TỔNG QUAN
Tổng quan Rutin
Rutin là 1 loại vitamin P Chữ P là chữ đầu của chữ perméabilité, tiếng Pháp có nghĩa là tính thấm
- Công thức phân tử: C 27 H 30 O 16, trọng lượng phân tử 610,51 ĐvC
- Tên IUPAC: 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-5,7-dihydroxy-3-[(2S,3R,4S,5S,6R)- 3,4,5-trihydroxy-6-{[(2R,3R,4R,5R,6S)-3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2- yl]oxymethyl]oxan-2-yl}oxychromen-4-one
Hình 1.1 Cấu trúc của Rutin [2]
- Tên gọi khác: Quercetin-3-rutosid, Eldrin, Oxerutin, Quercetin-3- rhamnoglucosid, Rutosise, Sclerutin, Sophorin [2]
- Bột kết tinh màu vàng hay vàng lục
- Tan trong ethanol và các dung dịch hydroxid kiềm, hơi tan trong ethanol thực tế không tan trong nước và diclomethan [13]
Theo dược điển Việt Nam V, các phương pháp định tính rutin [13]:
- Phương pháp A: So sánh phổ hồng ngoại
- Phương pháp B: Đo phổ hấp thụ tử ngoại
1.1.4 Định lƣợng Đề xác định hàm lượng trong chế phẩm hoặc dược liệu, người ta sử dụng các phương pháp sau:
- Phương pháp sắc kí lỏng cao áp
Rutin có nhiều tác dụng sinh học như kháng sinh, kháng nấm và chất chống dị ứng Gần đây, nhiều nghiên cứu đã cho thấy rutin còn có tác dụng tốt trong điều trị các bệnh mãn tính khác nhau như ung thư, tiểu đường, cao huyết áp và tăng cholesterol [2]
Rutin là một loại vitamin P, có tác dụng tăng cường sức chịu đựng của mao mạch Thiếu vitamin này sự chịu đựng của mao mạch có thể bị giảm, mao mạch dễ bị đứt vỡ, hiện tượng này trước đây người ta chỉ cho rằng do thiếu vitamin C, gần đây mới phát hiện ra sự liên quan với vitamin P [9]
Rutin làm bền và giảm tính thấm mao mạch, làm tăng sự bền vững của hồng cầu Rutin làm giảm trương lực cơ trơn và chống co thắt [14], chống phóng xạ tia X, viêm thận cấp [12]
Rutin có thể sử dụng như là một chất tiềm năng để kiểm soát đường huyết thông qua tăng cường hoạt tính của thụ thể kinase phụ thuộc insulin, do đó tăng khả năng kết hợp giữa đường và insulin và do đó gây tăng vận chuyển đường và tăng sự hấp thu glucose [2]
Rutin chống lại các rối loạn thoái hóa thần kinh do tích lũy prion bằng việc tăng sản xuất các yếu tố thần kinh và ức chế kích hoạt quá trình apoptotic trong tế bào thần kinh Những kết quả này cho thấy rutin có thể lâm sàng lợi ích cho bệnh prion và rối loạn thoái hóa thần kinh khác [18]
Rutin có tác dụng chống viêm ở da chuột chiếu xạ tia cực tím bởi ức chế sự biểu hiện của cyclooxygenase-2 và synthase nitric oxid cảm ứng [18]
Rutin được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như y học, công nghệ nhuộm màu thực phẩm, công nghệ bao màu
Trong y học, rutin được dùng chủ yếu để đề phòng những biến cố của bệnh xơ vữa động mạch, điều trị các trường hợp suy yếu tĩnh mạch, các trường hợp xuất huyết như chảy máu cam, ho ra máu, xuất huyết tử cung, phân có máu Rutin còn được dùng làm thuốc chữa trĩ, chống dị ứng, thấp khớp Ngoài ra, rutin còn được dùng trong các trường hợp tổn thương ngoài da do bức xạ làm cho vết thương mau lành sẹo [14]
Trong khoa mắt, rutin có thể được dùng cho các trường hợp viêm võng mạc có xuất hiện xuất huyết, chảy máu ở đáy mắt [8]
Rutin có thể sử dụng đơn độc hoặc kết hợp với các thuốc khác để nâng cao hiệu quả điều trị như:
- Vitamin C: Rutin làm tăng cường tác dụng của vitamin C đặc biệt là khả năng hấp thụ thuốc vào các cơ quan khác nhau Thường được dùng trong biểu hiện tổn thương mao mạch, xuất huyết dưới da, cao huyết áp
- Vincamin: dùng để chữa các chứng rối loạn tâm thần, cải thiện trí nhớ, chức năng thần kinh giác quan ở người già
- Nicotinamid: dùng trong các biểu hiện chức năng hay tổn thương thực thể của suy tĩnh-bạch mạch, giãn tĩnh mạch nguyên phát hay các cơn đau trĩ
- Ngoài ra còn có thể phối hợp với cholin, khellin, papaverin
1.1.7 Một số sản phẩm của rutin trên thị trường
Bảng 1.1 Một số sản phẩm của rutin trên thị trường
Tên thương mại Thành phần chính Hàm lượng Dạng bào chế
Mevon Rutin 500 mg Viên bao phim
Meflavon Rutin 500 mg Viên bao phim
Rutin-Vitamin C Rutin, vitamin C 50 mg Viên bao đường
Swanson Rutin Rutin 500 mg Viên nang mềm
Antioxidants Bio- Rutin complex Rutin, bioflavonoids 500 mg Viên nén
1.1.8 Một số nguồn chiết Rutin
Rutin được tìm thấy ở 62 họ thực vật với khoảng 150 loài thực vật, trong đó có 70 loài thuộc 28 họ có chứa rutin ở dạng vết [2]
Trong cây, rutin chủ yếu phân bố ở hoa (cây hòe, cây tam giác mạch), lá (cây bạch đằng, cây tam giác mạch)
Tuy có nhiều loài thực vật chứa rutin nhưng rutin chỉ được tách chiết từ những cây nguyên liệu có hàm lượng rutin cao như Ruta graveolens L có khoảng 2
%, Fagopyrum esculentum Moench có khooảng 4 %, Fagopyrum tataricum L có khoảng 6 %, Eucalyptus macrorrhyncha F.Muell có khoảng 8 %, Sophora japónica
Các phương pháp chiết xuất rutin từ hoa hòe dựa vào độ tan khác nhau của rutin trong các dung môi [11]
- Chiết bằng dung môi nước
- Chiết bằng dung môi cồn
- Chiết bằng dung môi là dung dịch kiềm loãng
Tổng quan phytosome
Phytosome là phức hợp của cao chiết dược liệu hoặc hoạt chất dược liệu được chuẩn hóa gắn với phospholipid [35] “Phyto” thành phần mang hoạt tính có nguồn gốc từ thực vật, “some” giống tế bào Phytosome có cấu trúc tương tự màng tế bào và được xem như hệ vận chuyển phyto-lipid Phytosome được tạo trong dung môi phân cực, liên kết hydro giữa phần phân cực của phospholipid (ví dụ nhóm phosphat) và phần phân cực của polyphenol (thành phần có hoạt tính sinh học) [24]
Hình 1.2 Cấu tạo của phytosome [2]
Hoạt chất : Các hoạt chất có nguồn gốc từ thực vật/ dược liệu, thường là hoạt chất nhóm polyphenol như: flavonoid (rutin, quercetin, silybin…), saponin, terpenoid,…
Trong phytosome, các nhóm phân cực của hoạt chất tương tác với nhóm phosphat và nhóm amonium của phospholipid thông qua liên kết hydro, hình thành sự sắp xếp không gian đặc trưng có thể được chứng minh bằng các loại phổ như phổ hồng ngoại IR, phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 H-NMR, phổ nhiễu xạ tia X, phổ phân tích nhiệt quét vi sai DSC [43]
Phospholipid: Phần đầu có tính thân nước gồm nhóm phosphat gắn với các dẫn xuất amin khác nhau, phần đuôi là hai chuỗi hydrocarbon có tính kỵ nước.
Hình 1.3 Cấu trúc phân tử của phosphatidylcholin đậu nành hydrogen hóa [16]
Vai trò của phospholipid trong phytosome:
- Nhóm phosphat, amoni của phospholipid tạo liên kết hydro với nhóm phân cực của dược chất, chính các liên kết này giúp phytosome có độ ổn định cao hơn các dạng bào chế khác [30]
- Phospholipid là phân tử lưỡng cực, trộn lẫn được trong môi trường thân nước và thân dầu, nên nếu được sử dụng như là chất mang dược chất sẽ giúp cải thiện độ tan và tốc độ hòa tan của dược chất, từ đó tăng khả năng hấp thu dược chất qua
- Phospholipid còn làm giảm sức căng bề mặt của hệ phân tán với dịch cơ thể, bằng cách đó phytosome dễ dàng được hòa tan trong dịch tiêu hóa và vận chuyển đến các mô trong cơ thể
- Phospholipid tự nhiên: Hay dùng nhất là phosphatidylcholin (PC) từ lecithin của trứng hoặc đậu tương, ngoài ra còn có phosphatidylethanolamin (PE), phosphatidylserin (PS), phosphatidylglycerol (PG),…
- Phospholipid tổng hợp: Phosphatidylcholin đậu nành được hydrogen hóa (HSPC), disteroyl phosphatidylcholin (DSPC), dioleylphosphatidylcholin (DOPC), dioleylphosphatidylethanolamin (DOPE),…
- Một số loại phospholipid khác như sphingolipid (sphingomyelin, sphingosin)
Lựa chọn phospholipid trong quá trình bào chế phytosome:
Việc lựa chọn phospholipid rất quan trọng, ảnh hưởng đến các đặc tính của phức hợp tạo thành Vì vậy, việc lựa chọn phải căn cứ trên các đặc điểm sau:
- Mức độ bão hòa của lipid: phospholipid không bão hòa (như phosphatidylcholin lòng đỏ trứng, phosphatidyl glycerol…) dễ bị peroxy hóa dẫn đến hỏng màng, rò rỉ dược chất Vì vậy, phospholipid bão hòa (như dipalmytoyl phosphatidylcholin, dipalmitidyl phosphatidic,…) được sử dụng nhiều hơn, để làm tăng độ ổn định của phytosome
- Để bào chế các chế phẩm có khả năng giải phóng dược chất nhanh thì màng cần có độ linh động cao, do đó phospholipid được lựa chọn thường có thành phần là các phospholipid chưa bão hòa và giảm hàm lượng cholesterol bổ sung vào màng
Phospholipid được sử dụng chủ yếu có nguồn gốc từ đậu nành và trứng, đặc biệt là phosphatidylcholin là một phospholipid chính trong màng tế bào [24]
Phosphatidylethanolamin (PE), phosphatidylserin (PS) và phosphatidylcholin (PC) là các phospholipid được dùng phổ biến trong bào chế phytosome PCs có một đầu cholin là thành phần của màng sinh học PCs là chất mang thích hợp để bao gói các hoạt chất có nguồn gốc thực vật đồng thời là chất dinh dưỡng có hiệu quả lâm sàng
1.2.3 Đặc điểm của Phytosme Đặc điểm hóa học [35]
Phytosome được tạo ra bởi phản ứng của phospholipid với chất trong thảo mộc được chuẩn hóa Hình ảnh quang phổ cho thấy liên kết hydro được hình thành giữa đầu phân cực của phospholopid (nhóm phosphat và ammonium) và các đầu phân cực của hoạt chất
Kích thước Phytosome thay đổi từ 50 nm đến vài trăm μm
Phytosome, khi tiếp xúc với nước, chuyển thành dạng micell giống liposome và quang phổ photon (PCS) cho thấy dạng liposome này có được do phytosome
Dữ liệu 1 H-NMR và 13 C-NMR cho thấy rằng chuỗi chất béo không thay đổi tín hiệu cả trong phospholipid tự do và trong phức hợp phytosome, các chuỗi acid béo dài không tham gia phản ứng mà chỉ tạo lớp áo xung quanh phần hoạt động
Các phức này thường hòa tan trong các dung môi aprotic, không hòa tan trong nước và tương đối không ổn định trong rượu Đặc điểm sinh học Ưu điểm của phytosome [29,35,20,33]:
- Cải thiện sinh khả dụng của tinh chất thảo dược và tăng tiêu hóa trong ruột
- Giúp các tinh chất thảo dược không có tính lipid hấp thu dễ dàng qua ruột
- Các thành phần của phytosome an toàn, được phép sử dụng trong bào chế dược phẩm, mỹ phẩm
- Ở dạng phytosome, các flavonoid được bảo vệ và đảm bảo sinh khả dụng cao khi tới gan, mặt khác phosphocholin cũng có tác dụng bảo vệ gan trong tự nhiên
- Cải thiện tính thấm của thuốc qua da
- PC được sử dụng trong phytosome là thành phần không thể thiếu của màng vì vậy ngoài vai trò là chất mang nó còn là nguồn cung cấp PC cho màng
- Quy trình sản xuất tương đối đơn giản, không đòi hỏi công nghệ phức tạp, hiệu suất cao
- Bền trong dịch dạ dày và chống lại hoạt động của các vi khuẩn đường ruột Ổn định hơn liposome do có liên kết hóa học giữa phospholipid và hoạt chất
ĐỐI TƯƠNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nội dung nghiên cứu
- Định lượng rutin bằng phương pháp đo quang phổ hấp thu UV - VIS
- Khảo sát độ tan của rutin trong các môi trường và hệ số phân bố của rutin
- Đánh khá một số đặc tính của phytosome: hình thức, độ tan trong các môi trường, hệ số phân bố, KTTP, phân bố KTTP, thế zeta, hiệu suất phytosome hóa
- Đánh giá khả năng tạo phức giữa rutin và phospholipid qua các phổ hồng ngoại (FT - IR), phân tích nhiệt vi sai (DSC), nhiễu xạ tia X (XRD).
Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp định lượng rutin bằng phương pháp đo quang được tham khảo và xây dựng lại theo nghiên cứu của Malay và các cộng sự [22]
Tìm bước sóng hấp thụ cực đại
Cân chính xác khoảng 25 mg rutin chuẩn, hòa tan vào vừa đủ 100 ml methanol Lấy 10 ml dung dịch trên cho vào bình định mức 100 ml, thêm methanol tới vạch, thu được dung dịch A có nồng độ 25 mg/L Tiến hành quét độ hấp thụ quang của dung dịch A ở dải bước sóng từ 800 - 200 nm Từ đó xác định được bước sóng hấp thụ cực đại của rutin dựa vào hình ảnh quang phổ
- Mẫu chuẩn: Từ dung dịch A ở trên, pha loãng với methanol thành các dung dịch có nồng độ lần lượt là 5 mg/L; 10 mg/L; 12,5 mg/L; 15 mg/L; 20 mg/L Đo độ hấp thu quang của các mẫu với mẫu trắng là methanol ở cực đại Xây dựng đường chuẩn và phương trình biểu diễn mối quan hệ giữa độ hấp thụ và nồng độ rutin để tính toán
- Mẫu thử: Mẫu thử đem lọc qua màng cellulose acetat 0,45 μm, đem pha loãng bằng methanol ở tỷ lệ nhất định để được nồng độ dung dịch thử trong khoảng
5 đến 20 mg/L Đo độ hấp thụ quang của mẫu thử ở bước sóng cực đại
Phytosome rutin được bào chế theo quy trình sau:
Hòa tan riêng biệt rutin PC, CH trong dung môi Sau đó kết hợp vào cốc có mỏ, khuấy từ để hình thành liên kết Dung môi được loại bỏ bằng phương pháp bốc hơi dưới áp suất chân không hoặc phun sấy Điều kiện và quy trình bào chế được biểu diễn trong Hình 2.1
Hình 2.1 Sơ đồ quy trình bào chế Phytosome rutin
Hòa tan trong dung môi (ethanol hoặc điclomethan)
Hòa tan trong dung môi (ethanol hoặc methanol)
Khuấy từ với tốc độ 150 vòng/phút, thời gian 3-16 giờ, nhiệt độ 25 – 50 °C
-Cô quay bốc hơi dung môi dưới áp suất dung môi
- - Áp lực súng phun:3,5 atm
- - Tốc độ phun: 1200 - 1600 (ml/giờ)
- - Tốc độ thổi khí: 800 l/giờ
Sản phẩm được bảo quản trong bình tránh ẩm ở nhiệt độ phòng
2.3.3 Xác định độ tan, hệ số phân bố của rutin, phytosome rutin bào chế
Xác định độ tan của rutin, phytosome rutin trong các môi trường
Các hệ đệm 1,2; hệ đệm 4,5; hệ đệm 6,8 (được pha theo quy trình trong Dược điển Việt Nam V) và nước cất
Hòa tan 1 lượng rutin, phytosome dư trong 20 ml các hệ đệm 1,2; 4,5; 6,8 và nước cất vào cốc có mỏ Khuấy từ 48 giờ ở nhiệt độ phòng sau đó đem ly tâm ở tốc độ
5000 vòng/phút trong 30 phút Lọc dung dịch qua màng lọc cellulose acetat 0,45 μm thu được dịch thử Pha loãng dịch thử với methanol đến nồng độ phù hợp, sau đó đem đo hấp thụ quang ở bước sóng cực đại
Xác định hệ số phân bố dầu nước của rutin và phytosome rutin
- Chuẩn bị pha octanol và nước:
Lấy 200 ml nước và 200 ml octanol trộn vào cốc có mỏ 1000 ml, đem khuấy từ qua đêm Chuyển vào ống đong 500 ml, để yên hỗn hợp qua đêm để tách riêng 2 pha octanol và nước
Cân chính xác khoảng 50 mg rutin hoặc 1 lượng phytosome rutin tương đương vào cốc có mỏ, hòa tan với 40 methanol trong bình định mức 50 ml Định mức lại vừa đủ bằng methanol, lắc đều Hút chính xác 1 ml dung dịch thu được cho vào cốc có mỏ Tiến hành bốc hơi dung môi đến khô thu được cắn Cho 20 ml nước, 20 ml octanol đã chuẩn bị vào, khuấy từ qua đêm ở nhiệt độ phòng Lấy riêng từng phần nước và phần octanol, lọc qua màng cellulose acetat 0,45 μm, pha loãng dung dịch đến nồng độ thích hợp Đo độ hấp thụ quang từng phần ở bước sóng cực đại
Hệ số phân bố dầu nước được tính theo công thức:
Trong đó: Aoct là độ hấp thụ quang của rutin trong octanol (Abs)
A blank oct là độ hấp thụ quang của octanol (Abs)
A blank wat là độ hấp thụ quang của nước (Abs) f 1 là hệ số pha loãng pha octanol f 2 là hệ số pha loãng pha nước
2.3.4 Phương pháp làm giảm kích thước tiểu phân
Phytosome sau bào chế được siêu âm để làm giảm KTTP và mẫu đồng nhất hơn: hòa tan 1 lượng nhỏ phức hợp vào 50 ml nước, siêu âm liên tục 50 ml hỗn dịch phytosome trên trong 10 phút bằng thiết bị siêu âm cầm tay, công suất C = 50 W, tần suất 60 Hz
2.3.5 Phương pháp đánh giá một số đặc tính của phytosome
Hình thức Đánh giá hình thức bằng cảm quan: màu sắc, độ dính, độ dẻo
KTTP, phân bố KTTP, thế zeta
Sử dụng hỗn dịch phytosome rutin sau khi đã siêu âm làm nhỏ kích thước tiến hành đo KTTP, chỉ số đa phân tán PDI và thế zeta bằng thiết bị phân tích kích thước, thế zeta Horiba SZ100
Độ tan phytosome trong các môi trường, hệ số phân bố phytosome
Tương tự như phương pháp mô tả ở mục 2.3.3 đã trình bày ở trên
Xác định hiệu suất phytosome hóa
Cách tiến hành Định lượng rutin toàn phần (rutin dạng tự do và rutin trong phức hợp phytosome): Hút chính xác 1 ml hỗn dịch phytosome, đưa vào bình định mức 25 ml, bổ sung methanol đến vạch, tiếp tục pha loãng và định lượng bằng phương pháp đo quang với các điều kiện được mô tả ở mục 2.3.1 thu được độ hấp thụ quang A1 (Abs) Định lượng rutin phytosome: Để xác định hiệu suất phytosome hóa, cần loại phần rutin tự do Trong nước, rutin tự do không tan và kích thước tiểu phân tương đối lớn, khi ly tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút sẽ lắng, bám vào thành ống Lấy
Từ phương trình đường chuẩn dựng được ở mục 2.3.1, xác định nồng độ rutin tương ứng với độ hấp thụ quang A 1 , A 2 lần lượt là C 1 , C 2 (mg/L)
Hiệu suất phytosome hóa được xác định bằng công thức: H % = × 100
2.3.6 Phương pháp đánh giá khả năng tạo phức giữa dược chất và phospholipid
Phương pháp đo nhiệt quét vi sai DSC
Sử dụng đĩa nhụm chứa mẫu 40 àl, đục thủng nắp, khối lượng mẫu khoảng từ 3 – 7 mg Nhiệt độ quét từ 50 – 300 0 C, tốc độ gia nhiệt 10 0 C/phút Trong quá trình thử, thổi khí nitrogen với lưu lượng 50 ml/phút
Phương pháp đo quang phổ hồng ngoại IR
Lấy khoảng 5 - 10 mg mẫu đã làm khô, trộn đều và nghiền mịn với KBr, khi được hỗn hợp đồng nhất đem dập thành viên mỏng Tiến hành quét phổ với viên nén thu được
Phương pháp đo nhiễu xạ tia X
Mẫu được giữ trong bộ giữ mẫu và đưa vào thiết bị Quét mẫu từ góc 5º - 50º với tốc độ quay góc θ = 1 º/phút, nhiệt độ 25 o C
2.3.7 Phương pháp đánh giá hiệu suất phun sấy phytosome rutin
Hiệu suất phun sấy được tính theo công thức × 100 % Trong đó: là khối lượng phytosome rutin thu được (g) là khối lượng phytosome rutin theo lý thuyết có trong dịch phun sấy (g)
Phương pháp xử lý số liệu
Các kết quả được xử lý thống kê với sự hỗ trợ của phần mềm Microsoft Excel 2013
Kết quả được trình bày dưới dạng: X ± SD
THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Định lượng rutin bằng phương pháp đo quang
Xác định điểm hấp thụ cực đại
Tiến hành pha dung dịch rutin chuẩn có nồng độ 25 mg/L, đem quét độ hấp thụ quang ở bước sóng từ 800 nm đến 200 nm Kết quả thu được biểu diễn như Hình 3.1
Hình 3.1 Quét độ hấp thụ quang của dung dịch rutin chuẩn ở bước sóng từ
800 nm đến 200 nm Nhận xét: Nhìn vào quang phổ của rutin, bước sóng cực đại λ max = 257 nm được sử dụng để định lượng rutin
Tiến hành pha các mẫu thử có nồng độ lần lượt là 5; 10; 12,5; 15; 20 mg/L, đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 257 nm Kết quả thể hiện trong Bảng 3.1 và Hình 3.2
Bảng 3.1 Độ hấp thụ quang của rutin theo nồng độ tại bước sóng 257 nm Nồng độ (mg/L) 5,03 10,06 12,58 15,10 20,13 Độ hấp thụ quang (Abs) 0,196 0,392 0,494 0,587 0,760
Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn độ hấp thụ quang của rutin theo nồng độ tại bước sóng 257 nm
Nhận xét: R 2 = 0,9987 (> 0,995) cho thấy có sự tuyến tính giữa độ hấp thụ quang và nồng độ dung dịch rutin trong khoảng nồng độ 5 mg/L đến 20 mg/L
Phương trình biểu diễn sư tương quan độ hấp thụ quang với nồng độ là: y = 0,0377x + 0,0141
Trong đó y là độ hấp thụ quang (đơn vị Abs), x là nồng độ rutin (đơn vị mg/L).
Khảo sát hệ số phân bố dầu nước và độ tan trong các môi trường của rutin
Tiến hành xác định độ tan của rutin trong các môi trường và hệ số phân bố dầu nước của rutin theo phương pháp đã được mô tả ở mục 2.3.3 Kết quả thu được như trong Bảng 3.2 y = 0.0377x + 0.0141 R² = 0.9987
0 5 10 15 20 25 Độ hấ p t hụ qu ang ( Abs )
Bảng 3.2 Một số đặc tính của rutin (n=3)
Mẫu Độ tan ở pH 1,2 (mg/L) Độ tan ở pH 4,5 (mg/L) Độ tan ở pH 6,8 (mg/L) Độ tan trong nước (mg/L)
Hệ số phân bố dầu nước (K D ) Rutin 66,28±3,45 76,55±2,5 147,05±8,14 84,21±3,19 7,54±0,19
- Rutin nguyên liệu có độ tan thấp
- Rutin tan tốt nhất trong môi trường pH 6,8, tan kém nhất trong môi trường pH 1,2 (độ tan bão hòa của rutin ở môi trường pH 6,8 cao hơn gấp hai lần so với môi trường pH 1,2)
- Hệ số phân bố dầu nước của rutin là 7,54 (> 4) điều này khiến thuốc khó hấp thu qua da [22].
Bào chế phytosome Rutin
Tiến hành bào chế phytosome rutin theo phương pháp ở mục 2.3.2, các thông số kĩ thuật được thể hiện trong Bảng 3.3
Kết quả thu được ở Bảng 3.4
Bảng 3.3 Các thông số kĩ thuật bào chế phytosome rutin bằng phương pháp bốc hơi dung môi, sử dụng các dung môi khác nhau
Thông số kĩ thuật Phương pháp 1 (M1) Phương pháp 2 (M2)
Tỉ lệ mol rutin:PC 1:1 (0,3 g Rutin)
Dung môi hòa tan Ethanol tuyệt đối
Methanol (hòa tan rutin, V0 ml), dichlomethan (hòa tan PC,
Thời gian tạo phức 3 giờ
Nhiệt độ phản ứng Nhiệt độ phòng
Bảng 3.4 Một số đặc tính của phytosome bào chế theo hai phương pháp và hiệu suất phytosome hóa (n=3)
Mẫu KTTP (nm) PDI Thế zeta (mV) Hiệu suất phytosome hóa (%)
So với phytosome rutin được bào chế theo phương pháp bốc hơi sử dụng dung môi n-hexan (M2), khi dùng dung môi ethanol, phytosome rutin có kích thước lớn hơn nhưng không nhiều (310,3 so với 255,4 nm), giá trị tuyệt đối thế zeta nhỏ hơn không đáng kể (-87,5 mV), phân bố KTTP nhỏ hơn (0,303 so với 0,370) Tuy nhiên hiệu suất phytosome hóa cao hơn (92,99 so với 77,22 %)
Tuy nhiên, khi sử dụng các dung môi độc hại: methanol, diclomethan, n- hexan Đây là các dung môi hữu cơ gây ô nhiễm môi trường, các chất độc thần kinh khó có thể loại bỏ hoàn toàn trong quá trình bào chế
Do vậy, dung môi ethanol được lựa chọn để bào chế phytosome
3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng
Phytosome rutin được bào chế theo quy trình như mô tả trong mục 2.3.2 với các thông số:
- Tỉ lệ mol rutin:PC là 1:1 (khối lượng rutin 0,3 g)
- Thời gian phản ứng: 3 giờ
- Nhiệt độ phản ứng lần lượt là: nhiệt độ phòng (25 °C), 40 °C, 50 °C
Phức hợp tạo thành được đánh giá KTTP, phân bố KTTP, thế zeta và hiệu suất phytosome hóa Kết quả được mô tả trong Bảng 3.5 và Hình 3.3
Bảng 3.5 KTTP, PDI, thế zeta của hỗn dịch phytosome rutin theo nhiệt độ phản ứng (n=3)
Hình 3.3 KTTP và PDI của hỗn dịch phytosome rutin theo nhiệt độ phản ứng
- KTTP: KTTP nhỏ nhất khi phản ứng xảy ra ở nhiệt độ phòng (310,3 nm)
Khi nhiệt độ phản ứng tăng, KTTP cũng tăng (KTTP ở 40 0 C là 353,8 và lên tới 409,4 khi ở 50 0 C) Nguyên nhân là do khi tăng nhiệt độ, liên kết hydro giữa PC và rutin kém bền vững hơn nên tăng KTTP
- PDI: Phân bố KTTP của mẫu 1; 3 và 4 lần lượt có PDI = 0,303; 0,313;
0,330 đều lớn hơn 0,3 chứng tỏ KTTP có khoảng phân bố rộng, M1 có khoảng phân bố nhỏ nhất
- Thế zeta: Giá trị tuyệt đối thế zeta của các mẫu đều rất cao, cho thấy hỗn
Nhiệt độ phòng 40ᵒC 50ᵒC
- Hiệu suất phytosome hóa: Các mẫu đều có hiệu suất phytosome hóa cao (>
90 %), khác biệt không nhiều (hiệu suất phytosome hóa M1, M3, M4 lần lượt là 92,99; 92,00; 93,12 %)
Bào chế phytomsome rutin với nhiệt độ 25 °C sẽ thu được phức hợp có KTTP nhỏ nhất (310,3 nm), PDI nhỏ nhất (0,303) và giá trị tuyết đối của thế zeta cao nhất (-87,5 mV) Vì thế nhiệt độ 25 °C được chọn cho những nghiên cứu tiếp theo
3.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng
Bào chế phytosome rutin theo quy trình ghi ở mục 2.3.2 với các thông số như sau:
- Tỷ lệ mol rutin : phospholipid là 1:1
- Nhiệt độ phản ứng: Nhiệt độ phòng (25 °C)
- Thời gian phản ứng lần lượt là 3 giờ, 12 giờ và 16 giờ
Phức hợp phytosome được đánh giá KTTP, phân bố KTTP, thế zeta, hiệu suất phytosome hóa như mục 2.3.5
Kết quả thu được thể hiện ở các Bảng 3.6, Hình 3.4
Bảng 3.6 KTTP, PDI, thế zeta của hỗn dịch phytosome rutin theo thời gian phản ứng (n=3)
Thời gian phản ứng (giờ)
Hình 3.4 KTTP, PDI của hỗn dịch phytosome rutin theo thời gian phản ứng
- KTTP, PDI : Thời gian phản ứng 3 giờ, phytosome rutin được bào chế có kích thước tiểu phân và phân bố kích thước tiểu phân nhỏ nhất (310,3 nm, PDI 0,303) Khi tăng thời gian phản ứng lên 12 giờ và 16 giờ, KTTP tăng không đáng kể, tương ứng là 310,3 nm, 322,5 nm và 318,4 nm
- Thế zeta : Ba mẫu đều có trị tuyệt đối thế zeta cao, cho thấy hỗn dịch có độ ổn định cao Trong đó mẫu phản ứng 12 giờ có trị tuyệt đối thế zeta cao nhất
- Hiệu suất phytosome hóa : M6 có hiệu suất phytosome hóa cao nhất
(95,32%) Các mẫu phản ứng 3 gờ, 12 giờ có hiệu suất nhỏ hơn tương ứng là 92,99
% và 95,00% Do trong 3 giờ rutin và PC chưa phản ứng hoàn toàn, khi tăng thời gian phản ứng lên 12 giờ và 16 giờ, phản ứng hoàn toàn nên hiệu suất phytosome tăng lên Hiệu suất phytosome hóa của M6 so với M5 tăng không đáng kể Nguyên nhân do phản ứng đã xảy ra hoàn toàn ở 12 giờ
Như vậy, KTTP chênh lệch không nhiều giữa các mẫu có thời gian phản ứng khác nhau, để tiết kiệm thời gian bào chế, hiệu suất phytosome hóa cao, thời gian phản ứng là 12 giờ được lựa chọn
3.3.4 Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ mol các chất tham gia phản ứng
Tiến hành bào chế phytosome rutin theo quy trình mô tả ở mục 2.3.2, với các thông số kĩ thuật cố định:
- Thời gian hình thành liên kết 12 giờ
- Nhiệt độ khuấy từ: nhiệt độ phòng (25 °C)
- Tỉ lệ mol rutin và PC lần lượt: 1:1, 1:2, 2:1
- Sản phẩm thu được được đánh giá KTTP, chỉ số đa phân tán PDI, thế zeta, hiệu suất phytosome hóa như mục 2.3.5 Kết quả được mô tả trong Bảng 3.7 và Hình 3.5
Bảng 3.7 KTTP, PDI, thế zeta của hỗn dịch phytosome rutin theo tỉ lệ mol
Mẫu Tỷ lệ mol rutin:PC
Hình 3.5 KTTP và PDI của hỗn dịch phytosome rutin theo tỉ lệ mol Ru:PC
- KTTP, PDI : Phytosome rutin được bào chế với tỉ lệ 1:1 cho KTTP nhỏ nhất
(312,5 nm), các mẫu M12 và M21 có KTTP lớn hơn tương ứng 537,4 nm; 406,6 nm Điều này có thể giải thích khi tỉ lệ mol rutin : PC là 2:1, vẫn còn một lượng rutin ở trạng thái tự do, chưa tham gia liên kết Khi tỉ lệ mol rutin : PC là 1:2, lượng
Tỉ lệ mol Ru:PC
PC không tham gia liên kết hình thành một lớp gel quanh tiểu phân phức hợp phytosome rutin làm tăng KTTP
- Thế zeta : Cả ba mẫu đều có trị tuyệt đối thế zeta khá cao (> 70 mV)
- Hiệu suất phytosome hóa : M1 có hiệu suất phytosome hóa cao (95,00 %), khi tăng tỉ lệ PC, hiệu suất tăng do càng có nhiều phospholipid thì cung cấp càng nhiều vị trí liên kết, phức hợp dễ tạo thành hơn và lượng rutin tham gia liên kết được nhiều hơn Cũng do vậy, mẫu M21 với tỉ lệ 2:1 có hiệu suất rất thấp Để tối ưu về KTTP và hiệu suất phytomes hóa, tỷ lệ mol rutin : PC 1:1 được lựa chọn cho những khảo sát sau
3.3.5 Khảo sát ảnh hưởng của cholesterol đến độ ổn định của phytosome rutin
Qua tham khảo một số tài liệu về các nghiên cứu phytosome, cholesterol được thêm vào công thức bào chế nhằm tăng ổn định lớp màng lipid kép, tăng độ đặc khít của phospholipid do đó có vai trò ổn định KTTP của phytosome tốt hơn, giảm sự kết tụ, sa lắng các tiểu phân hỗn dịch Nghiên cứu tiến hành khảo sát ảnh hưởng của cholesterol ở các tỉ lệ mol khác nhau đến hiệu suất phytosome hóa và đặc tính của hỗn dịch phytosome rutin bằng cách hòa tan CH vào ethanol và tiến hành bào chế như mục 2.3.2 với các thông số kĩ thuật cố định:
- Thời gian hình thành liên kết 12 giờ
- Nhiệt độ khuấy từ: nhiệt độ phòng (25 °C)
- Tỉ lệ mol rutin:PC:CH được thay đổi Sản phẩm thu được được đánh giá KTTP, độ phân bố KTTP, PDI, thế zeta, hiệu suất phytosome hóa như mục 2.3.5
Kết quả được mô tả trong Bảng 3.8 và Hình 3.6
Bảng 3.8 KTTP, PDI, thế zeta của hỗn dịch phytosome rutin theo tỉ lệ mol rutin:PC:CH (n = 3) Mẫu
Tỷ lệ mol rutin:PC:
Hình 3.6 KTTP và PDI của hỗn dịch phytosome rutin theo tỉ lệ mol
- Khi thay đổi tỷ lệ mol rutin:PC:CH thì các đặc tính của hỗn dịch phytosome cũng thay đổi
- Mẫu M8 với tỉ lệ mol 1:1:0,2 có KTTP và PDI nhỏ nhất (299,45 nm; 0,309) đồng thời trị tuyệt đối thế zeta lớn nhất (-109,7)
3.3.6 Lựa chọn phương pháp loại dung môi
Phytosome rutin được bào chế theo hai dung môi được mô tả trong mục 2.3.2 và phun sấy với các thông số quá trình phản ứng:
- Tỉ lệ mol Rutin: PC: CH là 1:1:0,2
- Dung môi hòa tan: ethanol
- Thời gian phản ứng: 12 giờ
- Nhiệt độ phản ứng: nhiệt độ phòng (25 °C) Các thông số của quá trình phun sấy:
- Tốc độ phun: 1400 ml/ giờ Sản phẩm được so sánh về kích thước tiểu phân, phân bố kích thước tểu phân, thế
Tỉ lệ mol Rutin:PC:CH
Bảng 3.9 KTTP, PDI, thế zeta của phytosome rutin bào chế theo hai phương pháp bốc hơi dung môi và phun sấy (n=3)
Hình 3.7 KTTP, PDI của phytosome rutin được bào chế theo hai phương pháp khác nhau
Phun sấy cho phức hợp có KTTP nhỏ hơn (263,7 so với 299,4); chỉ số đa phân tán PDI nhỏ hơn (0,325 so với 0,350), hiệu suất phytosome hóa cao hơn (95,43 % so với 90,61 %) Tuy nhiên trị tuyệt đối thế zeta nhỏ hơn (68,9 so với 109,7) Nguyên nhân có thể do KTTP phytosome được bào chế theo phương pháp phun sấy (trước khi siêu âm) nhỏ hơn phương pháp bốc hơi dung môi dưới áp suất chân không vì đầu vào sấy phun tạo ra các hạt phun sấy rất nhỏ làm cho KTTP phytosome bé
Bốc hơi dung môi Phun sấy (M11)
Phương pháp loại dung môi
3.3.7 Khảo sát điều kiện phun sấy
Khảo sát nhiệt độ đầu vào
Phytosome rutin được bào chế theo phương pháp phun sấy đã được mô tả trong mục 2.3.2 với các thông số:
- Tốc độ phun dịch: 1600 ml/giờ
- Nhiệt độ đầu vào lần lượt : 85 °C, 90 °C, 100 °C, 110 °C
Hiệu suất phun sấy phytosome rutin thu được thể hiện trong Bảng 3.10
Bảng 3.10 Hiệu suất phun sấy phytosome rutin thu đƣợc khi phun sấy với nhiệt độ khác nhau
- Ở 90 °C hiệu suất phun sấy phytosome rutin thu được là lớn nhất (54,5 %)
Do vậy nhiệt độ đầu vào 90 °C được lựa chọn
Khảo sát tốc độ phun sấy
Phytosome rutin được bào chế theo phương pháp phun sấy đã được mô tả trong mục 2.3.2 với các thông số:
- Tốc độ phun lần lượt: 1200, 1400, 1600, 1800 ml/ giờ Hiệu suất phun sấy phytosome rutin thu được thể hiện trong Bảng 3.11
Bảng 3.11 Hiệu suất phun sấy phytosome rutin thu đƣợc khi phun sấy với tốc độ khác nhau
Tốc độ phun (ml/giờ) 1200 1400 1600 1800
Nhận xét: Với tốc độ 1600 ml/giờ, hiệu suất phun sấy phytosome rutin thu được lớn nhất
Từ kết quả khảo sát các thông số quy trình, chúng tôi có sơ đồ bào chế phytosome rutin thể hiện ở Hình 3.8 như sau:
Đánh giá một số đặc tính phytosome bào chế được 40 3.6 Đánh giá khả năng tạo phức hợp giữa rutin và phospholipid trong phytosome
Tiến hành bào chế 3 mẻ phytosome rutin như quy trình bào chế mô tả trong hình 3.8 với quy mô 10 g/một mẻ Phytosome rutin được đánh giá một số đặc tính hình thức cảm quan, độ tan trong các môi trường, KTTP, chỉ số đa phân tán PDI, thế zeta, hiệu suất phytosome hóa, kết quả thể hiện như trong Bảng 3.12, 3.13 và Hình 3.9
Hòa tan trong ethanol ethanol
Phối hợp tạo phức giữa rutin-phospholipid
Phun sấy loại dung môi thu phytosome rutin thô
- - Áp lực súng phun: 3,5 atm
- - Tốc độ phun: 1600 ml/giờ
Bảo quản trong bình hút ẩm ở nhiệt độ phòng
Bảng 3.12 Một số đặc tính của phytosome rutin bào chế bằng phương pháp phun sấy (n=3)
Chỉ tiêu Hình thức KTTP
Bột tơi mịn, màu vàng 266,4 ± 7,1 0,292 ± 0,080 -82,7 ± 2,7 95,61 ± 0,24
Bảng 3.13 So sánh độ tan bão hòa của Rutin và Phytosome rutin trong các môi trường pH khác nhau
Mẫu Độ tan ở pH 1,2 (mg/L) Độ tan ở pH 4,5 (mg/L) Độ tan ở pH 6,8 (mg/L) Độ tan trong nước (mg/L)
Hệ số phân bố dầu nước (K D )
Hình 3.9 So sánh độ tan bão hòa của Rutin và Phytosome rutin trong các môi
0 50 100 150 200 250 Độ tan ở pH 1,2 (mg/L) Độ tan ở pH 4,5 (mg/L) Độ tan ở pH 6,8 (mg/L) Độ tan trong nước (mg/L) Độ t an b ão h ò a (m g/ m l)
Phytosome rutin có KTTP nhỏ (266,4 nm), PDI hẹp (0,292), giá trị tuyệt đối thế zeta (82,7 mV) và hiệu suất phytosome hóa cao (95,61 %), độ tan trong các môi trường đã được cải thiện so với rutin Độ tan:
- Phytosome rutin có độ tan tốt nhất trong nước (215,09 mg/ml) cao hơn độ tan trong pH 1,2 là 129,77 mg/ml (2,52 lần), cao hơn độ tan trong pH 4,5 là 114,75 mg/ml (2,14 lần); cao hơn trong pH 6,8 là 29,43 mg/ml (1,15 lần)
- So với rutin, độ tan của phytosome rutin được cải thiện đáng kể trong các pH khác nhau Độ tan trong nước của phytosome rutin tăng nhiều nhất, gấp 2,55 lần so với rutin nguyên liệu Trong các môi trường pH 1,2; 4,5 và 6,8 độ tan của phytosome rutin tăng lần lượt gấp 1,28 lần; 1,31 lần và 1,26 lần
Hệ số phân bố dầu nước: Để có khả năng thấm qua da tốt, hệ số phân bố dầu nước nên thuộc khoảng từ -1 đến 4 có khả năng thấm qua da tốt So với rutin, hệ số phân bố dầu nước của phytosome giảm 2 lần, còn 3,76 nên có khả năng thấm qua da tốt hơn
3.6 Đánh giá khả năng tạo phức hợp giữa rutin và phospholipid trong phytosome bằng phương pháp vật lý Để đánh giá khả năng tương tác giữa rutin và phospholipid, ta sử dụng phổ hồng ngoại (IR), phân tích nhiệt vi sai (DSC) và phân tích nhiễu xạ tia X (FTIR)
Phổ hồng ngoại của phức hợp phytosome rutin cho thấy các pic hấp thụ của nhóm hydroxyl (O-H) của rutin dịch chuyển sang bước sóng thấp hơn: từ 3412,08 cm -1 sang 3363,86 cm -1 , pic hấp thụ của nhóm (RO) 2 PO 2 - của PC tại 1238,30 cm -1 và 1085,92 cm -1 dịch chuyển sang bước sóng 1199,72 cm -1 và 1055,06 cm Như vậy phổ IR đã cho thấy sự tạo thành phức hợp giữa –OH của rutin và nhóm PO 4 - của phospholipid
Hình 3.10 Phổ IR của Rutin, PC, CH và phytosome
Phân tích nhiễu xạ tia X
Hình 3.11 Hình ảnh phổ nhiễu xạ tia X của Rutin, PC, CH và phytosome phytosome rutin không còn pic nhiễu xạ Điều đó chứng tỏ đã có sự tương tác giữa rutin và phosphatidylcholin làm rutin chuyển từ trạng thái kết tinh sang trạng thái vô định hình
Phân tích nhiệt quét vi sai (DSC)
Hình 3.12 Phổ DSC của Rutin, PC, CH và phytosome
Giản đồ nhiệt của phức hợp phytosome rutin không còn thấy xuất hiện pic thu nhiệt của PC và rutin Thay vào đó là sự xuất hiện của một pic thu nhiệt mới ở nhiệt độ 183,6188 °C thấp hơn của rutin nguyên liệu (188,9488 o C) Điều đó chứng tỏ sự tạo thành phức hợp giữa rutin và phospholipid
Kết quả phân tích các phổ đã chứng minh có sự hình thành phức hợp phytosome, giữa đầu phân cực của phospholipid và các nhóm chức phân cực của dược chất bằng liên kết hydro.