MỤC LỤC
Các loại phân tử được phân tách với nhau dựa trên tốc độ di chuyển của chúng trên một loại môi trường bán rắn là gel. Thông thường đối với DNA là Gel Agarose: xác định độ hiện diện cũng như kích thước của sản phẩm PCR; còn đối với RNA và protein, thường sử dụng Acrylamide do nó có độ phân giải cao hơn. Sự di chuyển của các phân tử được tạo ra bởi từ trường, các phân tử có kích thước lớn sẽ di chuyển chậm hơn và ngược lại.
Tốc độ di chuyển của DNA phụ thuộc vào: lực của điện trường, thành phần buffer, nồng độ gel, kích thước phân tử DNA. TBE: Phân tách tốt các sản phẩm PCR có kích thước dưới 2kb, phù hợp để điện di phát hiện sản phẩm PCR cho các bệnh thông thường hoặc các gen mong muốn. - Nhược điểm: Trong thời gian dài dễ xảy ra hiện tượng nóng gel -> ko nên kéo dài thời gian với điện thế lớn.
Chất nhuộm này rất rẻ, có thể phát hiện được 1 ng DNA trên 1 băng và có thể được sử dụng trước hoặc sau quá trình điện di. Sau khi thu được sản phẩm ly trích, có thể tiến hành kiểm tra kết quả ly trích bằng phương pháp điện di trên agarose dựa trên đặc tính tích điện âm của DNA, vì vậy, khi được đặt vào điện trường trong dung dịch có pH trung tính, DNA sẽ bị hút về cực dương và bị đẩy khỏi cực âm. Trong quá trình điện di, các phân tử DNA sẽ được phân loại theo kích thước, các phân tử sẽ bị hút về cực dương trước do các phân tử nhỏ đi qua lỗ gel dễ dàng hơn.
Thông qua bước điện di kiểm tra kết quả ly trích có thể cho ta biết được độ nguyên vẹn cao DNA khi cỏc băng DNA gọn, tập trung và rừ nột. Qua kiểm tra độ nguyờn vẹn của DNA cũng xác định được mức độ tinh sạch của sản phẩm DNA ly trích được. So đối đối chứng dương có chứa DNA của con cừu và đối chứng âm không chứa DNA của con cừu đường đưa ra thì ta có thể kết luận rằng mẫu chứa trong tube nhóm đã nhận được không chứa DNA của con cừu.
Mẫu dò Taqman là một đoạn oligo-nucleotide dài khoảng 24-30bp với đầu 5’ gắn một chất phát huỳnh quang (reporter) và đầu 3’ còn lại gắn chất hấp thụ (quencher). Khi phản ứng PCR diễn ra, mẫu dò sẽ bị Taq polymerase cắt mẫu dò bằng hoạt tính 5’-3’ exonuclease, reporter được giải phóng tín hiệu huỳnh quang không còn bị quencher hấp thu. Ngoài ra, mồi trong phản ứng Real-Time PCR thường có nhiệt độ nóng chảy khoảng 55-60 và thấp hơn mẫu dò Taqman khoảng 5-10 để đảm bảo mẫu dò luôn bắt cặp trước.
Máy luân nhiệt trong hệ thống RT-PCR có cấu tạo tương tự như máy PCR thông thường, bao gồm 3 bộ phận chính: bộ phận điều khiển, nguồn điện và bộ phận luân nhiệt. Nguyên lý hoạt động của Real-Time PCR (sử dụng Taqman Probe) Quy trình thực hiện kỹ thuật RT-PCR cũng theo nguyên tắc thông thường của phản ứng tổng hợp chuỗi. Trong kỹ thuật này, real-time PCR mix ngoài các thành phần cơ bản của PCR mix, còn chứa hai thành phần quan trọng để probe có thể phát huỳnh quang khi có sự hiện diện của sản phẩm khuếch đại đặc hiệu từ DNA đích, đó là: Taqman probe và enzyme Taq polymerase có hoạt tính 5’-3’ exonuclease.
Khi chưa có sự xuất hiện của sản phẩm khuếch đại đặc hiệu từ DNA đích thì Taqman probe vẫn còn nguyên vẹn do vậy mà huỳnh quang phát ra được từ reporter ở đầu 5’ sẽ bị quencher ở đầu 3’ của probe hấp thụ, ống thử nghiệm sẽ không phát được huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích. Khi bắt đầu có sự xuất hiện sản phẩm khuếch đại đặc hiệu thì Taqman probe sẽ bắt cặp vào sợi khuôn của sản phẩm này ở giai đoạn nhiệt độ bắt cặp và sẽ bị enzyme Taq polymerase cắt bỏ để kéo dài mồi tổng hợp nên sợi bổ sung, do vậy mà reporter của Taqman probe sẽ bị cắt rời xa quencher và phát được huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích. Càng nhiều sản phẩm khuếch đại xuất hiện thì số lượng reporter tự do sẽ càng nhiều, đến một lúc nào đó cường độ huỳnh quang phát ra từ reporter đủ mạnh thì máy sẽ ghi nhận được tín hiệu huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng khi nhận được nguồn sáng kích thích.
Một trong những cải tiến rừ ràng nhất của RT-PCR so với PCR đú chớnh là ngoài định lượng, thì RT-PCR còn có thể định tính dựa vào phương pháp phân tích đường cong nóng chảy. Trong chu trình phản ứng RT-PCR, sẽ có trường hợp DNA đích và các primer dimer cùng phát quang (do chúng đều là DNA sợi đôi), để định tính được hai thành phần này thì ta có thể căn cứ vào nhiệt độ nóng chảy, các primer dimer thường có Tm thấp ( chỉ khoảng 60- 70), trong khi DNA đớch cú Tm cao hơn, khỏc biệt rừ ràng ( khoảng 75-90). Cho nờn hoàn toàn có thể dựa vào phương pháp xác định đường cong nóng chảy để định tính sản phẩm mà không cần phải thực hiện thêm phản ứng nào khác.
Ở người và hầu hết các loài động vật có vú, một đơn vị kháng thể bao gồm bốn chuỗi polypeptide; hai chuỗi nặng (H) giống hệt nhau và hai chuỗi nhẹ (L) giống hệt nhau được nối với nhau bằng liên kết disulfua. Epitope, hay còn gọi là yếu tố quyết định kháng nguyên (antigenic determinant) là vị trí cấu trúc trên một phân tử kháng nguyên có thể phản ứng với một kiểu cấu trúc hóa học của phân tử kháng thể hoặc phân tử thụ thể,trong máu hoặc trên tế bào miễn dịch. Một kháng nguyên có thể có một hoặc nhiều epitop do có nhiều epitop nên kháng nguyên có thể gây phản ứng chéo giữa các kháng nguyên có cùng 1 epitop hay 1 epitop cũng có thể có 2 kháng thể phản ứng đặc hiệu.
Định nghĩa: ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assa), là một kỹ thuật sinh hóa phát hiện sự hiện diện của một kháng thể hoặc kháng nguyên trong một mẫu bằng phản ứng miễn dịch đặc hiệu. Cụ thể, kháng nguyên/ kháng thể (Tùy loại kỹ thuật ELISA) được phủ lên bề mặt giếng, sau đó thêm một kháng thể đặc hiệu đã liên kết với một loại enzyme, và cuối cùng thêm cơ chất để enzyme phân giải cơ chất sinh ra chất mang màu. - Kỹ thuật ELISA cạnh tranh: là quá trình gắn cạnh tranh kháng nguyên gốc (kháng nguyên mẫu) và kháng nguyên được thêm vào (Inhibitor Antigen) (kháng nguyên trong chuẩn, trong mẫu..) để gắn vào một kháng thể được đánh dấu xác định.
Mẫu thử với một hàm lượng không xác định kháng nguyên trên một chất mang rắn (thường là một giếng vi thể bằng polystyrene) được cố định hoặc theo cách không đặc hiệu (thông qua hấp thu bề mặt) hoặc theo cách đặc hiệu (thông qua sự bắt giữ bởi kháng thể đặc hiệu khác cho cùng kháng nguyên. Thành phần của phản ứng: DNA polymerase tham gia vào quá trình sao chép chuỗi DNA và vai trò của nó là tổng hợp chuỗi mới, phù hợp với deoxyribonucleotides triphosphate với các chuỗi bổ sung. Theo lý thuyết, chỉ giải trình tự một chiều, nhưng thực tế người ta thường giải trình tự hai chiều với hai loại mồi, bởi vì: đảm bảo tính chính xác, giải được trình tự lớn hơn 1500 nu, tín hiệu không bị nhiễu.
Bên cạnh đó cũng có những nhược điểm: khó phân tích chính xác các trình tự của một loại nu lặp lại liên tục từ 6 nu trở lên, phức tạp và nhiều công đoạn, giá thành cao so với các phương pháp giải trình tự thế hệ 2 khác. Là kỹ thuật xác định trình tự các nucleotide trong DNA thông qua việc phát hiện tín hiệu điện do ion H+ được giải phóng ra trong quá trình tổng hợp DNA bằng các máy đo pH siêu nhỏ gắn vào chip cảm ứng bán dẫn. Nguyên tắc: phản ứng giải trình tự gen tức thời đơn phân tử được thực hiện trong một lỗ kích thước nano với tính chất đặc biệt: cho phép quan sát tín hiệu huỳnh quang đơn phân tử khi chất huỳnh quang tiến sát vào đáy của lỗ nano.
Tại một thời điểm, chỉ có dNTP nào bổ sung với trình tự quan tâm mới đến đủ gần đáy chỗ và ngay trước khi được gắn vào chuỗi, tín hiệu huỳnh quang mà dNTP mang được ghi nhận trong một khoảnh khắc bởi camera cực nhạy, ngay lập tức sau đó fluorescent bị cắt và trôi nổi trong môi trường. Nhận thấy có sự khác biệt giữa trình tự T- R và file T-R, tín hiệu khác nhau nu đầu, nguyên nhân là do ở T-R đã reverse ở bước 2, còn file tín hiệu thì chưa nên cần reverse lại.