẽ bị hút về cực dương trước do các phân tử nhỏ đi qua lỗ gel dễ dàng hơn Có thể nói khoảng cách mà đoạn DNA đi qua sẽ tỉ lệ nghịch với trọng lượng phân tử của nó.Thông qua bước điện di kiểm tra kết quả ly trích có thể cho ta biết được độ nguyên vẹn cao DNA khi các băng DNA gọn, tập trung và rõ nét Qua kiểm tra độ nguyên vẹn của DNA cũng xác định được mức độ tinh sạch của sản phẩm DNA ly trích được.
Kết quả và kết luận
Hình 3.2: Quy trình thao tác thực hiện trộn mẫu PCR với thuốc nhuộm
Hình 3.3: Kết quả sau khi điện di
So đối đối chứng dương có chứa DNA của con cừu và đối chứng âm không chứa DNA của con cừu đường đưa ra thì ta có thể kết luận rằng mẫu chứa trong tube nhóm đã nhận được không chứa DNA của con cừu.
REAL TIME PCR
Tổng quan
1.1 Cấu tạo máy và nguyên lý hoạt động:
-Khái niệm Real-Time PCR (RT-PCR) là phản ứng PCR mà quá trình nhân bản DNA: được diễn ra theo từng chu kỳ nhiệt được theo dõi trực tiếp Hay nói cách khác, RT-PCR gồm hai quá trình diễn ra đồng thời đó là nhân bản DNA bằng phản ứng PCR và đo độ phát huỳnh quang tỷ lệ thuận với số lượng đoạn DNA tạo thành.
-Bằng cách nào để có tín hiệu Real Time phản ứng PCR đang diễn ra?
Ngoài những thành phần cơ bản trong một phản ứng PCR thì kỹ thuật RT-PCR còn có thêm chất phát tín hiệu huỳnh quang để có thể quan sát quá trình phản ứng diễn ra. Những chất phát huỳnh quang có thể là phẩm nhuộm hoặc probe phát huỳnh quang. -Phẩm nhuộm (Ethidium Bromide và SYBR Green):
Phẩm nhuộm khi chèn vào DNA sợi đôi sẽ phát huỳnh quang mạnh hơn khi ở trạng thái tự do: Ethidium Bromide sáng gấp 25 lần, SYBR Green sáng gấp 200 lần.
Hình 3.4: Kết quả mẫu của nhóm so với mẫu đối chứng âm và mẫu đối chứng dương
Ethidium Bromide là thuốc nhuộm DNA/RNA được sử dụng khá phổ biến Nó có khả năng tự mình chèn vào giữa base nito của sợi xoắn kéo DNA và có độ hấp thụ cực tím ở mức 300nm và 360nm EtBr phát ra ánh sáng vàng/cam xung quanh bước sóng 590nm.
Nó có khả năng phát hiện DNA rất nhạy, tuy nhiên lại là chất gây đột biến tiềm tàng và có độc tính Do đó nếu sử dụng Ethidium Bromide cần hết sức cẩn thận trong quy trình nhuộm và xử lý chất thải.
SYBR® Green là dye báo cáo bám mạch đôi ADN được sử dụng phổ biến nhất SYBR® Green bám vào rãnh nhỏ (minor groove) của chuỗi xoắn kép DNA Trong dung dịch, các dye không bám sẽ phát tín hiệu rất thấp Tín hiệu huỳnh quanh được tăng cường đáng kể khi dye bám vào mạch đôi ADN.
-Probe phát huỳnh quang (TaqMan)
Sonda Taqman là đoạn oligonucleotide dài 24-30bp, có gắn chất phát huỳnh quang (reporter) ở đầu 5' và chất hấp thụ (quencher) ở đầu 3' Khi sonda Taqman còn nguyên vẹn, quencher sẽ hấp thụ ánh sáng huỳnh quang của reporter Khi phản ứng PCR diễn ra, Taq polymerase sẽ cắt mẫu dò bằng hoạt tính 5'-3' exonuclease, reporter được giải phóng và phát tín hiệu huỳnh quang mà không bị quencher hấp thụ.
Mẫu dò Taqman thường được gắn cách mồi một đoạn dài ngắn hơn 10 nucleotide Ngoài ra, mồi trong phản ứng Real-Time PCR thường có nhiệt độ nóng chảy khoảng 55-60 và thấp hơn mẫu dò Taqman khoảng 5-10 để đảm bảo mẫu dò luôn bắt cặp trước.
Hình 4.2: Cơ chế phát tín hiệu của SYBR Green và Taqman
1.1.1 Cấu tạo máy Real Time PCR
Thực chất, hệ thống Real-Time PCR gồm máy luân nhiệt (PCR) được nối với máy quang phổ huỳnh quang và máy vi tính.
Hình 4.2: Cấu tạo cơ bản của một hệ thống Real-Time PCR
Máy luân nhiệt trong hệ thống RT-PCR có cấu trúc tương tự máy PCR thông thường, bao gồm 3 bộ phận chính: bộ điều khiển, nguồn điện và bộ luân nhiệt.
Nguồn sáng để tạo ra bức xạ cần thiết, có thể là đèn xenon hoặc nguồn cảm ứng laser.
Bộ phận đơn sắc hoá: gồm 2 phần đơn sắc hoá bức xạ kích thích (trước buồng đo) và bức xạ huỳnh quang (sau buồng đo).
Buồng đo: được bố trí sao cho phương nguồn sáng và phương thu tín hiệu vuông góc với nhau Để tăng tín hiệu đến bộ thu nhận người ta bố trí thêm gương đối diện.
Máy vi tính đóng vai trò giao tiếp với người dùng, hiển thị kết quả, giao diện quan sát, phân tích kết quả phản ứng PCR.
Theo cấu tạo của từng dòng máy RT-PCR sẽ sử dụng những loại tube tương ứng Về số lượng có thể phân loại thành tube đơn, strips 8 tube hoặc plates 96 giếng Về màu sắc tube có thể chia thành: tube trong suốt (clear tube), tube mờ (frosted tube) và tube trắng (white tube).
Hình 4.3: Các loại tube sử dụng cho realtime PCR
1.1.2 Nguyên lý hoạt động của Real-Time PCR (sử dụng Taqman Probe)Quy trình thực hiện kỹ thuật RT-PCR cũng theo nguyên tắc thông thường của phản ứng tổng hợp chuỗi Tuy nhiên, đặc điểm khác biệt chính là đoạn DNA được nhân lên sẽ được phát hiện tại mỗi thời điểm diễn ra phản ứng (real time) Cụ thể ở đây nhóm sẽ đề cập đến nguyên lý hoạt động của RT-PCR sử dụng Taqman probe.
Trong kỹ thuật này, real-time PCR mix ngoài các thành phần cơ bản của PCR mix, còn chứa hai thành phần quan trọng để probe có thể phát huỳnh quang khi có sự hiện diện của sản phẩm khuếch đại đặc hiệu từ DNA đích, đó là: Taqman probe và enzyme Taq polymerase có hoạt tính 5’-3’ exonuclease Khi chưa có sự xuất hiện của sản phẩm khuếch đại đặc hiệu từ DNA đích thì Taqman probe vẫn còn nguyên vẹn do vậy mà huỳnh quang phát ra được từ reporter ở đầu 5’ sẽ bị quencher ở đầu 3’ của probe hấp thụ,ống thử nghiệm sẽ không phát được huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích.Khi bắt đầu có sự xuất hiện sản phẩm khuếch đại đặc hiệu thì Taqman probe sẽ bắt cặp vào sợi khuôn của sản phẩm này ở giai đoạn nhiệt độ bắt cặp và sẽ bị enzyme Taq polymerase cắt bỏ để kéo dài mồi tổng hợp nên sợi bổ sung, do vậy mà reporter củaTaqman probe sẽ bị cắt rời xa quencher và phát được huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích Càng nhiều sản phẩm khuếch đại xuất hiện thì số lượng reporter tự do sẽ càng nhiều, đến một lúc nào đó cường độ huỳnh quang phát ra từ reporter đủ mạnh thì máy sẽ ghi nhận được tín hiệu huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng khi nhận được nguồn sáng kích thích.
Phân tích kết quả
Hình 4.4: Cường độ huỳnh quang của chu trình phản ứng RT-PCR Biểu đồ cường độ huỳnh quang của chu trình phản ứng Real Time PCR thường sẽ có 3 giai đoạn: giai đoạn ủ, giai đoạn luỹ thừa và giai đoạn bình nguyên Giai đoạn ủ là giai đoạn chưa có chuỗi mới được tổng hợp hoặc lượng DNA được tổng hợp còn quá ít, chưa đủ tín hiệu huỳnh quang để máy thu nhận Giai đoạn luỹ thừa là giai đoạn có số lượng DNA và tín hiệu huỳnh quang tăng nhanh Cuối cùng là giai đoạn bình nguyên, tại đây một số thành phần của phản ứng đã hết nên không có DNA nào được tạo ra.
2.2 Định lượng và định tính sản phẩm RT-PCR
Thời điểm có thể định lượng tương đối chính xác là thời điểm đạt chu kỳ ngưỡng (Ct) Chu kỳ ngưỡng là thời điểm mà tín hiệu huỳnh quang vượt ngưỡng tín hiệu nền rõ ràng Số lượng bản đích DNA ban đầu càng nhiều thì thời điểm (Ct) phát hiện tín hiệu sản phẩm khuếch đại càng sớm Ngược lại, mẫu thử chứa ít bản đích ban đầu sẽ có chu kỳ ngưỡng phát hiện muộn hơn Để định lượng tuyệt đối, cần xây dựng đường chuẩn: y = ax+b, trong đó y là giá trị chu kỳ ngưỡng, x là số bản sao.
Số copies Để xây dựng đường chuẩn thì phải có ít nhất 5 điểm được xác định dựa trên chu kỳ ngưỡng và số copies Ngoài ra cần phải có mẫu chuẩn đã biết chính xác số copies, mẫu chuẩn này có thể mua hoặc tự tạo ra bằng cách nuôi cấy E.coli.
Một trong những cải tiến rõ ràng nhất của RT-PCR so với PCR đó chính là ngoài định lượng, thì RT-PCR còn có thể định tính dựa vào phương pháp phân tích đường cong nóng chảy Nhiệt độ nóng chảy (Tm) đặc trưng cho kích thước và thành phần của DNA. Trong chu trình phản ứng RT-PCR, sẽ có trường hợp DNA đích và các primer dimer cùng phát quang (do chúng đều là DNA sợi đôi), để định tính được hai thành phần này thì ta có thể căn cứ vào nhiệt độ nóng chảy, các primer dimer thường có Tm thấp ( chỉ khoảng 60- 70), trong khi DNA đích có Tm cao hơn, khác biệt rõ ràng ( khoảng 75-90) Cho nên hoàn toàn có thể dựa vào phương pháp xác định đường cong nóng chảy để định tính sản phẩm mà không cần phải thực hiện thêm phản ứng nào khác.
Công thức tính hàm lượng DNA sợi đôi:
Hàm lượng DNA sợi đôi (= OD260 Độ pha loãng 50
Dung dịch acid nucleic được xem là sạch khi tỉ lệ OD260/280 nằm trong khoảng 1,8-2,0 OD260/280 của RNA thường cao hơn DNA.
HỆ THỐNG VI THAO TÁC
Cấu tạo máy kéo kim
- Dùng để kéo kim bằng nhiệt độ tạo đầu nhọn
Cấu tạo máy rèn kim
- Tạo đầu thích hợp trong vi thao tác Vi trí ki
KỸ THUẬT ELISA
Khái quát về kháng thể và kháng nguyên
Kháng thể hay còn là globulin miễn dịch (Ig) để phân biệt khả năng gắn với tế bào, phân tử Kháng thể là một protein lớn, hình chữ Y được hệ thống miễn dịch sử dụng để xác định và vô hiệu hóa các vật thể lạ như vi khuẩn và virus gây bệnh Kháng thể nhận ra một phân tử đặc trưng duy nhất của mầm bệnh, được gọi là kháng nguyên Mỗi đầu chữ "Y" của kháng thể chứa một paratope (tương tự như một ổ khóa) đặc hiệu cho một epitope cụ thể (tương tự như một khóa) trên một kháng nguyên, cho phép hai cấu trúc này liên kết với nhau một cách chính xác Sử dụng cơ chế liên kết này, kháng thể có thể gắn thẻ vào vi khuẩn hoặc tế bào bị nhiễm để các bộ phận khác của hệ thống miễn dịch tấn công hoặc có thể vô hiệu hóa trực tiếp chúng (ví dụ: bằng cách ngăn chặn một phần của virus mà cần thiết cho sự tấn công cơ thể của nó).
Hình 6.1 Kháng thể và kháng nguyên
Kháng thể là protein hình chữ Y có cấu trúc ba vùng hình cầu, mỗi vùng có đường kính khoảng 10 nm Ở người và động vật có vú, một đơn vị kháng thể được tạo thành từ hai chuỗi polypeptide nặng giống hệt nhau (H) và hai chuỗi polypeptide nhẹ giống hệt nhau (L), được liên kết với nhau bằng liên kết disulfua.
Hình 6.3: Cấu trúc kháng thể
Kháng nguyên (antigen) là những chất khi xâm nhập vào cơ thể người thì được hệ thống miễn dịch nhận biết và sinh ra các kháng thể tương ứng Đây có thể là kháng thể dịch thể hoặc kháng thể tế bào có đặc tính kết hợp đặc hiệu hoặc kích thích đáp ứng miễn dịch với kháng nguyên ấy. Đáp ứng này có thể dương tính hoặc âm tính Đáp ứng dương tính nghĩa là cơ thể sinh globulin miễn dịch chống lại, kháng nguyên đã kích thích cơ thể sản xuất ra kháng thể đó. Đáp ứng âm tính là trạng thái khi cơ thể tiếp xúc với kháng nguyên, cơ thể dung nạp với kháng nguyên đó, nghĩa là các tế bào miễn dịch đã không đáp ứng để tạo ra kháng thể Trạng thái này rất quan trọng trong việc cơ thể chấp nhận hay loại trừ các kháng nguyên sau khi xâm nhập vào cơ thể.
Epitop là bộ phận trên phân tử kháng nguyên tương tác với kháng thể hoặc thụ thể miễn dịch Kích thước epitop đa dạng, từ vài phân tử đường đến dạng hapten nằm sâu trong vị trí gắn kháng nguyên Một kháng nguyên có thể chứa nhiều epitop, dẫn đến phản ứng chéo giữa các kháng nguyên chia sẻ epitop Mỗi epitop có thể liên kết với nhiều kháng thể, nhưng mức độ ái lực khác nhau do cấu trúc không gian của các tương tác Nói chung, kháng nguyên lớn thường có nhiều epitop hơn.
Các kỹ thuật ELISA
Định nghĩa: ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assa), là một kỹ thuật sinh hóa phát hiện sự hiện diện của một kháng thể hoặc kháng nguyên trong một mẫu bằng phản ứng miễn dịch đặc hiệu Cụ thể, kháng nguyên/ kháng thể (Tùy loại kỹ thuật ELISA) được phủ lên bề mặt giếng, sau đó thêm một kháng thể đặc hiệu đã liên kết với một loại enzyme, và cuối cùng thêm cơ chất để enzyme phân giải cơ chất sinh ra chất mang màu.
- Kỹ thuật ELISA trực tiếp.
- Kỹ thuật ELISA gián tiếp.
- Kỹ thuật ELISA sandwich: là một loại ít phổ biến của kỹ thuật ELISA nhưng cho độ nhạy cao.
ELISA sandwich định lượng kháng nguyên giữa hai lớp kháng thể (kháng thể bắt- capture và phát hiện- detection) Các kháng nguyên được định lượng phải chứa ít nhất hai epitope kháng nguyên có khả năng liên kết với 2 kháng thể.
Các kháng thể đơn dòng hoặc đa dòng đều có thể được sử dụng như là các kháng thể bắt và kháng thể phát hiện trong hệ thống ELISA sandwich.
- Kỹ thuật ELISA cạnh tranh: là quá trình gắn cạnh tranh kháng nguyên gốc (kháng nguyên mẫu) và kháng nguyên được thêm vào (Inhibitor Antigen) (kháng nguyên trong chuẩn, trong mẫu ) để gắn vào một kháng thể được đánh dấu xác định.
Hình 6.4: Các kỹ thuật ELISA
3 Vật liệu nghiên cứu và phương pháp thực hiện:
Thực hiện một xét nghiệm ELISA liên quan đến ít nhất một kháng thể có tính đặc hiệu với một kháng nguyên cụ thể Mẫu thử với một hàm lượng không xác định kháng nguyên trên một chất mang rắn (thường là một giếng vi thể bằng polystyrene) được cố định hoặc theo cách không đặc hiệu (thông qua hấp thu bề mặt) hoặc theo cách đặc hiệu (thông qua sự bắt giữ bởi kháng thể đặc hiệu khác cho cùng kháng nguyên.
- Đĩa giếng ELISA pha rắn
Thông thường, đĩa ELISA có 96 giếng, thường là polystyrene hoặc các dẫn xuất của polystyrene Chỳng được chia thành 8 hàng và 12 cột Thể tớch mỗi giếng khoảng 350 àl.
Phương pháp này bao gồm đánh dấu bằng các tác nhân phản ứng ở một đầu, sau đó là quá trình thanh lọc Một trong những khía cạnh tiêu cực của kỹ thuật này nằm ở sự phức tạp to lớn của nó và trong việc sử dụng các hóa chất gây nguy hiểm cho người dùng Sự cố hóa học được gây ra bởi việc áp dụng DMS, axit formic, hydrazine và hydrazine với muối.
Quy trình giải trình tự DNA bắt đầu bằng việc gắn nhãn đầu 5' của sợi DNA bằng phốt pho-32 Sự biến đổi hóa học sau đó diễn ra ở các bazơ nito, dẫn đến sự tách thành các vùng abasic Chuỗi DNA được cắt thành các đoạn nhỏ hơn bằng enzyme cắt giới hạn, sau đó nhóm phốt phát được loại bỏ bằng phản ứng với phosphatase kiềm Quá trình ghi nhãn tiếp tục bằng cách sử dụng polynucleotide kinase Chuỗi DNA sau đó được biến tính và tiến hành áp dụng các hóa chất để cắt các liên kết cụ thể Các đoạn DNA thu được được phân tách theo kích thước bằng điện di, và trình tự được xác định dựa trên mẫu băng xuất hiện: chỉ có băng A+G thì đọc là A, chỉ có băng G thì đọc là G, chỉ có băng C+T thì đọc là T, có băng C thì đọc là C.
Hình 7.1: Kết quả hệ thống điện di
Sự phát triển của phương pháp Sanger là một sự kiện quan trọng trong sinh học phân tử
Nó liên quan đến các thành phần cơ bản của quá trình sao chép DNA thường xảy ra trong tế bào, nhưng bằng cách thêm một thành phần đặc biệt: dideoxynucleotide.
Thành phần của phản ứng: DNA polymerase tham gia vào quá trình sao chép chuỗi DNA và vai trò của nó là tổng hợp chuỗi mới, phù hợp với deoxyribonucleotides triphosphate với các chuỗi bổ sung Nucleotide: Giải trình tự Sanger bao gồm hai loại nucleotide, bốn 2'-deoxynucleotide (viết tắt là dATP, dGTP, dCTP và dTTP) và bốn dideoxynucleotide (ddATP, ddGTP, ddCTP và ddTTP) Mặc dù dideoxynucleotide tương tự như các monome thường được tích hợp vào DNA, chúng thiếu một nhóm -OH trong cấu trúc của chúng Điều này làm cho không thể thêm một nucleotide mới vào chuỗi
Bốn thử nghiệm được chuẩn bị Mỗi loại chứa DNA được chiết xuất từ mẫu sinh học quan tâm, các nucleotide bình thường và một trong bốn loại nucleotide đặc biệt Hoặc các nucleotide đặc biệt được đánh dấu bằng một số loại dấu huỳnh quang Mồi phải có gốc OH- nhô ra thì các dNTP mới có thể bám vào được, còn nếu chỉ có gốc H thì nu mới không thể bám vào được, dừng tại vị trí đó, tạo thành nhiều đoạn DNA khác nhau. Đọc kết quả: Bước đầu tiên là tách từng chuỗi tổng hợp theo kích thước của chúng Trong phương pháp Sanger, các chuỗi khác nhau được phân tách bằng điện di Do đó, các sợi dài di chuyển ít hơn các biến thể ngắn hơn Sau đó, hệ thống này đi qua một trình đọc nhận ra điểm đánh dấu có trong mỗi dideoxynucleotide Theo cách này, thứ tự của chuỗi có thể được biết Các đoạn DNA có nu kết thúc là dNTP loại nào thì trả kết quả là nu đó
Kỹ thuật giải trình tự DNA theo phương pháp Sanger là kỹ thuật "thế hệ thứ nhất", có khả năng đọc các đoạn DNA ngắn hơn 1 kilobase Tuy nhiên, phương pháp này tốn kém và không hiệu quả cho các dự án giải trình tự quy mô lớn như giải trình tự toàn bộ hệ gen hoặc metagenome.
Hình 7.2: Thiết bị dùng trong phương pháp Sanger
2.1.3 Phương pháp Sanger cải tiến: Ở phương pháp này các nu sẽ được thêm màu sắc để phân biệt và đọc két quả bằng cách thực hiện điện di mao dẫn Các đoạn DNA thường chênh lệch nhau 1 nu.
Cả hai phương pháp Sanger trên đều tiến hành điện di trên một sợi đơn, khi PCR chỉ cần dùng một loại mồi (mồi F hoặc mồi R), không đủ tín hiệu phát huỳnh quang Cho nên cần thêm một bước là PCR đoạn DNA mẫu để tạo ra nhiều DNA hơn (5-10 tỷ) đảm bảo tín hiệu tốt để thu nhận.
Trình tự hai chiều được sử dụng rộng rãi trong giải trình tự DNA vì nó mang lại nhiều lợi ích so với trình tự một chiều Đầu tiên, nó đảm bảo tính chính xác cao hơn bằng cách xác nhận trình tự từ cả hai hướng Thứ hai, nó cho phép giải trình tự các đoạn DNA lớn hơn 1500 nucleotide, vượt quá giới hạn của trình tự một chiều Cuối cùng, trình tự hai chiều giúp giảm nhiễu tín hiệu, dẫn đến kết quả rõ ràng hơn.
2.2 Phương pháp giải trình tự thế hệ 2:
Giải trình tự gen thế hệ mới là công nghệ cho phép giải mã đồng thời hàng triệu trình tự DNA cùng lúc, qua đó giúp nâng cao hiệu suất của quá trình giải mã bộ gen của sinh vật nói chung và hệ gen người nói riêng.
GIẢI TRÌNH TỰ VÀ XỬ LÝ
Các phương pháp giải trình tự
dữ liệu nhấn GET PRIMER và cho kết quả:
Vậy primer cần tìm để phân biệt tomato mottle mosaic virus là:
