Mục tiêu của đề tài là bào chếphytosome từ cao vỏ bưởi ở quy mô phòng thí nghiệm và đánh giá các đặc tính củaphytosome cao vỏ bưởi.Phương pháp nghiên cứuXây dựng và thẩm định quy trình đ
Tổng quan về dược liệu bưởi
Bưởi là cây gỗ cao trung bình 5-10m hoặc cao hơn Vỏ cây có thể tiết ra một chất như cao su Cành có gai nhỏ mọc thẳng đứng ở kẽ lá, ban đầu có lông nhưng sau nhẵn Lá hình bầu dục, đầu tù hai bên, mép nguyên, dai; có 8 cặp gân bên, các gân nhỏ chỉ nổi rõ ở mặt dưới; cuống lá có cánh dài, mặt dưới có lông, đặc biệt là trên sống giữa.
Hoa mọc thành chùm 6 - 10 hoa; cuống hoa có lông; lá bắc hình vạch, có lông. Hoa trắng, to, rất thơm; lá đài 4-5, tròn, có lông; cánh hoa 5; nhị khoảng 24, rời, ngắn bằng nửa các cánh hoa; đĩa mật dày; bầu hình cầu, có lông, vòi dài, đầu nhuỵ hình đầu, to Quả gần hình cầu và cầu phẳng, đường kính 15-30 cm, có cùi dày và màu sắc thay đổi tuỳ loại Bưởi, thường có 12 múi, cơm quả chua hay ngọt cũng khác nhau tuỳ loại 3
Hình 1.1 Bưởi (Citrus grandis (Burm f.) Merr.).
(a): Hình toàn cây Bưởi(b): Hình hoa Bưởi(c): Hình quả Bưởi
1.1.2.1 Các hợp chất nhóm flavonoid
Năm 2014, Pan-lin Li và các cộng sự đã xác định các aglycon flavanon chính trong vỏ Bưởi gồm naringenin, hesperetin và eriodictyol 11 Trong vỏ Bưởi cũng chứa hai loại glycosid flavanon là neohesperidosid và rutinosid Neohesperosid trong vỏ Bưởi bao gồm naringin, neohesperidin và neoeriocitrin, rutinoside bao gồm eriocitrin, narirutin, hesperidin và neoponcirin 12-14 Ngoài ra, vỏ Bưởi còn chứa flavon tồn tại ở cả dạng aglycon và glycosid, 6 aglycon flavon chính được báo cáo bao gồm sinensetin, nobiletin, tangeretin, apigenin, luteolin và diosmetin; các glycosid flavon gồm có lucinen-2, vicinen-2, apigenin 6-C-glucosyl-7-O-glucosid, diosmetin 6,8-di,-C-glucosid, and diosmetin 6-C-glucosid 14
Năm 2021, Yihan Zhao và các cộng sự đã đánh giá sự tích lũy và tổng hợp carotenoid trong các giai đoạn phát triển của quả Bưởi Kết quả nghiên cứu cho thấy hàm lượng carotenoid tổng được tích lũy cao hơn ở quả Bưởi non 15
Bảng 1.1 Các hợp chất flavonoid chính trong trái Bưởi
1.1.2.2 Các hợp chất nhóm coumarin
Các hợp chất chính thuộc nhóm coumarin được xác định trong vỏ Bưởi bao gồm limettin, meranzin, xanthotoxin, isomeranzin, 7-hydroxycoumarin, mexoticin, paniculin
II, epoxyaurapten, meranzin hydrate, auraptene và oxypeucedanin hydrate Một số chất nhóm furanocoumarin được xác định trong vỏ Bưởi bao gồm bergapten, bergaptol, 6′,7′ dihydroxybergamottin, bergamottin, epoxybergamottin và imperatorin 16-18
1.1.2.3 Các hợp chất nhóm carotenoid
Một số hợp chất thuộc nhóm carotenoid chính trong Bưởi bao gồm phytoene, phytofluene, zeta-carotene, lycopene, 𝛼-carotene, 𝛽-carotene, lutein, 𝛽-cryptoxanthin, 9-cis-violaxanthin và zeaxanthin 19
1.1.2.4 Tinh dầu Đa số các cấu tử tinh dầu trong vỏ Bưởi thuộc một lớp hợp chất hữu cơ là terpenoid, bao gồm cả monoterpenoid mạch hở, monoterpenoid đơn vòng, monoterpenoid hai vòng, diterpenoid, sesquiterpenoid mạch hở, sesquiterpenoid đơn vòng, sesquiterpenoid hai vòng và sesquiterpenoid ba vòng 20
1.1.3.1 Tác dụng chống oxy hóa
Năm 2016, Fidrianny và các cộng sự đã nghiên cứu để xác định hoạt tính chống oxy hóa từ những phần khác nhau của Bưởi bằng cách sử dụng DPPH và phosphomolybdenum Kết quả cho thấy dịch chiết bằng ethyl acetate từ vỏ Bưởi giá trịIC50 thấp nhất là 0,68 àg/ml đối với phương phỏp DPPH, trong khi đú giỏ trị EC50 thấp nhất là 101,36 àg/ml đối với phương phỏp phosphomolybdenum thuộc về dịch chiết bằng dung môi ethyl acetate từ lá Bưởi 21
Năm 2019, Sanjay Kumar và các cộng sự đã đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết vỏ Bưởi Hoạt tính chống oxy hóa của chiết xuất vỏ Bưởi trong cồn được đánh giá bằng cách tính chỉ số acid béo tự do, chỉ số iod và chỉ số p-anisidine của dầu lạc trong thời gian bảo quản 21 ngày ở nhiệt độ phòng Các mẫu được lấy và phân tích định kỳ sau 7 ngày và sau 21 ngày bảo quản, dầu lạc được thêm vào 1500 và 2000 ppm chiết xuất vỏ Bưởi, cho thấy chỉ số acid béo tự do (2,66 và 2,15%), chỉ số p-anisidine (6,6; 4,68) thấp hơn và chỉ số iod cao hơn (52,8 và 51,46) so với mẫu dầu lạc đối chứng (chỉ số acid béo tự do 9,32%, chỉ số p- anisidine 9,85 và chỉ số iod 33,9) 5
Năm 2018, nghiên cứu của M Ibrahim và cộng sự đã chứng minh tác dụng giảm đau và kháng viêm của dịch chiết vỏ bưởi bằng methanol Ở nồng độ 500 mg/kg, dịch chiết này cho hiệu quả giảm đau đạt 73,34% khi chống lại cơn đau do axit acetic gây ra ở chuột Trong khi đó, diclofenac sodium được sử dụng làm chứng dương với hoạt tính giảm đau đạt 87,13% ở cùng liều dùng.
10 mg/kg Tác dụng chống viêm của dịch chiết tương đương với thuốc ibuprofen đối chứng và hiệu quả duy trì trong 2-4 giờ 22
Năm 2019, Momoko Ishida và các cộng sự đã nghiên cứu tác dụng chống viêm của dịch chiết nước từ vỏ Bưởi in vitro và in vivo Kết quả cho thấy dịch chiết nước từ vỏ Bưởi ức chế đáng kể việc sản xuất các cytokin gây viêm như interleukin (IL)-6 và yếu tố hoại tử khối u (TNF)-α bởi các tế bào RAW264.7 được LPS kích hoạt mà không gây độc tế bào Dịch chiết nước từ vỏ Bưởi cũng ức chế đáng kể mức độ biểu hiện mRNA của IL-6 và TNF-α trong tế bào, ức chế sản xuất các cytokin gây viêm bằng cách ức chế mức độ biểu hiện gen Phân tích Immunoblot cho thấy tác dụng chống viêm trên đại thực bào thông qua việc ức chế quá trình phosphoryl hóa p38 và chuyển vị trí củaNF-κB vào nhân Việc uống dịch chiết nước từ vỏ Bưởi đã ức chế nồng độ trong huyết thanh của các cytokin gây viêm và cải thiện tỷ lệ sống sót ở chuột trong mô hình hội chứng phản ứng viêm toàn thân (SIRS) Ngoài ra, các thí nghiệm in vivo cho thấy việc uống dịch chiết nước từ vỏ Bưởi ức chế nồng độ cytokin gây viêm trong huyết thanh và cải thiện tỷ lệ sống sót ở chuột trong mô hình SIRS 23
Năm 2020, Peace Nwanneka Ani và cộng sự đã nghiên cứu trên mô hình chuột Wistar bị gây bệnh cảnh tiểu đường bằng alloxan Kết quả cho thấy chiết xuất từ vỏ Bưởi làm giảm đáng kể mức đường huyết, đồng thời làm tăng tỷ lệ cholesterol lipoprotein tỷ trọng cao (4,43%) và giảm cholesterol toàn phần (30,86%), triglyceride (10,58%) và cholesterol lipoprotein tỷ trọng thấp (10,20%) 24
Năm 2020, Li-Yun Lin và các cộng sự đã nghiên cứu khả năng hạ lipid máu của Bưởi thông qua mô hình chuột Wistar và mô hình HepG2 Kết quả nghiên cứu cho thấy tất cả các bộ phận của quả Bưởi đều tăng cường khả năng bài tiết lipid thô và sterol trong phân Do đó, quả Bưởi có thể đóng vai trò như một chất chống tăng lipid máu khá hứa hẹn 25
Năm 2020, Fansheng Kong và cộng sự đã làm nghiên cứu cho thấy chất naringin (một flavonoid có trong vỏ Bưởi) giúp tăng đáng kể lượng lipoprotein tỷ trọng cao (HDL)-cholesterol đồng thời làm giảm mức cholesterol toàn phần, tổng chất béo trung tính và lipoprotein tỷ trọng thấp (LDL)-cholesterol ở chuột mắc bệnh tiểu đường 26
Năm 2013, Temitope A Oyedepo và cộng sự đã đánh giá tác động của nước ép Bưởi đối với sự dung nạp glucose và lipid ở chuột bị gây bệnh đái tháo đường tuýp II bằng streptozotocin Các nhóm chuột khác nhau được điều trị bằng nước ép Bưởi có nồng độ 25% và 50% trong 8 tuần Sau 8 tuần điều trị, các thông số sinh hóa máu được phân tích cho thấy sự khác biệt đáng kể của glucose, cholesterol, HDL, LDL, triglyceride, trong 50% nhóm được điều trị bằng nước ép Bưởi so với nhóm bị tiểu đường đối chứng Nghiên cứu cho thấy nước ép Bưởi có tác dụng có lợi đối với sự dung nạp glucose và lipid ở chuột bị đái tháo đường tuýp II do streptozotocin gây ra 27
Năm 2018, Anayt Ulla và các cộng sự đã thực hiện đánh giá tác dụng của việc bổ sung vỏ bưởi ở chuột mắc bệnh tiểu đường do alloxan gây ra Chuột Long Evans đực bị gây bệnh tiểu đường bằng cách tiêm alloxan monohydrat vào màng bụng (90 mg/kg thể trọng) Mức đường huyết, sự dung nạp glucose đường uống, các xét nghiệm mô bệnh học được đánh giá để kiểm tra tình trạng viêm và xơ hóa trong gan Kết quả cho thấy việc sử dụng vỏ bưởi đã giúp ngăn ngừa stress oxy hóa trong gan của chuột mắc bệnh tiểu đường do alloxan, đồng thời giúp cải thiện bệnh tiểu đường do alloxan gây ra ở chuột và giảm thiểu các biến chứng 28
1.1.3.5 Tác dụng bảo vệ gan
Năm 2015, Hasan Chowdhury và các cộng sự đã xác định hoạt động bảo vệ gan của bột vỏ quả Bưởi bằng cách sử dụng mô hình chuột đã xử lý carbon tetrachloride (CCl4) Tổn thương gan ở chuột được xác nhận bằng cách đo hoạt động của enzyme aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT) và alkaline phosphatase (ALP) Ngoài ra, các sản phẩm peroxy hóa lipid (MDA), nitric oxide, mức độ sản phẩm oxy hóa protein nâng cao (APOP) và các hoạt động của catalase cũng được phân tích cùng với mô tả về sự thâm nhập tế bào viêm, sự lắng đọng collagen và sắt trong gan Chế độ ăn bổ sung bột vỏ quả Bưởi làm giảm đáng kể hoạt động của AST, ALT và ALP trong huyết thanh ở chuột được xử lý bằng CCl4 Hơn nữa, bột vỏ quả Bưởi cũng làm giảm đáng kể các dấu hiệu stress oxy hóa (MDA, NO, và mức APOP) và khôi phục hoạt động của catalase ở chuột được xử lý CCl4 Kiểm tra mô học của phần gan cho thấy sự giảm thâm nhập tế bào viêm, sự lắng đọng collagen và sắt ở những con chuột được xử lý bằng CCl4 Các kết quả từ nghiên cứu này đã chứng minh rằng bột vỏ quả Bưởi tạo ra tác dụng bảo vệ gan đáng kể ở chuột được sử dụng CCl4 4.
Tổng quan về phytosome
Từ “phyto” nghĩa là thực vật, còn “some” là giống như tế bào Vì vậy, phytosome có cấu trúc tương tự màng tế bào sinh học, tương hợp sinh học cao và thuận lợi hơn để được vận chuyển vào nội bào Phytosome là phức hợp của hoạt chất dược liệu (cấu trúc polyphenol, triterpen…) gắn với phospholipid (PL) ở mức độ phân tử Trong môi trường nước, phytosome tạo thành dạng micell có cấu trúc tương tự liposome.
Phytosome dược liệu cải thiện được khả năng vận chuyển, hấp thu từ môi trường thân nước trong lòng ống tiêu hóa vào môi trường thân chất béo trong tế bào ruột, sau đó vào trong tuần hoàn Công nghệ bào chế hiện đại này đã và đang tạo ra một dòng sản phẩm từ dược liệu có hiệu quả điều trị cao, giảm tác dụng phụ, giảm liều dùng và tăng giá trị của thuốc thảo dược.
Liên kết phospholipid - cơ chất là liên kết hydro giữa đầu phân cực của phosphorlipid và các nhóm chức phân cực của hoạt chất Trong phytosome, hoạt chất được gắn vào đầu phân cực của phospholipid, trở thành bộ phận cấu tạo của màng, có sự hình thành các liên kết hydro giữa hydroxyl phenol của hoạt chất và ion phosphate trên nhánh phospholipid cho từng phân tử hoạt chất trong cao dược liệu Tính chất của phytosome được quyết định bởi các yếu tố như kích thước tiểu phân, tính thấm qua màng, tỷ lệ (%) chất tan hấp phụ, thành phần hóa học cũng như số lượng và độ tinh khiết của nguyên liệu ban đầu 10
Hình 1.2 Cấu trúc của Phytosome 33
Cấu tạo của phytosome gồm 2 thành phần chính: hoạt chất và phospholipid
Phospholipid là hợp chất gồm glycerol gắn với hai axit béo và một nhóm phosphat Phosphatidylethanolamin, phosphatidylserin và phosphatidylcholin là những phospholipid chủ yếu được dùng trong chế phẩm phytosome Trong đó, phosphatidylcholine (PC) được sử dụng nhiều hơn cả Phần đầu ưa nước của phosphatidylcholine chính là choline Phosphatidylcholine là thành phần chính của màng tế bào và mang lại lợi ích kép khi tạo thành phytosome: Vừa là phương tiện vận chuyển hoạt chất lý tưởng, vừa là chất dinh dưỡng có vai trò hỗ trợ trị bệnh gan.
Hình 1.3 Cấu tạo của phosphatidylcholine 35
Hoạt chất từ dược liệu thường là các polyphenol (flavonoid, saponin, terpenoid, ) Polyphenol là nhóm chất dinh dưỡng và có tác dụng chữa bệnh Tuy nhiên, cấu trúc hóa học của polyphenol khá không ổn định khi tiếp xúc với thực phẩm và quá trình tiêu hóa Công nghệ phytosome giúp bảo vệ polyphenol trong cấu trúc giống tế bào, tránh bị phá hủy bởi môi trường (oxy, ánh sáng, nhiệt độ cao, ), enzyme tiêu hóa và vi khuẩn đường ruột Một số polyphenol có tính chất thân chất béo, khó hòa tan trong nước và dịch tiêu hóa, một số khác lại ưa nước và không vượt qua được màng sinh học Phytosome có khả năng cải thiện độ hòa tan cho các chất thân chất béo trong nước và chuyển các chất thân nước từ pha nước sang pha thân chất béo, từ đó vào máu.
1.2.3 Ưu điểm và nhược điểm của phytosome
- Tăng sinh khả dụng của hoạt chất
Xiangrong Zhang và các cộng sự đã điều chế phức hợp phospholipid của 25 OCH3- PPD bằng cách làm bay hơi dung môi và nhận thấy rằng AUC(0–24 giờ) của phức hợp tăng từ 26,65 lên 97,24; cao gấp 3,65 lần so với 25-OCH3-PPD tự do và sinh khả dụng tương đối là 365% 37 Kexia Zhang điều chế phức hợp quercetin-phospholipid và thấy rằng AUC(0–t) của phức hợp trên tăng từ 2,04 lên 8,12 38 Khả năng cải thiện hấp thu của phytosome cũng được chứng minh trên mô hình chuột thí nghiệm với hoạt chất curcumin Cụ thể, Cmax của curcumin và hỗn hợp vật lý curcumin - PC lần lượt là 258,64 và 297,32 ng/ml với Tmax tương ứng là 1,72 và 2,03 giờ Trong khi đó, Cmax của phytosome curcumin là 803,86 ng/ml với Tmax 2,21 giờ Thông số AUC0-120 phút của phytosome (Meriva) với liều 340 mg/kg cho giá trị cao gấp 5 lần so với curcumin dạng tự do 39 Năm 2013, Sauvik Bhattacharyya và các cộng sự đã tiến hành đánh giá khả năng cải thiện sinh khả dụng đường uống và tác dụng bảo vệ gan in vivo trên mô hình gây độc gan chuột do carbon tetracloride (CCl4) của phytosome acid gallic Kết quả thu được như sau: dạng phytosome làm tăng khả năng hấp thu đường uống của acid gallic gấp khoảng 4,31 lần so với hoạt chất tinh khiết, thời gian bán thải cũng được cải thiện khi sử dụng dạng phytosome (2,12 ± 0,18 giờ) so sánh với hoạt chất tinh khiết (0,98 ± 0,07 giờ) Phức hợp với PL của acid gallic làm tăng hiệu quả bảo vệ gan (do CCl4 gây ra) so với acid gallic tinh khiết (p < 0,05) thông qua các chỉ số: tăng nồng độ các enzym chống oxy hóa ở gan (CAT, SOD, GPx) và làm giảm nồng độ các enzym gan trong máu (SGOT, SGPT, ALP), làm giảm tổng lượng bilirubin trong máu 40
- Tăng khả năng hấp thụ qua da
Phytosome có thể dễ dàng chuyển từ môi trường thân nước vào môi trường thân chất béo của màng tế bào, sau đó thấm sâu vào tế bào 41 Đặc tính này đã được chứng minh trong một số nghiên cứu Stefano TOGNI và các cộng sự đã bào chế kem Quercetin-phytosome 2%, qua đó chứng minh tính an toàn và khả năng dung nạp qua da của chế phẩm trên 42 Trên mô hình thử hoạt tính kháng nấm, dạng gel chứa 2 % phytosome Lawson đã thể hiện hiệu quả cao hơn so với gel chứa Lawson cũng như chế phẩm chứa ketoconazol sau 3 ngày sử dụng Kết quả này có được là do sự gia tăng tính thấm của phytosome (sau 6 giờ có 92,91 % hoạt chất thấm qua da) 43
- Khả năng bảo vệ gan
So sánh với những chất mang được sử dụng trong các hệ thống phân phối thuốc khác, phosphatidylcholine không chỉ hoạt động như một thành phần được thêm vào công thức của phức hợp phyto-phospholipid mà còn hoạt động như một chất bảo vệ gan 44
Vì vậy, khi phosphatidylcholine được bệnh nhân sử dụng, nó sẽ cho thấy tác dụng hiệp đồng bảo vệ gan Trong một số trường hợp, phospholipid cũng có lợi ích dinh dưỡng.
Mặc dù có rất nhiều ưu điểm như trên nhưng hiện nay phytosome vẫn chưa được sử dụng rộng rãi vì một số nhược điểm sau: phytosome sử dụng PL là thành phần nhạy cảm với pH, dễ bị thủy phân trong môi trường pH acid hoặc kiềm, giảm độ ổn định của phytosome 35 Hầu hết các phương pháp bào chế phytosome đều sử dụng các dung môi hữu cơ độc hại như: dicloromethan, methanol… để hòa tan lipid gây ảnh hưởng đến sức khỏe con người, môi trường và có thể còn tồn dư dung môi trong sản phẩm Bào chế phytosome bằng phương pháp siêu tới hạn có thể khắc phục được nhược điểm này, nhưng đòi hỏi kỹ thuật phức tạp và yêu cầu áp suất cao.
1.2.4 Phương pháp bào chế phytosome
1.2.4.1 Phương pháp bốc hơi dung môi
PL, hoạt chất từ dược liệu được và các thành phần khác được hòa tan vào dung môi hữu cơ thích hợp trong một bình chứa Hỗn hợp phản ứng này được giữ ở mức nhiệt độ tối ưu (thường là 40 – 50 o C) trong khoảng thời gian thích hợp (1 - 2 giờ) để đạt được sự hình thành các liên kết trong phức hợp Dung môi hữu cơ sau đó được loại bỏ bằng cách sử dụng thiết bị bốc hơi ở áp suất giảm và thu được lớp màng film lipid Lớp màng film này được lưu trữ trong bình hút ẩm để qua đêm Phytosome mới hình thành được lưu trữ trong chai thủy tinh màu hổ phách tránh ánh sáng, rửa bằng nitơ ở nhiệt độ phòng để giữ sự ổn định 45
1.2.4.2 Phương pháp kết tủa trong dung môi
Để điều chế phức hợp PL, hoạt chất PL chiết xuất từ dược liệu cùng các thành phần khác được đưa vào bình cầu đáy tròn và đun hồi lưu với dung môi hữu cơ thích hợp trong điều kiện nhiệt độ không quá 60 độ C trong khoảng thời gian 1-2 giờ Hỗn hợp sau đó được cô đặc tới thể tích 5-10 ml Tiếp theo, hexan được thêm từ từ vào hỗn hợp và khuấy liên tục cho đến khi hình thành kết tủa Kết tủa thu được sau khi lọc được cất giữ trong bình hút ẩm qua đêm Kết tủa thô sau đó được nghiền và sàng qua rây có kích thước mắt lưới phù hợp Cuối cùng, phức hợp dạng bột được bảo quản trong chai thủy tinh màu hổ phách ở nhiệt độ phòng 46 độ C.
1.2.4.3 Phương pháp siêu tới hạn
Phương pháp này dùng để bào chế các tiểu phân phytosome có kích thước dao động từ 5 - 2000 nm Phương pháp này tương tự phương pháp kết tủa trong dung môi.Trong đó, dung môi kết tủa là một chất lỏng đặc biệt tồn tại ở trạng thái siêu tới hạn(thường dùng CO2) 47
1.2.5.1 Hình thái tiểu phân phytosome
Hình thái tiểu phân được quan sát bằng các loại kính hiển vi điện tử và quang phổ hiện đại như:
+ Kính hiển vi điện tử truyền qua TEM (transmission electron microscopy) cho hình ảnh về hình thái, cấu trúc tinh thể, số lượng và hướng của tiểu phân với độ phân giải cao Các đặc tính bề mặt này thu được khi một chùm tia điện tử truyền qua một mẫu siêu mỏng, tương tác với mẫu khi nó đi qua 48 Nhược điểm của phương pháp này là quy trình chuẩn bị mẫu đo TEM phức tạp và tốn khá nhiều thời gian.
Kính hiển vi điện tử quét SEM cung cấp hình ảnh bề mặt tiểu phân ở độ phân giải từ 10 - 300.000 lần, giúp đánh giá sơ bộ kích thước tiểu phân Do kích thước chùm điện tử hội tụ bị hạn chế bởi quang sai nên độ phân giải của SEM không thể đạt được như TEM Tuy nhiên, ưu điểm của SEM là phân tích mà không cần phá hủy mẫu vật, thao tác đơn giản và giá thành thấp hơn nhiều so với TEM, nên được sử dụng phổ biến trong đánh giá hình ảnh bề mặt tiểu phân.
1.2.5.2 Đánh giá sự tương tác giữa hoạt chất và phospholipid trong phytosome
- Phân tích phổ hồng ngoại biến đổi fourier (FT – IR)
Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời naringin và melitidin trong phytosome cao vỏ bưởi bằng HPLC Để xác định được hàm lượng naringin và nelitidin (sau đây gọi là hoạt chất) trong phytosome cao vỏ bưởi, đề tài tiến hành xây dựng và thẩm định 2 quy trình: quy trình định lượng hoạt chất toàn phần (bao gồm hoạt chất dạng tự do và hoạt chất trong phức hợp phytosome) và quy trình định lượng hoạt chất dạng tự do, từ đó có thể xác định được lượng hoạt chất trong phức hợp phytosome bằng hiệu số giữa hàm lượng hoạt chất toàn phần và hàm lượng hoạt chất dạng tự do.
2.2.1.1 Khảo sát điều kiện sắc ký
Chương trình rửa giải: khai triển trên mẫu thử, khảo sát chế độ rửa giải đẳng môi hay gradient sao cho pic của hoạt chất tách rõ so với peak kế cận, ngoài ra peak cần định lượng phải đạt các thông số sắc ký như độ tinh khiết peak, hệ số kéo đuôi (As), độ phân giải, hệ số dung lượng, số đĩa lý thuyết…
Chương trình rửa giải khảo sát 1 được trình bày trong bảng sau:
Bảng 2.3 Chương trình rửa giải khảo sát 1 Thời gian (phút) Acetonitril (%) Acid acetic 0.1%
Chương trình rửa giải khảo sát 2: hỗn hợp dung dịch Methanol : acid acetic 0,1%, tỷ lệ 40 : 60 (tt/tt)
Chương trình rửa giải khảo sát 3: hỗn hợp dung dịch Methanol : acid acetic 0,1%, tỷ lệ 50 : 50 (tt/tt)
Chương trình rửa giải khảo sát 4: hỗn hợp dung dịch Methanol : acid acetic 0,1%, tỷ lệ 45 : 55 (tt/tt)
Nhiệt độ cột: triển khai trên mẫu thử với chương trình rửa giải và tốc độ dòng đã được lựa chọn ở các nhiệt độ cột là 30 o C, 35 o C và 40 o C.
2.2.1.2 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu Đối với quy trình định lượng hoạt chất toàn phần
Để xác định dung môi hòa tan mẫu phù hợp nhất, cần tiến hành khảo sát các dung môi tiềm năng Cân chính xác mẫu phytosome, hòa tan trong dung môi khảo sát, lọc qua màng lọc và phân tích bằng HPLC Lặp lại thí nghiệm 2 lần với mỗi dung môi và so sánh diện tích pic trung bình Dung môi hòa tan mẫu cho diện tích pic cao và ổn định nhất sẽ được lựa chọn để sử dụng trong quá trình định lượng.
- Khảo sát phương pháp hoà tan mẫu: Cân chính xác khoảng 0,0500 g mẫu phytosome vào bình định mức 10 ml, thêm khoảng 8 ml methanol, tiến hành thực hiện các phương pháp hòa tan mẫu khác nhau bao gồm: lắc đều hòa tan, siêu âm, khuấy từ và sử dụng mỏy Vortex, sau đú thờm methanol đến vạch Lọc qua màng lọc 0,22 àm trước khi phõn tích trên hệ thống HPLC theo điều kiện đã chọn Với mỗi phương pháp khảo sát cần tiến hành lặp lại 2 lần để ghi nhận kết quả giá trị diện tích pic trung bình, so sánh các kết quả và đưa ra lựa chọn phương pháp chiết xuất tốt nhất cho các chất định lượng.
- Khảo sát thể tích dung môi hòa tan mẫu: Cân chính xác khoảng 0,0500 g mẫu phytosome vào bình định mức với các mức thể tích khảo sát khác nhau (5 ml, 10 ml và
20 ml), thêm một lượng methanol phù hợp, lắc đều hoà tan, thêm methanol đến vạch. Lọc qua màng lọc 0,22 àm trước khi phõn tớch trờn hệ thống HPLC theo điều kiện đó chọn Với mỗi phương pháp khảo sát cần tiến hành lặp lại 2 lần để ghi nhận kết quả giá trị diện tích pic trung bình, so sánh các kết quả và đưa ra lựa chọn thể tích dung môi hòa tan mẫu tốt nhất cho các chất định lượng. Đối với quy trình định lượng hoạt chất dạng tự do
Để xác định khối lượng mẫu thử tối ưu, cần cân chính xác 3 mức khối lượng mẫu phytosome tương ứng với 0,010 g, 0,020 g và 0,050 g, sau đó hòa tan trong 10 ml nước và ly tâm ở 5000 vòng/phút trong 30 phút Tiếp theo, lọc qua màng lọc 0,22 μm và tiến hành phân tích trên hệ thống HPLC theo điều kiện đã chọn Lặp lại 2 lần cho mỗi mức khối lượng mẫu thử để ghi nhận giá trị diện tích pic trung bình, so sánh các kết quả và xác định khối lượng mẫu thử phù hợp nhất cho các chất cần định lượng.
2.2.1.3 Thẩm định quy trình định lượng
Tính tương thích hệ thống
Mục đích: Đảm bảo hệ thống sắc ký HPLC-PDA có hiệu năng phù hợp để xác định độ phân giải và độ lặp lại đối với phép phân tích.
Tiến hành: Triển khai lặp lại 6 lần dung dịch mẫu thử theo điều kiện đã khảo sát Ghi nhận các thông số theo yêu cầu ở Bảng 2.3
Bảng 2.4 Các thông số sắc ký và yêu cầu theo hướng dẫn ICH
Hệ số bất đối 0,8 ≤ As ≤ 1,5 Độ phân giải Rs > 1,5
Thời gian lưu (phút) RSD ≤ 2 %
Mục tiêu: Đảm bảo hệ thống sắc ký có khả năng đánh giá chắc chắn một chất phân tích khi có mặt các thành phần khác có thể có trong mẫu thử.
Tiến hành: Tiêm các dung dịch mẫu trắng, hỗn hợp các chất chuẩn, mẫu thử và mẫu thử thêm chuẩn phân tích trên hệ thống sắc ký theo điều kiện đã khảo sát Ghi nhận và so sánh các sắc ký đồ, thời gian lưu của các mẫu trên.
- Sắc ký đồ mẫu thử chứa các pic có thời gian lưu tương ứng sắc ký đồ các chất chuẩn đối chiếu.
- Sắc ký đồ mẫu trắng không có sự hiện diện của các pic trong mẫu thử.
- Chất cần định lượng phải có pic tách hoàn toàn với các pic khác
- Phổ UV của các pic trong mẫu thử, mẫu thử thêm chuẩn và hỗn hợp chất đối chiếu phải giống nhau.
Mục tiêu: Nhằm thể hiện kết quả phân tích thu được tỷ lệ với nồng độ (trong khoảng nhất định) của chất phân tích trong mẫu thử.
Tiến hành: Pha 6 dung dịch chuẩn có nồng độ tăng dần trong khoảng 80 – 120 % so với nồng độ mẫu thử Tiến hành sắc ký các dung dịch này, ghi nhận kết quả sắc ký đồ và các thông số cần thiết để xác định phương trình hồi quy, hệ số tương quan tuyến tính giữa nồng độ chất chuẩn trong mẫu Kết quả này được đánh giá bằng phương pháp thống kê theo phương pháp bình phương tối thiểu, phương trình y = ax + b.
Yêu cầu hệ số tương quan tuyến tính đạt R2 ≥ 0,995 Kiểm định tính thích hợp của mô hình hồi quy tuyến tính sử dụng kiểm định F và kiểm tra ý nghĩa của các hệ số hồi quy thông qua kiểm định t.
Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
Mục tiêu: Xác định hàm lượng thấp nhất của các chất phân tích trong mẫu thử có thể phát hiện được (giới hạn phát hiện - LOD) và có thể xác định được độ đúng và độ lặp lại phù hợp (giới hạn định lượng - LOQ).
Tiến hành: Mẫu đối chiếu được pha loãng ở các nồng độ khác nhau và phân tích ở điều kiện sắc ký đã lựa chọn Xác định các thông số S và N, thiết lập tỷ số S/N, trong đó S là tín hiệu chiều cao của pic đối chiếu trong dung dịch chuẩn, N là tín hiệu chiều cao của nhiễu đường nền.
Yêu cầu: LOD có tỷ số S/N là 2/1 hoặc 3/1; LOQ được suy ra từ giá trị LOD với tỷ số của S/N là 9/1 hoặc 10/1. Độ lặp lại
Mục tiêu: Biểu thị độ chính xác trong cùng điều kiện tiến hành và trong khoảng thời gian ngắn, cụ thể là việc tiến hành thử nghiệm được thực hiện bởi một người trong cùng một phòng thí nghiệm, cùng một trang thiết bị và trong cùng một thời gian.
Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng naringin và melitidin trong phytosome
3.1.1 Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời naringin và melitidin toàn phần bằng HPLC
3.1.1.1 Xây dựng quy trình định lượng đồng thời naringin và melitidin toàn phần bằng HPLC
❖ Khảo sát các điều kiện sắc ký
Khảo sát chương trình rửa giải
Kết quả khảo sát các chương trình rửa giải được thể hiện trong Hình 3.1
Hình 3.1 Sắc ký đồ (SKĐ) của các chương trình rửa giải được khảo sát
Nhận xét: dựa vào SKĐ của các chương trình rửa giải khảo sát cho thấy, ở chương trình
1 xuất hiện pic tạp trước pic của naringin; chương trình 2 SKĐ không xuất hiện pic của melitidin; chương trình 3 xuất hiện pic tạp ngay phía trước pic của naringin; chương trình 4 xuất hiện đầy đủ pic của naringin và melitidin, các pic tạp được tách ra khỏi các pic của hoạt chất cần định lượng.
Kết luận: chương trình rửa giải được áp dụng trong quy trình định lượng là hỗn hợp dung dịch Methanol : acid acetic 0,1%, tỷ lệ 45 : 55 (tt/tt)
Khảo sát nhiệt độ cột sắc ký
Kết quả khảo sát nhiệt độ cột sắc ký được trình bày trong Bảng 3.1
Bảng 3.1 Kết quả khảo sát nhiệt độ cột sắc ký
Diện tích pic (àV.s) naringin
Hệ số bất đối của pic naringin
Diện tích pic (àV.s) melitidin
Hệ số bất đối của pic melitidin
Nhận xét: Khi nhiệt độ cột ở mức 35 o C, có sự gia tăng diện tích pic của melitidin và hệ số bất đối nằm trong giới hạn cho phép (0,8 < As < 1,5)
Kết luận: lựa chọn nhiệt độ cột là 35 o C cho quy trình định lượng.
Kết quả khảo sát điều kiện sắc ký:
- Thiết bị: Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Water 2895e HPLC – PDA, phần mềm EMPOWER 3
- Bước sóng phát hiện: 283 nm
- Pha tĩnh: cột sắc ký InertSustain C18 HPLC Column (5 àm; 250 x 4,6 mm)
- Pha động: hỗn hợp dung dịch Methanol : acid acetic 0,1%, tỷ lệ 45 : 55 (tt/tt)
- Tốc độ dòng: 1 ml/phút
- Thế tớch tiờm mẫu: 10 àl
- Thời gian phân tích: 45 phút.
❖ Khảo sát điều kiện xử lý mẫu
Khảo sát dung môi hòa tan mẫu
Tiến hành như Mục 2.3.1.2 Kết quả cho thấy hai dung môi nước và acetonitril không hòa tan được mẫu, kết quả khảo sát của các dung môi còn lại được trình bày như sau:
Hình 3.2 Biểu đồ kết quả diện tích pic của naringin và melitidin trong khảo sát dung môi hòa tan mẫu
Nhận xét: Dựa vào biểu đồ cho thấy MeOH 100% có khả năng hòa tan mẫu tốt nhất so với các dung môi còn lại.
Kết luận: Chọn MeOH 100% làm dung môi hoàn tan mẫu trong quy trình định lượng.
Khảo sát phương pháp hoà tan mẫu
Tiến hành như Mục 2.3.1.2 Kết quả khảo sát phương pháp hoà tan mẫu được trình bày như sau:
Hình 3.3 Biểu đồ kết quả diện tích pic của naringin và melitidin trong khảo sát phương pháp hòa tan mẫu
Nhận xét: Dựa vào biểu đồ cho thấy giữa các phương pháp hòa tan mẫu không có sự khác biệt nhiều, trong đó phương pháp lắc đều hòa tan được thực hiện đơn giản và cho khả năng hòa tan hoạt chất tốt hơn so với các phương pháp còn lại.
Kết luận: Chọn lắc đều hòa tan là phương pháp hòa tan mẫu trong quy trình định lượng.
Khảo sát thể tích dung môi hòa tan mẫu
Tiến hành như Mục 2.3.1.2 Kết quả khảo sát thể tích dung môi hoà tan mẫu được trình bày như sau:
Hòa tan Siêu âm Khuấy từ Vortex
Hình 3.4 Biểu đồ kết quả diện tích pic của naringin và melitidin trong khảo sát thể tích dung môi hòa tan mẫu
Nhận xét: Dựa vào biểu đồ cho thấy thể tích dung môi hòa tan mẫu là 10 ml có khả năng hòa tan mẫu tốt hơn 5 ml và không chênh lệch so với thể tích hòa tan mẫu là 20 ml
Kết luận: Chọn 10 ml là thể tích dung môi hòa tan mẫu trong quy trình định lượng.
3.1.1.2 Thẩm định quy trình định lượng đồng thời naringin và melitidin toàn phần bằng HPLC
Dung dịch chuẩn gốc (naringin, melitidin): cân chính xác khoảng 10 mg chất chuẩn tương ứng cho vào bình định mức 10 ml Thêm khoảng 8 ml methanol, lắc đều, thêm methanol đến vạch Dung dịch thu được có nồng độ khoảng 1000 ppm Lọc qua màng lọc 0,22 àm.
Chuẩn bị dung dịch chuẩn naringin (600 ppm):- Lấy chính xác 3 ml dung dịch chuẩn gốc.- Cho vào bình định mức 5 ml.- Thêm methanol đến vạch, lắc đều.- Lọc qua màng lọc 0,22 µm.
Mẫu chuẩn (melitidin): Lấy chính xác 1 ml dung dịch chuẩn gốc, cho vào bình định mức 50 ml, thêm methanol đến vạch, lắc đều Dung dịch thu được có nồng độ là
20 ppm Lọc qua màng lọc 0,22 àm.
Mẫu thử: Cân chính xác khoảng 0,0500 g mẫu phytosome vào bình định mức 10 ml, thêm khoảng 8 ml methanol, lắc đều hoà tan, thêm methanol đến vạch Lọc qua màng lọc 0,22 àm trước khi phõn tớch trờn hệ thống HPLC theo điều kiện đó chọn.
Tính tương thích hệ thống
Bảng 3.2 Kết quả tính tương thích hệ thống của quy trình định lượng đồng thời naringin và melitidin toàn phần
Số lần tiêm naringin melitidin
Bảng 3.3 Kết quả các thông số sắc ký của naringin và melitidin Yêu cầu theo ICH Kết quả naringin Kết quả melitidin
PA < PT PA (0,203) < PT (0,389) PA (5,061) < PT (8,943) k ’ ≥1 k ’ = 2,09 k ’ = 4,43
Nhận xét: điều kiện sắc ký cho kết quả có độ lặp lại cao về thời gian lưu, diện tích pic với giá trị độ lệch chuẩn tương đối RSD < 2% với cả 2 chất chuẩn naringin và melitidin.Các thông số sắc ký đều nằm trong khoảng giới hạn phù hợp theo yêu cầu của ICH.
Kết luận: Quy trình định lượng đạt tính tương thích hệ thống
Tiến hành như Mục 2.3.1.3 Kết quả được trình bày như sau:
Hình 3.5 Sắc ký đồ khảo sát tính đặc hiệu của naringin và melitidin trong quy trình định lượng đồng thời naringin và melitidin toàn phần
Hình 3.6 Kết quả khảo sát tính đặc hiệu của quy trình định lượng đồng thời naringin và melitidin toàn phần
Bảng 3.4 Kết quả diện tích pic các mẫu trong khảo sát tính đặc hiệu của quy trình định lượng đồng thời naringin và melitidin toàn phần
Nhận xét: Từ kết quả cho thấy mẫu trắng không có tín hiệu của 2 pic naringin và melitidin; thời gian lưu và phổ UV của 2 pic này tương đương trong mẫu chuẩn, mẫu thử và thử thêm chuẩn Đồng thời, thấy rõ sự gia tăng diện tích đỉnh của naringin và melitidin trong mẫu thử thêm chuẩn so với mẫu thử.
Kết luận: Quy trình định lượng đạt tính đặc hiệu
Tiến hành như Mục 2.3.1.3 Kết quả được trình bày như sau:
Bảng 3.5 Kết quả khảo sát tính tuyến tính của naringin
Bảng 3.6 Kết quả khảo sát tính tuyến tính của melitidin
Bảng 3.7 Biện giải phương trình hồi quy tuyến tính của naringin và melitidin
Phương trình tương quan hồi quy y = 16767x + 307036 y = 14938x – 96,603
P value < 0,05 (hệ số a có ý nghĩa) Có ý nghĩa Có ý nghĩa
P value < 0,05 (hệ số b có ý nghĩa) Không có ý nghĩa Không có ý nghĩa
Trong các khoảng nồng độ đã khảo sát, diện tích pic có mối liên hệ tuyến tính với nồng độ chất khảo sát, với hệ số tương quan R2 gần bằng 1 (0,9993 và 0,9997) Kết quả này cho thấy sự tương quan tuyến tính rất chặt chẽ giữa diện tích pic và nồng độ các chất khảo sát.
Kết luận: quy trình định lượng đáp ứng yêu cầu về đường chuẩn và khoảng tuyến tính
Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
Tiến hành như Mục 2.3.1.3 Kết quả được trình bày như sau: y = 14938x 96,603
Hình 3.7 SKĐ ở nồng độ LOD của naringin và melitidin
Bảng 3.8 Nồng độ LOD và LOQ của hai chất khảo sát
LOQ (àg/ml) naringin 0,10 0,34 melitidin 0,27 0,97 Độ lặp lại
Tiến hành như Mục 2.3.1.3 Kết quả được trình bày như sau:
Bảng 3.9 Kết quả khảo sát độ lặp lại và hàm lượng của naringin, melitidin toàn phần trong mẫu Phytosome
Khối lượng cân (mg) naringin melitidin
Nhận xét: Trong thực nghiệm khảo sát độ lặp lại, hàm lượng naringin toàn phần trong
Phytosome là 10,162 % và melitidin là 0,339 % Giá trị RSD % < 2 %.
Kết luận: Quy trình định lượng đạt yêu cầu của khảo sát độ lặp lại. Độ chính xác liên ngày
Tiến hành như Mục 2.3.1.3 Kết quả được trình bày như sau:
Bảng 3.10 Hàm lượng của naringin và melitidin toàn phần trong khảo sát độ chính xác trung gian
Khối lượng cân (mg) naringin melitidin
Nhận xét: So sánh kết quả giữa các mẫu thực hiện khảo sát độ lặp lại và độ chính xác liên ngày cho thấy giá trị RSD % hàm lượng của naringin và melitidin toàn phần trong phytosome đều < 2 %.
Kết luận: Quy trình định lượng đạt độ chính xác trung gian. Độ đúng (độ phục hồi)
Tiến hành như Mục 2.3.1.3 Kết quả được trình bày như sau:
Bảng 3.11 Kết quả độ đúng của naringin
Khối lượng sẵn có (mg)
Khối lượng thêm vào (mg)
Khối lượng lý thuyết (mg)
Khối lượng thực tế (mg)
Bảng 3.12 Kết quả độ đúng của melitidin
Khối lượng sẵn có (mg)
Khối lượng thêm vào (mg)
Khối lượng lý thuyết (mg)
Khối lượng thực tế (mg)
Nhận xét: quy trình định lượng có độ phục hồi của naringin từ 98,15 – 101,54 % (yêu cầu tỷ lệ phục hồi từ 98 – 102 %), độ phục hồi của melitidin từ 97,75 – 104,18 % (yêu cầu tỷ lệ phục hồi từ 95 – 105 %).
Kết luận: Quy trình định lượng đạt yêu cầu về độ đúng.
3.1.2 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng đồng thời naringin và melitidin dạng tự do bằng HPLC
3.1.2.1 Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời naringin và melitidin dạng tự do bằng HPLC
❖ Điều kiện sắc ký Điều kiện sắc ký được áp dụng trong phương pháp định lượng đồng thời naringin và melitidin dạng tự do tương tự như điều kiện sắc ký của phương pháp định lượng đồng thời naringin và melitidin toàn phần Điều kiện sắc ký được triển khai như sau:
- Thiết bị: Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Water 2895e HPLC – PDA, phần mềm EMPOWER 3
- Bước sóng phát hiện: 283 nm
- Pha tĩnh: cột sắc ký InertSustain C18 HPLC Column (5 àm; 250 x 4,6 mm)
- Pha động: hỗn hợp dung dịch Methanol : acid acetic 0,1%, tỷ lệ 45 : 55 (tt/tt)
- Tốc độ dòng: 1 ml/phút
- Thế tớch tiờm mẫu: 10 àl
- Thời gian phân tích: 45 phút.
❖ Khảo sát khối lượng mẫu thử
Tiến hành như Mục 2.3.1.2 Kết quả khảo sát khối lượng của mẫu thử được trình bày như sau:
Khối lượng khảo sát (mg)
Nhận xét: mẫu thử có khối lượng 20 mg cho độ hòa tan hoạt chất và độ ổn định về diện tích pic của hoạt chất cao hơn hai khối lượng thử nghiệm còn lại
Kết luận: chọn khối lượng cân của mẫu thử trong quy trình định lượng hoạt chất dạng tự do là 20 mg.
3.1.2.2 Thẩm định quy trình định lượng đồng thời naringin và melitidin dạng tự do bằng HPLC
Nghiên cứu bào chế phytosome từ cao vỏ bưởi ở quy mô phòng thí nghiệm
Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ cao vỏ bưởi : PL (kl/kl) đến các đặc tính của phytosome bằng cách thay đổi tỷ lệ cao vỏ bưởi : PL trong các công thức ở các mức 1:1, 1:2, 1:3, 1:4 và 1:5.
Tiến hành bào chế các mẫu phytosome theo phương pháp bốc hơi dung môi với thời gian phản ứng là 3 giờ, nhiệt độ phản ứng là 60 o C, tốc độ của hệ thống cô quay là
50 vòng/phút Các mẫu được bào chế với các tỷ lệ cao vỏ bưởi và PL khác nhau được đánh giá KTTP, PDI, thế Zeta và hiệu suất phytosome hóa Kết quả nghiên cứu được thể hiện trong bảng và hình sau:
Bảng 3.24 Đặc tính của phytosome cao vỏ bưởi được vào chế với tỷ lệ cao vỏ bưởi : PL (kl/kl) khác nhau (n = 3)
Tỷ lệ cao vỏ bưởi : PL KTTP (nm) PDI Thế Zeta
Hình 3.11 Mối tương quan giữa tỷ lệ cao vỏ bưởi : PL và hiệu suất phytosome hóa
H iệ u s uấ t p hy to so m e h óa ( % )
Tỷ lệ cao vỏ bưởi : PL (kl/kl)
Tỷ lệ cao vỏ bưởi so với phospholipid (PL) ảnh hưởng đến hiệu suất phytosome hóa Tỷ lệ cao vỏ bưởi:PL 1:5 mang lại hiệu suất phytosome hóa cao nhất Các thông số phân bố kích thước hạt (PDI) và thế zeta của hỗn dịch phytosome ở tỷ lệ này đảm bảo sự bền vững của hỗn dịch, cho thấy sự phức hợp ổn định giữa PL và các thành phần hoạt chất trong cao vỏ bưởi.
Kết luận: lựa chọn tỷ lệ cao vỏ bưởi : PL là 1:5 cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của một số thông số của quy trình bào chế đến đặc tính của phytosome
3.2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng
Khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến các đặc tính của phytosome bằng cách thay đổi thời gian phản ứng trong các công thức ở các mức 3 giờ, 4 giờ và 5 giờ.
Tiến hành bào chế các mẫu theo phương pháp bốc hơi dung môi với tỷ lệ cao vỏ bưởi : PL là 1:5, nhiệt độ phản ứng là 60 o C, tốc độ của hệ thống cô quay là 50 vòng/phút. Các mẫu được bào chế với các mức thời gian khác nhau được đánh giá các đặc tính gồm KTTP, PDI, thế Zeta và hiệu suất phytosome hóa Kết quả nghiên cứu được thể hiện trong bảng sau:
Bảng 3.25 Đặc tính của phytosome cao vỏ bưởi được vào chế với các mức thời gian phản ứng khác nhau (n = 3)
Thời gian phản ứng (giờ) KTTP (nm) PDI Thế Zeta
Nhận xét: Dựa vào bảng kết quả nhận thấy thời gian phản ứng là 5 giờ cho hiệu suất phytosome hoá cao nhất (52,43%) Kết quả phân tích phương sai 1 yếu tố cho thấy sự chênh lệch hiệu suất khi tăng thời gian phản ứng khác nhau không có ý nghĩa thống kê (pvalue = 0,777 > 0,05) Các chỉ số KTTP, PDI và thế Zeta không chênh lệch nhiều khi thay đổi thời gian phản ứng Do đó, lựa chọn thời gian phản ứng là 3 giờ để thời gian bào chế không kéo dài, tiết kiệm chi phí cung cấp năng lượng.
Kết luận: lựa chọn thời gian của phản ứng tạo phytosome là 3 giờ.
3.2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng
Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng đến các đặc tính của phytosome bằng cách thay đổi nhiệt độ phản ứng trong các công thức ở các mức 60 o C, 70 o C và 80 o C
Để chế tạo phytosome, các mẫu hỗn hợp vỏ bưởi và phospholipid theo tỷ lệ 1:5 đã được bào chế bằng phương pháp bốc hơi dung môi trong 3 giờ, với tốc độ quay của hệ thống cô quay là 50 vòng/phút Các đặc tính của phytosome bao gồm kích thước hạt trung bình (KTTP), chỉ số phân bố kích thước hạt (PDI), thế Zeta và hiệu suất phytosome hóa đã được đánh giá để xác định thời gian tối ưu cho quá trình bào chế.
Bảng 3.26 Đặc tính của phytosome cao vỏ bưởi được vào chế với các mức nhiệt độ phản ứng khác nhau (n = 3)
Nhiệt độ phản ứng ( o C) KTTP (nm) PDI Thế Zeta
Nhận xét: Hiệu suất phytosome hóa không tăng khi gia tăng nhiệt độ phản ứng tạo phức
Phân tích phương sai một yếu tố cho thấy ở nhiệt độ 60°C, hiệu suất phytosome đạt mức cao nhất (51,99%) Kết quả này có ý nghĩa thống kê khi so sánh với các nghiệm thức khác (pvalue = 0,007 < 0,05) Sự thay đổi nhiệt độ phản ứng dẫn đến sự khác biệt về kích thước hạt trung bình và phân bố kích thước hạt trung bình của các mẫu phytosome, nhưng sự chênh lệch không đáng kể.
Kết luận: lựa chọn nhiệt độ tạo phức là 60 o C cho quá trình bào chế phytosme
3.2.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ máy cô quay
Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ máy cô quay đến các đặc tính của phytosome bằng cách thay đổi tốc độ máy cô quay trong các công thức ở các mức 50 vòng/phút, 100 vòng/phút và 150 vòng/phút
Tiến hành bào chế các mẫu theo phương pháp bốc hơi dung môi với tỷ lệ cao vỏ bưởi : PL là 1:5, thời gian phản ứng là 3 giờ, nhiệt độ phản ứng là 60 o C Các mẫu được bào chế với tốc độ máy cô quay khác nhau được đánh giá các đặc tính gồm KTTP, PDI, thế Zeta và hiệu suất phytosome hóa Kết quả nghiên cứu được thể hiện trong bảng sau:
Bảng 3.27 Đặc tính của phytosome cao vỏ bưởi được bào chế khi thay đổi tốc độ của máy cô quay (n = 3)
Tốc độ máy cô quay (vòng/phút) KTTP (nm) PDI Thế Zeta
Nhận xét: Khi tăng tốc độ máy cô quay từ 50 lên 150 vòng/phút, KTTP của phytosome có xu hướng giảm và phân bố đều hơn Hiệu suất phytosome hóa tăng khi tăng tốc độ máy cô quay, đạt được cao nhất ở tốc độ 150 vòng/phút Tuy nhiên, đề tài quyết định lựa chọn tốc độ của máy cô quay là 50 vòng/phút nhằm tạo điều kiện thuận lợi khi tiến hành nâng quy mô với bình cầu dung tích 20 lít
Kết luận: chọn tốc độ quay của hệ thống cô quay là 50 vòng/phút
Từ kết quả của các phần khảo sát, thông số của quy trình bào chế phytosome cao vỏ bưởi bằng phương pháp bốc hơi dung môi như sau:
Tỷ lệ cao vỏ bưởi : PL là 1:5
Thời gian phối hợp hoạt chất với PL: 3 giờ
Tốc độ quay của hệ thống cô quay khi phối hợp hoạt chất, PL: 50 vòng/phút
3.2.3 Chứng minh sự hình thành phức hợp giữa cao vỏ bưởi và PL trong phytosome cao vỏ bưởi
3.2.3.1 Phổ hồng ngoại (FT – IR)
Kết quả phân tích phổ hồng ngoại (FT – IR) của các mẫu: cao vỏ bưởi, Lipoid s100, hỗn hợp vật lý và phytosome cao vỏ bưởi được trình bày như sau:
Hình 3.12 Phổ IR của: (A) cao vỏ bưởi, (B) Lipoid s100, (C) Hỗn hợp vật lý, (D)
Nhận xét: dựa trên các băng sóng hấp thụ IR đặc trưng của từng nhóm chức, xác định được số sóng của các nhóm chức đặc trưng của nguyên liệu và PL
Phổ IR của cao vỏ bưởi xuất hiện số sóng đặc trưng cho nhóm OH thuộc nhóm flavonoid là 3432 cm -1 và 3311 cm -1
Về xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời naringin và melitidin
Đánh giá công thức điều chế phytosome cao vỏ bưởi có ý nghĩa khi hàm lượng hoạt chất được phytosome hóa được xác định đúng và chính xác Đề tài lựa chọn naringin và melitidin là hoạt chất cần xác định cho quy trình định lượng bởi vì naringin là hoạt chất chính tạo nên các tác dụng sinh học của cao vỏ bưởi 66 ; đối với melitidin, tuy chỉ chiếm một tỷ lệ nhỏ trong cao vỏ bưởi nhưng đây là một flavonoid có các tác dụng dược lý như hạ đường huyết và giảm mỡ máu 67 , được phân lập ở vỏ bưởi trồng tại Bình Dương, là địa phương mà nhóm nghiên cứu của khoa Dược – Đại học Bình Dương đã tiến hành thu thập bưởi để tạo nên cao vỏ bưởi chuẩn hóa, cung cấp nguyên liệu cho đề tài này
Trong các nghiên cứu bào chế phytosome, việc đánh giá phần trăm hoạt chất đã liên kết với phospholipid là một trong những chỉ tiêu chất lượng quan trọng Trong hầu hết các nghiên cứu gần đây về bào chế phytosome, phương pháp dùng để đánh giá hiệu suất phytosome hóa thường được sử dụng là phương pháp sử dụng dung môi hòa tan chọn lọc 60,62,68 Yêu cầu của phương pháp này là sử dụng dung môi có khả năng hòa tan tốt phức hợp nhưng không hòa tan hoạt chất tự do, hoạt chất không tham gia tạo phức tủa lại và được loại đi khi ly tõm và lọc qua màng lọc 0,22 àm, dung mụi hũa tan chọn lọc thường được sử dụng là Cloroform Phương pháp trên đã được sử dụng để đánh giá hiệu suất phytosome hóa đối với phytosome cao bạch quả, phytosome quercetin, phytosme silybin… Tuy nhiên, tính chọn lọc không hoàn toàn của dung môi sẽ gây ra sai số cho phương pháp, khi phần hoạt chất tự do vẫn có khả năng hòa tan vào dung môi, đồng thời cloroform dễ bay hơi sẽ khiến cho tỷ lệ hoạt chất được phytosome hóa tính toán được cao hơn so với tỷ lệ hoạt chất được phytosome hóa thực tế
Trong nghiên cứu bào chế phytosome cao vỏ bưởi, việc tính hiệu suất phytosome hóa bằng phương pháp sử dụng dung môi hòa tan chọn lọc gặp nhiều khó khăn, do hoạt chất cần định lượng phân bố trong cao vỏ bưởi vốn là một hỗn hợp của nhiều chất Chính vì vậy, đề tài lựa chọn phương pháp định lượng gián tiếp, bằng cách định lượng hàm lượng hoạt chất toàn phần trong phytosome (bao gồm hoạt chất dạng tự do và hoạt chất trong phức hợp phytosome) và định lượng hoạt chất dạng tự do, từ đó có thể xác định được lượng hoạt chất trong phức hợp phytosome bằng hiệu số giữa hàm lượng hoạt chất toàn phần và hàm lượng hoạt chất dạng tự do Đối với quy trình định lượng hoạt chất toàn phần trong phytosome, đề tài đã tiến hành khảo sát chương trình rửa giải và nhiệt độ của cột sắc ký để đảm bảo các pic của naringin và melitidin có thể tách rời nhau cũng như tách hoàn toàn với các pic tạp cùng với thời gian phân tích hợp lý Về công đoạn xử lý mẫu định lượng, đề tài đã xác định được MeOH là dung môi thích hợp nhất để hoàn tan hoàn toàn hoạt chất trong mẫu cần phân tích, bên cạnh đó phương pháp lắc đều hòa tan giúp tiết kiệm thời gian và công sức so với các phương pháp hòa tan mẫu còn lại cùng với thể tích pha mẫu là 10 ml Quy trình định lượng hoạt chất toàn phần trong phytosome bằng hệ thống sắc ký HPLC – PDA đã được thẩm định theo tiêu chuẩn của ICH Kết quả thẩm định cho thấy quy trình định lượng đạt các yêu cầu về tính tương thích hệ thống, tính đặc hiệu, độ lặp lại, độ chính xác liên ngày, độ đúng và tính tuyến tính Đối với quy trình định lượng hoạt chất dạng tự do, yêu cầu đặt ra là cần tìm một dung môi có khả năng hòa tan hoạt chất dạng tự do chưa tạo phức với phospholipid và không phá hủy cấu trúc của phytosome Theo kết quả khảo sát dung môi hòa tan mẫu đã tiến hành ở quy trình định lượng hoạt chất toàn phần, nước và acetonitril là hai dung môi không hòa tan phức hợp phytosome Nước được lựa chọn là dung môi hòa tan hoạt chất tự do bởi các tính chất sau: có khả năng hòa tan naringin và melitidin dạng tự do mà không ảnh hưởng đến cấu trúc của phytosome; an toàn và thân thiện với môi trường; không bay hơi giúp quy trình phân tích đạt tính chính xác cao Đề tài đã tiến hành khảo sát khối lượng mẫu cần sử dụng để phân tích nhằm đảm bảo lượng hoạt chất tự do có trong mẫu hòa tan được tối đa trong nước và đảm bảo tính ổn định của quy trình định lượng Quy trình định lượng hoạt chất dạng tự do bằng hệ thống sắc ký HPLC – PDA đã được thẩm định theo tiêu chuẩn của ICH Kết quả thẩm định cho thấy quy trình định lượng đạt các yêu cầu về tính tương thích hệ thống, tính đặc hiệu, độ lặp lại, độ chính xác liên ngày, độ đúng và tính tuyến tính
Kết quả nghiên cứu cho thấy, hiệu suất phytosome hóa đạt được tối đa là 54,43 % kết quả trên khi được đối chiếu với các nghiên cứu trước đó thì có phần khiêm tốn Đối với các nghiên cứu đã được công bố về bào chế phytosome bằng cách tạo phức giữa phospholipid và các hoạt chất tinh khiết như quercetin, silybin, rutin 61 …, hiệu suất phytosome hóa thường đạt trên 90 % Tuy nhiên, cần nhận định rằng cao vỏ bưởi là một hỗn hợp của rất nhiều thành phần, do đó khả năng để phospholipid tạo liên kết với naringin và melitidin sẽ khó khăn hơn so với việc tạo liên kết với các hoạt chất này ở dạng tinh khiết, cũng có thể phospholipid đã tạo phức để hình thành phytosome với một số hoạt chất khác trong cao vỏ bưởi mà đề tài chưa xác định được Khi đối chiếu với nghiên cứu bào chế phytosome bằng cách tạo phức giữa phospholipid và cao dược liệu cho hiệu suất khá cao như phytosome cao saponin toàn phần từ Tam thất 59 hay phytosme cao bạch quả 60 thì phương pháp xác định hiệu suất phytosome hóa khác với đề tài phytosome cao vỏ bưởi nên có thể xảy ra những sai khác nhất định Nhìn chung, đề tài nghiên cứu bào chế phytosome từ cao vỏ bưởi đã đóng góp một phương pháp xác định hiệu suất phytosome hóa hữu ích và làm nền tảng cho các nghiên cứu nhằm nâng cao hiệu suất phytosome hóa sau này.
Về nghiên cứu bào chế phytosome cao vỏ bưởi
4.2.1 Về lựa chọn phương pháp bào chế
Phương pháp bốc hơi dung môi là lựa chọn phù hợp để bào chế phytosome cao vỏ bưởi Phương pháp này gồm các ưu điểm như quy trình đơn giản, ít giai đoạn, dung môi có khả năng thu hồi và tái sử dụng, không cần thiết bị phức tạp, dễ dàng nâng cấp quy mô sản xuất và phức hợp thu được dễ dàng ứng dụng trong dạng thuốc rắn như viên nén, viên nang.
4.2.2 Về xây dựng công thức và các thông số kỹ thuật của quá trình bào chế
Về loại phospholipid: nghiên cứu đã sử dụng nguyên liệu với tên thương mại là Lipoid s100 với thành phần là phosphatidylcholin đạt độ tinh khiết trên 94%, điều này giúp hạn chế những rủi ro về chất lượng sản phẩm không đảm bảo xuất phát từ nguyên liệu Tuy nhiên, nhược điểm của Lipoid s100 là giá thành còn cao, do đó có thể tiếp tục nghiên cứu để lựa chọn thêm một số loại phospholipid có giá thành rẻ hơn để cân bằng giữa hiệu quả và kinh tế khi áp dụng vào một số dạng bào chế như viên nén, viên nang…
Về tỷ lệ cao vỏ bưởi/phospholipid: tỷ lệ cao vỏ bưởi/phospholipid là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu suất phytosome hóa Khi tăng tỷ lệ cao vỏ bưởi : PL từ 1:1 đến 1:5 (kl/kl) thì hiệu suất phytosome hóa cũng tăng từ khoảng 12 % đến 52 % Tỷ lệ khối lượng giữa cao dược liệu và PL thay đổi từ 1:1 đến 1:5 cũng là tỷ lệ phổ biến trong các nghiên cứu bào chế phytosome Đề tài lựa chọn tỷ lệ cao vỏ bưởi : PL là 1:5 vì tỷ lệ 1:5 cho tỷ lệ hoạt chất được phytosome hóa cao hơn các tỷ lệ còn lại
Về thời gian tạo phức: thời gian tạo phức cần đủ dài để quá trình tạo phức được xảy ra tối ưu nhưng không nên quá kéo dài sẽ gây khó khăn cho việc nâng cấp cỡ lô bào chế trên quy mô lớn Qua quá trình thực nghiệm, khi tăng thời gian tạo phức hiệu suất phytosome hóa có tăng nhưng không đáng kể, do đó đề tài lựa chọn thời gian tạo phức là 3 giờ Đây cũng là khoảng thời gian được lựa chọn trong nghiên cứu bào chế phytosome cao bạch quả của tác giả Vũ Thị Quỳnh (2018) 60 cũng như bào chế phytosome cao rau má của tác giả Suprit D Saoji và cộng sự (2016) 65
Về nhiệt độ phối hợp cao vỏ bưởi với PL: qua khảo sát cho thấy nhiệt độ tạo phức ảnh hưởng không đáng kể đến hiệu suất phytosome hóa (hiệu suất phytosome hóa gần như không tăng khi gia tăng nhiệt độ phản ứng từ 60 o C lên đến 80 o C) Nhằm đảm bảo sự ổn định của hoạt chất và hạn chế sự bay hơi của dung môi ethanol tuyệt đối trong quá trình tạo phức nên đề tài lựa chọn nhiệt độ tạo phức là 60 o C
Về tốc độ quay của bình cất quay: qua thực nghiệm cho thấy khi tăng tốc độ của mình cất quay, hiệu suất phytosome hóa có tăng nhưng không đáng kể (từ 51,99 % lên 54,34 %) Do đó, để tiến tới việc bào chế phytosome cao vỏ bưởi ở những quy mô lớn hơn, nghiên cứu đã lựa chọn tốc độ quay của máy cô quay là 50 vòng/phút
4.2.3 Về một số đặc tính của phytosome cao vỏ bưởi
Về kích thước tiểu phân và phân bố kích thước tiểu phân: Kích thước tiểu phân là một trong những tính chất quan trọng cần khảo sát do có ảnh hưởng đến độ tan, tốc độ hòa tan, độ bền của hệ tiểu phân hay là tác nhân định vị tiểu phân trong hệ tuần hoàn… Kích thước tiểu phân có thể được xác định bằng nhiều phương pháp khác nhau như đo tốc độ lắng đọng, quan sát dưới kính hiển vi điện tử, tán xạ ánh sáng động hay nhiễu xạ laser Mỗi phương pháp có những ưu nhược điểm khác nhau, thường dựa vào kích thước tiểu phân của mẫu để lựa chọn phương pháp phù hợp 69 Trong đó, phương pháp tán xạ ánh sáng động (Dynamic light scattering - DLS) là là phương pháp phổ biến nhất để đo kích thước trung bình, chỉ số đa phân tán của các tiểu phân có kích thước từ vài nm đến
3 àm dựa trờn chuyển động Brown của tiểu phõn tạo ra hiện tượng tỏn xạ ỏnh sỏng Đề tài đã lựa chọn phương pháp DLS để đánh giá kích thước tiểu phân vì đây là phương pháp dễ thực hiện, không cần công đoạn xử lý mẫu phức tạp như các phương pháp hiển vi điện tử, thời gian đo mẫu ngắn giúp nhanh chóng đánh giá KTTP sau mỗi quy trình bào chế, độ lặp lại kết quả tương đối tốt và phù hợp với điều kiện trang thiết bị hiện có của phòng thí nghiệm Kết quả áp dụng phương pháp DLS cho kích thước tiểu phân trung bình của phytosome cao vỏ bưởi là 246,8 ± 3,7 nm Một số nghiên cứu đã chỉ ra khi KTTP của phytosome dưới 500 nm, phytosome vẫn có khả năng cải thiện hoạt tính sinh học cũng như cải thiện khả năng hấp thu qua đường tiêu hóa 62,70 Khi đưa ra giá trị KTTP, một thông số quan trọng đi kèm là chỉ số đa phân tán PDI Trong đề tài này, giá trị PDI = 0,305 ± 0,026 thấp hơn 0,4 cho thấy các tiểu phân phytosome cao vỏ bưởi có sự đồng nhất về mặt kích thước, qua đó đảm bảo sự ổn định cao của hệ
Về thế zeta: Thế zeta là yếu tố đánh giá độ ổn định của hệ phân tán nano thông qua đánh giá sự linh động của các tiểu phân trong môi trường nước Giá trị tuyệt đối thế zeta từ 30 mV đến 60 mV tạo hệ nano ổn định tĩnh điện học, nếu từ 5 – 15 mV sẽ giới hạn độ bền vững của hệ phân tán, từ 3 – 5 mV thường không bền 56 Hỗn dịch phytosome cao vỏ bưởi có giá trị tuyệt đối của thế Zeta > 30 mV góp phần chống kết tụ tiểu phân Thế Zeta của hỗn dịch phytosome mang giá trị âm là do nhóm phosphat của PL trong môi trường nước có pH trung tính
Về đánh giá sự hình thành phức hợp trong phytosome cao vỏ bưởi:
- Với phổ IR: phổ IR của phytosome cao vỏ bưởi có sự dịch chuyển số sóng đặc trưng của nhóm chức OH của flavonoid trong cao vỏ bưởi và nhóm phosphat của PL về số sóng thấp hơn cho thấy có sự tương tác giữa các nhóm chức đó So với phổ IR của HHVL thì không có sự dịch chuyển đáng kể của các số sóng đặc trưng của các nhóm chức trên Điều này bước đầu khẳng định có sự hình thành liên kết giữa hoạt chất trong cao vỏ bưởi và PL
- Với phổ DSC: dựa trên sự thay đổi hay mất đi của pic thu nhiệt của nguyên liệu so với phytosome cao vỏ bưởi để đánh giá sự tương tác của cao vỏ bưởi và PL Trên phổ DSC của phytosome cao vỏ bưởi, các pic thu nhiệt xuất hiện trong phổ DSC của cao vỏ bưởi đã biến mất, thay vào đó là sự xuất hiện của các pic thu nhiệt được dịch chuyển về mức nhiệt độ thấp hơn so với nguyên liệu PL Dựa trên những thay đổi đó có thể nhận thấy có sự tương tác giữa các thành phần trong cao vỏ bưởi và PL Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là không xác định được liên kết giữa hoạt chất với PL là liên kết gì cũng như nhóm chức nào đã tham gia liên kết
Nhìn chung, thông qua phân tích phổ IR và DSC bước đầu đưa ra được kết luận về sự hình thành phức hợp giữa thành phần hoạt chất trong cao vỏ bưởi và PL Tuy nhiên, để khẳng định chắc chắn sự hình thành phức hợp trong phytosome cao vỏ bưởi cần áp dụng thêm các phương pháp khác như phổ nhiễu xạ tia X, phổ khối, phổ cộng hưởng từ hạt nhân…
Kiến nghị
- Nghiên cứu nhằm nâng cao hiệu suất phytosome hóa của phytosome cao vỏ bưởi
- Theo dõi độ ổn định của phytosome cao vỏ bưởi
- Nghiên cứu quy trình phun sấy hoặc đông khô phytosome cao vỏ bưởi để áp dụng vào các dạng bào chế như viên nén, viên nang…
- Nghiên cứu tác dụng dược lý về bảo vệ gan và hạ đường huyết của phytosome cao vỏ bưởi, so sánh với cao vỏ bưởi sử dụng độc lập
1 Cheong Mun Wai, Liu Shao Quan, Zhou Weibiao, Curran Philip, Yu Bin Chemical composition and sensory profile of pomelo (Citrus grandis (L.) Osbeck) juice
Pomelo peel by-products contain valuable compounds with potential biological activities This study investigated the chemical composition and biological activities of extracts obtained from pomelo peel by-products using enzyme and ultrasound-assisted extractions Enzyme extraction yielded extracts rich in flavonoids and phenolics, exhibiting antioxidant, antibacterial, and anticancer properties Ultrasound-assisted extraction produced extracts with high levels of limonene and other terpenes, demonstrating insecticidal and antifungal activities These findings highlight the potential of pomelo peel by-products as a source of bioactive compounds for various applications in the food, pharmaceutical, and agricultural industries.
3 Đỗ Tất Lợi Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam NXB Hồng Đức; 2013
Citrus maxima peel powder supplementation has been found to possess hepatoprotective properties In a study published in Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine in 2015, researchers demonstrated that the supplementation prevented oxidative stress, fibrosis, and hepatic damage in rats treated with carbon tetrachloride (CCl4) These findings suggest that Citrus maxima peel powder could be a potential therapeutic agent for liver disorders.
5 Kumar Sanjay, Singh Inderjeet, Kohli Deepika, Joshi Jyoti, Mishra Ritesh Waste pomelo (Citrus maxima) peels–a natural source of antioxidant and its utilization in peanut oil for suppressing the development of rancidity Current Research in Nutrition and Food Science Journal 2019;7(3):800-806
6 Feng Tao, Wang Ke, Liu Fangfang, et al Structural characterization and bioavailability of ternary nanoparticles consisting of amylose, α-linoleic acid and β- lactoglobulin complexed with naringin International Journal of Biological Macromolecules 2017;99:365-374
7 Kumar R Pradeep, Abraham Annie PVP-coated naringenin nanoparticles for biomedical applications–in vivo toxicological evaluations Chemico-biological interactions 2016;257:110-118
8 Ali Saja H, Sulaiman Ghassan M, Al-Halbosiy Mohammad MF, Jabir Majid S, Hameed Anaheed H Fabrication of hesperidin nanoparticles loaded by poly lactic co- Glycolic acid for improved therapeutic efficiency and cytotoxicity Artificial cells, nanomedicine, and biotechnology 2019;47(1):378-394
9 Kalita Bhupen, Patwary Bhargab N Formulation and In Vitro Evaluation of Hesperidin-Phospholipid Complex and its Antioxidant Potential Current Drug Therapy 2020;15(1):28-36
10 Hoàng Văn Lương, Chử Văn Mến, Vũ Bình Dương, Nguyễn Văn Long Phytosome và ứng dụng trong công nghệ dược phẩm (tổng quan) Tạp Chí Y - Dược Học Quân Sự 2014;3-2014:11-16
11 Li Pan-lin, Liu Meng-hua, Hu Jie-hui, Su Wei-wei Systematic chemical profiling of Citrus grandis ‘Tomentosa’by ultra-fast liquid chromatography/diode-array detector/quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry Journal of pharmaceutical and biomedical analysis 2014;90:167-179
12 Yu Eun Ae, Kim Gon‐Sup, Lee Ji Eun, et al Flavonoid profiles of immature and mature fruit tissues of Citrus grandis Osbeck (Dangyuja) and overall contribution to the antioxidant effect Biomedical Chromatography 2015;29(4):590-594
13 Zhang Mingxia, Duan Changqing, Zang Yanyan, Huang Zhongwen, Liu Guojie The flavonoid composition of flavedo and juice from the pummelo cultivar (Citrus grandis (L.) Osbeck) and the grapefruit cultivar (Citrus paradisi) from China Food Chemistry 2011;129(4):1530-1536
14 Zhang Mingxia, Nan Haijuan, Wang Yanjie, Jiang Xiaoying, Li Zheng Comparison of flavonoid compounds in the flavedo and juice of two pummelo cultivars (Citrus grandis L Osbeck) from different cultivation regions in China Molecules
15 Zhao Yihan, Yang Xufeng, Hu Yuwei, et al Evaluation of carotenoids accumulation and biosynthesis in two genotypes of pomelo (Citrus maxima) during early fruit development Molecules 2021;26(16):5054
16 Kuo Ping-Chung, Liao Yu-Ren, Hung Hsin-Yi, et al Anti-inflammatory and neuroprotective constituents from the peels of Citrus grandis Molecules
17 Dugrand Audray, Olry Alexandre, Duval Thibault, Hehn Alain, Froelicher Yann, Bourgaud Frédéric Coumarin and furanocoumarin quantitation in citrus peel via ultraperformance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS)
Journal of Agricultural and Food Chemistry 2013;61(45):10677-10684
18 Tian Danmei, Wang Fangfang, Duan Menglong, et al Coumarin analogues from the Citrus grandis (L.) osbeck and their hepatoprotective activity Journal of agricultural and food chemistry 2019;67(7):1937-1947
19 Xu Chang-Jie, Fraser Paul D, Wang Wei-Jie, Bramley Peter M Differences in the carotenoid content of ordinary citrus and lycopene-accumulating mutants Journal of Agricultural and Food Chemistry 2006;54(15):5474-5481
20 Goh Rui Min Vivian, Lau Hazel, Liu Shao Quan, et al Comparative analysis of pomelo volatiles using headspace-solid phase micro-extraction and solvent assisted flavour evaporation LWT 2019;99:328-345
21 Fidrianny IRDA, Sari ELVIRA, Ruslan KOMAR Phytochemical content and antioxidant activities in different organs of pomelo (Citrus maxima [Burm.] Merr.) using
2, 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl and phosphomolybdenum assays Asian J Pharm Clin
22 Ibrahim Md, Amin Mohammad Nurul, Millat Md Shalahuddin, et al Methanolic extract of peel of citrus maxima fruits exhibit analgesic, CNS depressant and anti- inflammatory activities in Swiss albino mice Biology, Engineering, Medicine and Science Reports 2018;4(1):07-11
23 Ishida Momoko, Takekuni Chihiro, Nishi Kosuke, Sugahara Takuya Anti- inflammatory effect of aqueous extract from Kawachi-bankan (Citrus maxima) peel in vitro and in vivo Cytotechnology 2019;71(4):797-807
24 Ani Peace Nwanneka, Ochu Kalu Ezinne Anti-diabetic, anti-hyperlipidemic and hepatoprotective potential of shaddock (Citrus maxima) peel extract Acta Scientiarum
25 Lin Li-Yun, Huang Boa-Chan, Chen Kuan-Chou, Peng Robert Y Integrated anti- hyperlipidemic bioactivity of whole Citrus grandis [L.] osbeck fruits—multi-action mechanism evidenced using animal and cell models Food & Function
26 Kong Fansheng, Ding Zhendong, Zhang Kai, et al Optimization of extraction flavonoids from Exocarpium Citri Grandis and evaluation its hypoglycemic and hypolipidemic activities Journal of Ethnopharmacology 2020;262:113178
27 Oyedepot A, Babarinde SO Effects of shaddock (Citrus maxima) fruit juice on glucose tolerance and lipid profile in type-II diabetic rats Chem Sci Trans
28 Ulla Anayt, Alam Md Ashraful, Rahman Mosfiqur, et al Supplementation of Citrus maxima fruits peel powder improves glucose intolerance and prevents oxidative stress in liver of alloxan-induced diabetic rats Mediterranean Journal of Nutrition and
29 Liu Yilong, Ren Chuanhong, Cao Yunlin, et al Characterization and purification of bergamottin from Citrus grandis (L.) Osbeck cv Yongjiazaoxiangyou and its antiproliferative activity and effect on glucose consumption in HepG2 cells Molecules 2017;22(7):1227
30 An Ran, Wen Shuai, Li Dong-Li, et al Mixtures of tea and citrus maxima (pomelo) alleviate lipid deposition in HepG2 cells through the AMPK/ACC signaling pathway Journal of Medicinal Food 2020;23(9):943-951
An acidic polysaccharide was isolated and characterized from Citrus grandis 'Tomentosa' Its structure was composed of glucose, galactose, rhamnose, and glucuronic acid The polysaccharide exhibited significant anti-proliferative activity against LOVO and SW620 cancer cells, suggesting its potential as a therapeutic agent for colorectal cancer.
32 Mursiti S, Amalina ND, Marianti A Inhibition of breast cancer cell development using Citrus maxima extract through increasing levels of Reactive Oxygen Species (ROS) IOP Publishing; 2021:052005
33 Chivte Prajkta Satish, Pardhi Vinal Shivram, Joshi Vineeta Anil, Rani Ajitha A review on therapeutic applications of phytosomes Journal of Drug Delivery and Therapeutics 2017;7(5):17-21
34 Verma P, Ram A, Jha AK, Mishra A, Thakur A Phosphatidylcholine: a revolution in drug delivery technology Int J Pharm Sci Res 2010;1(2):1-12
35 Ghanbarzadeh Babak, Babazadeh Afshin, Hamishehkar Hamed Nano- phytosome as a potential food-grade delivery system Food bioscience 2016;15:126-
36 Khan Junaid, Alexander Amit, Saraf Swarnlata, Saraf Shailendra Recent advances and future prospects of phyto-phospholipid complexation technique for improving pharmacokinetic profile of plant actives Journal of controlled release
