Tiểu luận - bệnh truyền nhiễm - đề tài - Cách pha chế các loại môi trường nuôi cấy vi sinh vật

NGUYÊN TẮC PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG Pha chế môi trường phải dựa trên cơ sở nhu cầu về các chất dinh dưỡng và khả năng dồng hóa các chất dinh dưỡng của từng loài vsv..  Cần phải điều chỉnh tỉ

Chuyên đề 4: Cách pha chế các loại môi trường nuôi cấy

vi sinh vật

NỘI DUNG

 I.KHÁI NIỆM

 II NGUYÊN TẮC PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG

 III PHÂN LOẠI MÔI TRƯỜNG

 IV.PHƯƠNG PHÁP PHA CHẾ MỘT SỐ LOẠI MÔI TRƯỜNG

I KHÁI NIỆM

 Trong nuôi cấy nhân tạo người ta chuẩn bị các loại “ thức ăn” cung cấp cho từng nhóm vsv khác nhau Dạng thức ăn này được gọi là “ môi trường nuôi cấy”.

 Môi trường nuôi cấy thường được gọi theo tên người chế tạo công thức ( vd:

Hansen, Sabouraud…) hoặc theo nguồn chất dinh dưỡng tính theo môi trường, ( môi trường thạch, thịt, pepton…).

 Làm môi trường nhằm thực hiện việc phân lập, nhân giống, giữ giống vsv, đông thời để nuôi cấy và nghiên cứu các đặc điểm sinh học của chúng.

II NGUYÊN TẮC PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG

 Pha chế môi trường phải dựa trên cơ sở nhu cầu về các chất dinh dưỡng và khả năng dồng hóa các chất dinh dưỡng của từng loài vsv.

 Cần phải điều chỉnh tỉ lệ và nồng độ các chất trong thành phần môi trường

để đảm bảo sự cân bằng về áp suất thẩm thấu giữa môi trường và tế bào vsv.

 đảm bảo các điều kiện lí- hóa cần thiết cho các hoạt động trao đổi chất của vsv.

 Môi trường phải vô trùng tuyệt đối để khi nuôi cấy chỉ phát triển 1 loại vsv mong muốn.

III PHÂN LOẠI MÔI TRƯỜNG

1 Phân loại theo thể

 Môi trường lỏng: canh thang, nước pepton.

 Môi trường đặc: có 1- 2% thạch như thạch thường, thạch máu…

 Môi trường mềm: có 0.3- 0.5% thạch

2 Phân loại theo mục đích sử dụng

a) Môi trường cơ bản : là môi trường có đủ các chất cần thiết cho đa số các loại

vi khuần gây bệnh phát triển được.

o Một số môi trường cơ bản: nước thịt, canh thang thường, thạch

thường

III PHÂN LOẠI MÔI TRƯỜNG ( tiếp)

b) Môi trường phong phú : là môi trường có nhiều chất dinh dưỡng hoặc các vitamin và 1 số yếu tố phát triển khác

Một số môi trường phong phú: canh thang máu, thạch máu, canh thang huyết thanh và thạch huyết thanh

c) Môi trường phân lập: dùng để tách 1 chủng vi khuẩn ra khỏi những vi khuẩn khác hoặc thu 1 chủng

vi khuẩn thuần khiết Môi trường phân lập gồm :

 Môi trường không chọn lọc: môi trường thạch máu, thạch thường

 Môi trường chọn lọc ( ưu tiên 1 loại vi khuẩn hoặc 1 nhóm vk phát triển):

o Môi trường ít chọn lọc: có nồng độ thấp các chất ức chế ( Marconkey, xanh brillant,….)

o Môi trường chọn lọc cao: có nồng độ cao các chất ức chế ( môi trường ss, thạch kiềm….)

III PHÂN LOẠI MÔI TRƯỜNG ( tiếp)

d) Môi trường xác định: là loại môi trường trong đó ngoài những chất dinh dưỡng cần thiết còn có một số chất dung để nghiên cứu những đặc tính sinh vật hóa học nhằm xác định các loại vi khuần gây bệnh

 Một số môi trường xác đinh: môi trường Kligler ( KIA), ure indol, manit di động….

IV.PHƯƠNG PHÁP PHA CHẾ MỘT SỐ LOẠI MÔI TRƯỜNG

1) Nước thịt

a) Công thức:

 Thịt bò, thịt lợn, thịt trâu: 500g

 Nước cất: 1000ml

b) Pha chế:

- Chuẩn bị đủ dụng cụ: Nồi nhụm, ống đong, dao, mỏy xay thịt, cõn, giấy lọc… và cỏc thành phần để pha chế.

- Lọc hết gân, mỡ của thịt, xay hoặc băm nhỏ, cân 500 g

- Ngâm thịt vào 1000 mL nước cất, để tủ lạnh qua đêm.

- Đun từ từ cho tới sôi, vớt bọt khuấy đều Duy trì sôi âm ỉ trong 1giờ, thỉnh thoảng khuấy

đều.

- Lọc qua giấy lọc để loại trừ mỡ và bã thịt.

- Thêm nước cất cho đủ 1000 mL, dùng để pha chế môi trường

- Nếu chưa dùng ngay thì đóng chai hấp 1100C trong 30 phút rồi bảo quản ở tủ lạnh

c) Nhận định kết quả: Nước thịt phải trong, không lắng cặn

IV.PHƯƠNG PHÁP PHA CHẾ MỘT SỐ LOẠI MÔI TRƯỜNG

2) Thạch thường

a) Công thức

- Nước thịt: 1000 mL (có thể thay bằng 5 g cao thịt).

- Pepton bột: 10 g.

- NaCl tinh khiết: 5 g.

- Thạch sợi: 20 g.

b) Pha chế:

- Chuẩn bị đủ đĩa petri, ống nghiệm, ống đong, bình cầu, cân, giấy lọc, đèn cồn, nồi nhôm và các loại hoá chất.

- Cân, đong đủ nước thịt và các thành phần của môi trường vào nồi, đun nóng cho tan.

- Điều chỉnh pH 7,8- 8 bằng dung dịch kiềm hoặc acid.

- Cho thạch sợi đã rửa sạch cắt nhỏ vào nồi

- Hấp 120C/30phút.

- Kiểm tra lại pH 7,4- 7,6.

- Lọc qua giấy lọc hoặc bông vào bình cầu khi môi trường còn nóng.

- Hấp 110C 30 phút.

- Đổ đĩa hoặc ống nghiệm khi nhiệt độ khoảng 500C.

c) nhận xét kết quả: Thạch tan đều, môi trường không cứng hoặc quá mềm, đĩa thạch không dày quá hoặc mỏng quá ống thạch phải có phần chân và lưỡi

IV.PHƯƠNG PHÁP PHA CHẾ MỘT SỐ LOẠI MÔI TRƯỜNG

 3) Thạch máu

a) Công thức:

- Thạch thường: 250 mL.

- Máu thỏ hoặc máu cừu: 15 ml

b) Pha chế:

- Chuẩn bị đủ dụng cụ: Bơm kim tiêm 20 mL vô khuẩn, ống nghiệm vô khuẩn, đĩa petri, đèn cồn và chất chống đông.

- Đun nóng chảy 250 mL môi trường thạch thường đựng trong bình cầu, để nguội 500C.

- Lấy 15 mL máu từ tim thỏ hoặc từ ống đã có sẵn cho vào bình thạch trên ngọn lửa đèn cồn.

- Lắc nhẹ bình cầu cho máu hoà đều trong môi trường.

- Đổ môi trường vào đĩa petri hoặc ống nghiệm, để ống nằm nghiêng cho thạch đông.

c) Nhận xét kết quả:

Yêu cầu môi trường phải có màu thạch đỏ tươi, thạch tan đều, đĩa thạch có độ dày vừa phải xấp

xỉ 4 mm, ống thạch có chân, lưỡi.

IV.PHƯƠNG PHÁP PHA CHẾ MỘT SỐ LOẠI MÔI TRƯỜNG

4) Môi trường SS (Salmonella- Shigella agar)

a) Công thức:

- Cao thịt: 5 g.

- Pepton: 5 g.

- Lactose: 10 g.

- Muối mật: 8,5 g.

- Natri citrat: 8,5 g.

- Sắt citrat: 1 g.

- Xanh brilan (dung dịch 0,1% trong nước): 0,3 mL.

- Đỏ trung tính (dung dịch 1% trong nước): 2,5 mL.

- Thạch: 20 g.

- Nước cất: 1000 mL.

IV.PHƯƠNG PHÁP PHA CHẾ MỘT SỐ LOẠI MÔI TRƯỜNG

b) Pha chế:

- Chuẩn bị đủ dụng cụ: ống đong, bình cầu, cân,

pipet, đĩa petri, đèn cồn

- Chuẩn bị đủ hoá chất dùng cho môi trường.

- Cân, đong đủ các thành phần môi trường vào

bình cầu.

- Đun sôi nhỏ lửa, lắc đều cho tan hết các chất.

- Điều chỉnh pH 7,0- 7,2

- Để nguội 500C, đổ đĩa petri.

c) Nhận xét kết quả: Môi trường có màu hồng, mịn, đĩa thạch có độ dày vừa phải, không nứt, không mềm, không có nước.

IV.PHƯƠNG PHÁP PHA CHẾ MỘT SỐ LOẠI MÔI TRƯỜNG

5) Môi trường Macconkey

a) Công thức:

- Pepton : 20 g.

- Lactose: 10 g.

- Muối mật: 1,5 g.

- Natri clorid: 5 g.

- Thạch sợi: 20 g.

- Nước cất: 1000 mL.

IV.PHƯƠNG PHÁP PHA CHẾ MỘT SỐ LOẠI MÔI TRƯỜNG

b) Pha chế:

 Chuẩn bị đủ dụng cụ: ống đong, bình cầu, cân, pipet, nồi nhôm, đĩa petri, đèn cồn.

- Chuẩn bị đủ hoá chất để pha chế môi trường.

- Cân, đong đủ các thành phần của môi trường cho vào nồi.

- Đun nhỏ lửa, khuấy đều cho tan các chất.

- Điều chỉnh pH 7,2- 7,4.

- Nhỏ tiếp 0,6 mL đỏ trung tính 1%, khuấy đều

- Phân phối vào bình cầu, hấp 1100C 30 phút

- Để nguội 500C, đổ đĩa petri.

c) Nhận xét kết quả : Môi trường có màu hồng sẫm, các đĩa thạch không có nước, đủ độ dày.

IV.PHƯƠNG PHÁP PHA CHẾ MỘT SỐ LOẠI MÔI TRƯỜNG

6) Môi trường Kligler (KIA)

a) Công thức:

- Cao thịt 3 g

- Cao men 3g

- Pepton 20g

- NaCl tinh khiết 5g

- Lactose 10g

- Feric citrat 0.5g

- Glucose 1g

- Natri thiosulfat 0.5g

- Đỏ phenol, dung dịch 0.5% 6mL

- Thạch 12g

- Nước cất 1000mL

IV.PHƯƠNG PHÁP PHA CHẾ MỘT SỐ LOẠI MÔI TRƯỜNG

b) Pha chế

- Chuẩn bị đủ dụng cụ: ống đong, cân, pipet, đèn cồn, ống nghiệm, nồi nhôm.

- Chuẩn bị đủ các loại hoá chất cần thiết.

- Cân đong đủ các thành phần của môi trường.

- Cho thạch vào nước, đun sôi, khuấy liên tục tới khi tan hoàn toàn (hoặc hấp ở 1000C).

- Lần lượt cho thêm các hoá chất vào để hoà tan.

- Điều chỉnh pH=7,4 rồi thêm 6 mL dung dịch đỏ phenol 0,5% khuấy đều.

- Phân phối ra ống nghiệm 12 mm, mỗi ống 3 mL, hấp 1100C trong 30 phút hoặc hấp trước rồi phân phối ra các ống nghiệm.

- Lấy ra để ống môi trường nằm nghiêng sao cho mặt nghiêng dài khoảng 4-5 cm.

c) Nhận xét kết quả: Môi trường có màu hồng đỏ, có chân.

IV.PHƯƠNG PHÁP PHA CHẾ MỘT SỐ LOẠI MÔI TRƯỜNG

 7) Môi trường Manit di động

a) Công thức:

- Pepton 20 g

- Kali nitrat 1 g

- Mannitol 10 g

- Dung dịch đỏ phenol 1% trong nước 4 mL

- Thạch 4 g

- Nước cất 1000 mL

IV.PHƯƠNG PHÁP PHA CHẾ MỘT SỐ LOẠI MÔI TRƯỜNG

 b) Pha chế:

- Chuẩn bị đủ dụng cụ: Pipet, ống nghiệm , ống đong, bình cầu, cân.

- Chuẩn bị đủ các loại hoá chất cần thiết để pha chế môi trường.

- Cân đong đủ các thành phần của môi trường cho vào bình cầu.

- Đun sôi quấy đều để hoà tan các chất.

- Điều chỉnh pH=7,6

- Cho dung dịch đỏ phenol.

- Đóng vào ống 12 mm, mỗi ống khoảng 3 mL.

- Hấp 110oC trong 30 phút, bỏ ra để ống đứng

c) Nhận xét kết quả: Môi trường mềm, có màu hồng đỏ.