Nghiên cứu bào chế phytosome quercetin ứng dụng vào viên nang cứng TT

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI Nguyễn Hồng Trang NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ PHYTOSOME QUERCETIN ỨNG DỤNG VÀO VIÊN NANG CỨNG Chuyên ngành: Công nghệ dược phẩm bào chế thuốc Mã số : 62720402 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƢỢC HỌC Hà Nội, năm 2020 Cơng trình hồn thành tại: Trường Đại học Dược Hà Nội Trường Đại học Y Dược Huế Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Vũ Thị Thu Giang GS.TS Phạm Thị Minh Huệ Phản biện 1:……………………………………………… ……………………………………………… Phản biện 2:……………………………………………… ……………………………………………… Phản biện 3:……………………………………………… ……………………………………………… Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Trường họp tại: ……………………………………… Vào hồi……… …… ngày …… tháng …… năm…… Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện Quốc gia Việt Nam Thư viện Trường Đại học Dược Hà Nội DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI LUẬN ÁN Nguyễn Hồng Trang, Vũ Thị Thu Hà, Vũ Thị Thu Giang, Phạm Thị Minh Huệ (2016), “Nghiên cứu bào chế phytosome quercetin phương pháp kết tủa dung mơi”, Tạp chí Dược học, 448, tr 13-17 Nguyễn Hồng Trang, Trịnh Viết Đạt, Vũ Thị Thu Giang, Phạm Thị Minh Huệ (2018), “Nghiên cứu quy trình bào chế đánh giá phytosome quercetin”, Tạp chí Nghiên cứu dược & Thông tin thuốc, 9, 6, tr 19-26 A-GIỚI THIỆU LUẬN ÁN Tính cấp thiết luận án Quercetin flavonoid tự nhiên chứng minh có nhiều tác dụng sinh học khác chống viêm, chống oxy hóa Tuy nhiên, đặc tính bất lợi khơng tan nước, bị chuyển hóa, thải trừ nhanh dùng đường uống, hạn chế khả ứng dụng quercetin lâm sàng Trong năm gần đây, bào chế hoạt chất dạng tạo phức hợp với phospholipid (phytosome) xem hướng nghiên cứu bào chế đại, có hiệu việc nâng cao sinh khả dụng đường uống quercetin Trong phytosome, hoạt chất liên kết với phospholipid (PL) thông thường phosphatidyl cholin (PC) tạo thành cấu trúc tiểu phân hình cầu có tính chất lưỡng tính, qua vừa cải thiện độ tan hoạt chất dịch ruột vừa tăng vận chuyển hoạt chất qua lớp màng lipid kép Mặt khác, phytosome hấp thu theo chế chủ động nhờ tế bào M ruột non vào tuần hồn chung qua hệ lympho, qua giảm chuyển hóa bước qua gan tăng sinh khả dụng quercetin [78] Hoạt chất sau bào chế dạng phytosome dễ dàng ứng dụng vào dạng viên với quy trình bào chế đơn giản, khơng địi hỏi cơng nghệ cao thiết bị đặc biệt Tại Việt Nam, chế phẩm chứa hoạt chất bào chế dạng phytosome bắt đầu đưa vào nghiên cứu sản xuất, phytosome chủ yếu nhập từ nước với giá thành cao Do đó, việc tiến hành nghiên cứu bào chế phytosome cần thiết, góp phần phát triển cơng nghệ phytosome bào chế thuốc Xuất phát từ thực tiễn trên, đề tài “Nghiên cứu bào chế phytosome quercetin ứng dụng vào viên nang cứng” thực Mục tiêu luận án Xây dựng công thức quy trình bào chế phytosome quercetin Bước đầu đánh giá tác dụng chống oxy hoá in vitro tác dụng bảo vệ gan in vivo phytosome quercetin Xây dựng cơng thức quy trình bào chế viên nang cứng chứa phytosome quercetin Những đóng góp luận án - Lần Việt Nam, phytosome quercetin nghiên cứu hoàn thiện từ xây dựng cơng thức, quy trình bào chế đến xây dựng tiêu chuẩn chất lượng nghiên cứu độ ổn định Phytosome quercetin bào chế có tỷ lệ hoạt chất phytosome hóa 90 %, tiểu phân thu có kích thước từ 450 - 500 nm, phân bố kích thước đồng với giá trị PDI < 0,4, ổn định 06 tháng theo dõi điều kiện thực lão hóa cấp tốc - Ứng dụng thành công phytosome quercetin bào chế vào dạng thuốc nang cứng với hàm lượng hoạt chất 50 mg Viên bào chế có độ hồ tan > 96 % sau 45 phút ổn định thời gian nghiên cứu (06 tháng điều kiện lão hóa cấp tốc 12 tháng điều kiện thực) - Đã chứng minh tác dụng bảo vệ gan phytosome quercetin viên nang chứa phytosome quercetin mơ hình chuột bị gây độc carbon tetraclorid so với quercetin tự Bố cục luận án Luận án gồm chương, 66 bảng, 35 hình, 152 tài liệu tham khảo với 16 tài liệu tiếng Việt 136 tài liệu tiếng Anh, phụ lục Luận án có 150 trang gồm phần chính: Đặt vấn đề (2 trang); Chương Tổng quan (28 trang); Chương Đối tượng, nội dung phương pháp nghiên cứu (24 trang); Chương Kết nghiên cứu (67 trang); Chương Bàn luận (28 trang); Kết luận kiến nghị (1 trang) B-NỘI DUNG LUẬN ÁN CHƢƠNG TỔNG QUAN Đã trình bày tập hợp có hệ thống nội dung liên quan đến luận án, bao gồm: - Về hoạt chất: Nguồn gốc, cơng thức hóa học, tính chất lý hóa độ ổn định quercetin; tác dụng dược lý, dược động học, định, liều dùng, tương tác thuốc Những nội dung trình bày giúp lý giải nguyên nhân dẫn đến sinh khả dụng đường uống quercetin thấp Đã tổng hợp cơng trình nghiên cứu giới đề cập đến hệ mang thuốc có khả cải thiện sinh khả dụng đường uống quercetin - Phytosome: Khái niệm thành phần cấu tạo phytosome; phân biệt phytosome với liposome; ưu nhược điểm; kỹ thuật bào chế phương pháp đánh giá số đặc tính lý hóa phytosome; ứng dụng phytosome lĩnh vực dược phẩm Từ đó, có định hướng cho nghiên cứu luận án - Một số mơ hình đánh giá tác dụng bảo vệ gan in-vivo: Tổng quan mơ hình nghiên cứu nước giới đánh giá tác dụng bảo vệ gan in-vivo, cách bố trí thí nghiệm thơng số đánh giá CHƢƠNG NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu thiết bị nghiên cứu 2.1.1 Nguyên liệu - Chất chuẩn: Viện Kiểm nghiệm thuốc Tp Hồ Chí Minh - Nguyên liệu: Quercetin dihydrat đạt tiêu chuẩn nhà sản xuất Phosphatydin cholin đậu nành hydrogen hóa (HSPC) cholesterol hãng Lipoid - Đức Nguyên liệu, hóa chất khác đạt tiêu chuẩn dược điển tiêu chuẩn nhà sản xuất (tùy theo mục đích sử dụng) 2.1.2 Thiết bị nghiên cứu Hệ thống cất quay Rovapor R - 210 (Buchi) Hệ thống máy sắc ký lỏng hiệu cao HPLC Aligent 1260 Hệ thống thiết bị Zetasizer NanoZS90 (Malvern) Kính hiển vi điện tử quét FESEM Hitachi S-4800 Máy phân tích nhiệt vi sai Mettler Toledo AB 204S Máy thử độ hòa tan Erweka DT700 Các trang thiết bị, dụng cụ khác phịng thí nghiệm trường Đại học Dược Hà Nội trường Đại học Y Dược Huế 2.1.3 Động vật thí nghiệm Chuột chủng dòng BALB/c khoảng - tuần tuổi có khối lượng khoảng 20 - 35 g, khoẻ mạnh, khơng phân biệt giống, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm Viện Công nghệ sinh học cung cấp 2.1.4 Địa điểm thực nghiên cứu Bộ môn Bào chế - Trường Đại học Dược Hà Nội; trường Đại học Y Dược Huế; viện Hóa học; viện vệ sinh dịch tễ TW viện Công nghệ sinh học 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp bào chế phytosome quercetin 2.2.1.1 Bào chế phytosome theo phương pháp bốc dung môi Cân 3,56 g quercetin, PL với tỷ lệ hoạt chất : PL (mol:mol) từ 1:0,5 đến 1:1,5, tá dược khác (nếu cần), hòa tan 20 ml ethanol tuyệt đối Đưa vào bình cầu dung tích 1000 ml hệ thống cất quay Cất quay với tốc độ (50, 100 150 vòng/phút) nhiệt độ từ 60 đến 80oC Kết thúc thời gian phản ứng (khảo sát), hút chân không, điều chỉnh áp suất giảm để dung môi bay từ từ Sau 15 phút hút chân không, dung môi bay hết màng phim hình thành giảm tốc độ quay xuống 100 vịng/phút Tiếp tục cất quay 16 để đảm bảo loại hết hồn tồn dung mơi hữu Phytosome sau tạo thành hydrat hóa trực tiếp bình cất quay tạo hỗn dịch phytosome thô Điều kiện hydrat hóa: 40 ml nước cất, nhiệt độ 60oC, tốc độ quay 100 vịng/phút, thời gian Hỗn dịch thơ làm giảm kích thước phương pháp siêu âm liên tục thời gian phút với tần số 50 Hz, công suất 60 W, nhiệt độ 50 - 60oC Để thu phytosome quercetin dạng bột có hàm ẩm không %, tiến hành sấy tủ sấy chân không nhiệt độ 40oC thời gian 24 2.2.1.2 Bào chế phytosome theo phương pháp kết tủa dung môi Cân 3,56 g quercetin, PL với tỷ lệ hoạt chất : PL (mol:mol) từ 1:0,5 đến 1:1,5, tá dược khác (nếu cần), hòa tan 20 ml ethanol tuyệt đối Tiến hành khuấy từ điều kiện nhiệt độ từ 60 đến 80oC với tốc độ 400 vòng/phút Kết thúc thời gian phản ứng (khảo sát), nhỏ từ từ n-hexan vào hỗn hợp phản ứng kết hợp khuấy trộn nhiệt độ phịng Do thay đổi dung mơi, phytosome kết tủa lại tạo hỗn dịch phytosome thô Nhằm đảm bảo loại hết dung môi hữu cơ, tiến hành ly tâm tốc độ 6000 vịng/phút phút, sau sấy tủ sấy chân không nhiệt độ 45oC, áp suất 0,07 mmHg Bột phytosome quercetin lấy ra, thêm nước cất để nghiền ướt bổ sung thêm nước vừa đủ 40 ml Khuấy từ với tốc độ 400 vòng/phút nhiệt độ 60oC để phân tán lại phytosome vào nước Hỗn dịch thơ làm giảm kích thước phương pháp siêu âm liên tục thời gian phút với tần số 50 Hz, công suất 60 W, nhiệt độ 50 - 60oC Để thu phytosome quercetin dạng bột có hàm ẩm khơng q %, tiến hành sấy tủ sấy chân không nhiệt độ 40oC thời gian 24 2.2.2 Phương pháp bào chế viên nang cứng chứa phytosome quercetin Viên nang chứa phytosome quercetin bào chế theo phương pháp phân liều theo thể tích với hàm lượng quercetin 50 mg Tá dược trơn Aerosil talc Ethanol tuyệt đối dung môi xát hạt 2.2.3 Phương pháp đánh giá số đặc tính lý hóa quercetin phytosome quercetin 2.2.3.1 Thẩm định phương pháp định lượng quercetin sắc ký lỏng hiệu cao HPLC quang phổ hấp thụ UV - Vis a Thẩm định phương pháp định lượng quercetin HPLC Tham khảo USP 41 tài liệu nghiên cứu, điều kiện sắc ký sau: Cột Apollo C18 (4,6 × 250 mm, àm), bo v ct Apollo C18 (4,6 ì 12,5 mm, µm); pha động hỗn hợp acid phosphoric 0,2 % nước methanol với tỷ lệ 40:60 thể tích (v/v); tốc độ dịng ml/phút; thể tích tiêm mẫu 20 µl; detector UV, λ = 370 nm Thẩm định phương pháp định lượng dựa số tiêu: Độ đặc hiệu; tính thích hợp hệ thống sắc ký; tính tuyến tính; độ xác độ b Thẩm định phương pháp định lượng quercetin UV-Vis Quét phổ UV - VIS, lựa chọn cực đại hấp thụ đánh giá ảnh hưởng HSPC tới khả hấp thụ quang học quercetin Thẩm định phương pháp định lượng dựa số tiêu: Tính thích hợp hệ thống; tính tuyến tính; độ xác độ 2.2.3.2 Phương pháp đánh giá quercetin a Định lượng: Hàm lượng quercetin nguyên liệu xác định HPLC, với điều kiện chạy sắc ký lựa chọn mục 2.2.3.1.a b Độ tan quercetin môi trường khác xác định theo phương pháp lắc nhiệt độ 25 ± 0,5oC đến tan bão hòa định lượng quercetin phương pháp HPLC c Hệ số phân bố dầu nước quercetin đánh giá theo phương pháp lắc nhiệt độ 25 ± 0,5oC hai mơi trường n-octanol bão hịa pha nước, nước bão hòa n-octanol (dung dịch nước pH khác nhau) định lượng quercetin phương pháp HPLC 2.2.3.3 Phương pháp đánh giá phytosome quercetin a Hình thái tiểu phân: Sử dụng kính hiển vi điện tử quét SEM b Kích thước tiểu phân (KTTP) phân bố kích thước tiểu phân xác định phương pháp tán xạ ánh sáng động DLS với thiết bị Zetasizer NanoZS90, cuvet nhựa c Thế Zeta: Tiến hành tương tự phương pháp xác định kích thước tiểu phân, sử dụng cuvet nhựa có điện cực đồng d Định lượng quercetin toàn phần phytosome phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao HPLC e Hệ số phân bố dầu nước độ tan phytosome quercetin môi trường: Tiến hành tương tự nguyên liệu quercetin thay bột phytosome quercetin với khối lượng tương ứng f Tỷ lệ hoạt chất phytosome hóa xác định theo phương pháp dùng dung mơi có tính hịa tan chọn lọc, để tách quercetin dạng tự hay quercetin dạng phytosome khỏi hỗn hợp phytosome quercetin g Hiệu suất trình bào chế đánh giá tỷ lệ khối lượng quercetin tương ứng với khối lượng sản phẩm thu khối lượng quercetin ban đầu h Độ hòa tan phytosome quercetin xác định với điều kiện cụ thể sau: Cân lượng xác mẫu thử tương đương 50 mg quercetin, đưa vào cốc thử hòa tan chứa 900 ml dung dịch acid hydrocloric pH 1,2 có 20 % ethanol, trì nhiệt độ mơi trường 37,0 ± 0,5oC Thiết bị thử kiểu cánh khuấy với tốc độ khuấy 100 vòng/phút Tiểu phân chưa tan loại phương pháp siêu ly tâm 8000 vòng/phút thời gian phút, sử dụng ống ly tâm siêu lọc Amicon 10 kDa Phần dịch định lượng quercetin phương pháp HPLC (mục 2.2.3.1.a) i Khả giải phóng qua màng celulose acetat phytosome quercetin: Sử dụng thiết bị đánh giá giải phóng thuốc qua màng hãng Hanson Research (bình khuếch tán Franz) Mơi trường giải phóng dung dịch đệm phosphat pH 6,8 Tốc độ khuấy: 400 vòng/phút Nhiệt độ: 37,0 ± 0,5oC Định lượng quercetin giải phóng phương pháp HPLC j Khả tạo phức quercetin HSPC: Sử dụng bột phytosome quercetin tinh chế, loại quercetin tự Tương tác quercetin HSPC đánh giá thơng qua phân tích IR, 1H-NMR, 13C-NMR, DSC, X-Ray, MS 2.2.4 Phương pháp đánh giá số tiêu chất lượng viên nang cứng chứa phytosome quercetin 2.2.4.1 Phương pháp đánh giá cốm phytosome quercetin a Kích thước hạt: Sử dụng rây có kích thước mắt rây 0,5 0,8 mm b Mất khối lượng làm khô đánh giá phương pháp sấy đến khối lượng không đổi, theo phụ lục 9.6, Dược điển Việt Nam V c Khả trơn chảy cốm đánh giá theo phương pháp gõ đến thể tích khơng đổi d Khối lượng riêng biểu kiến e Hàm lượng quercetin toàn phần cốm chứa phytosome quercetin định lượng phương pháp HPLC 2.2.4.2 Phương pháp đánh giá viên nang cứng chứa phytosome quercetin a Hình thức viên: Nang cứng HPMC số 0, thân màu trắng, nắp màu trắng chứa hạt cốm màu vàng nhạt, đồng đều, trơn chảy tốt, khơng vón cục b Độ đồng khối lượng: Thực theo Dược điển Việt Nam V c Định lượng: Hàm lượng quercetin toàn phần viên nang chứa phytosome quercetin (HLtp) đánh giá phương pháp HPLC d Độ hòa tan viên nang chứa phytosome quercetin tiến hành điều kiện sau: Thiết bị kiểu giỏ quay; tốc độ giỏ quay 75 ± vịng/phút; mơi trường 900 ml dung dịch HCl pH 1,2 có 0,75 % Tween 80; nhiệt độ môi trường 37,0 ± 0,5oC Thời gian thử nghiệm: 45 phút Tiểu phân chưa hòa tan loại phương pháp ly tâm 8000 vòng/phút phút Định lượng phần dịch phương pháp UV-Vis Bảng 3.16 Một số đặc tính hỗn dịch phytosome quercetin bào chế theo phƣơng pháp khác (n = 3) Phƣơng pháp bào chế Bốc dung môi Kết tủa dung môi KTTP (nm) 347,6 ± 3,5 203,5 ± 8,7 PDI 0,303 ± 0,015 0,239 ± 0,024 Hàm lƣợng quercetin (mg/ml) 1,67 ± 0,07 1,65 ± 0,03 Thế Zeta (mV) -22,1 ± 0,3 -33,5 ± 0,6 Nhận thấy, phytosome bào chế theo phương pháp bốc dung mơi có tỷ lệ hoạt chất phytosome hóa độ tan nước cao (97,13 % so với 93,87 % 9,88 µg/ml so với 8,92 µg/ml) Việc sử dụng máy cất quay thuận lợi nâng cấp quy mô bào chế Dung môi ethanol sau trình phản ứng thu hồi để tái sử dụng, giúp giảm chi phí ứng dụng vào thực tế sản xuất Do đó, phương pháp bốc dung môi lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu 3.2.1.2 Xây dựng công thức bào chế phytosome quercetin  Lựa chọn loại phospholipid Bảng 3.19 Đặc tính phytosome quercetin bào chế với loại phospholipid khác (n = 3) Đặc tính HSPC Bột khơ, mịn, màu vàng nhạt 2,27 ± 0,13 96,13 ± 0,26 9,88 ± 0,13 11,6 Tính chất Mất khối lượng làm khơ (%) Tỷ lệ hoạt chất phytosome hóa (%) Độ tan nước (µg/ml) Mức độ làm tăng độ tan hoạt chất (lần) Lecithin Khối bột dính, màu vàng 4,13 ± 0,19 92,48 ± 0,54 9,58 ± 0,17 11,3 Với giá thành rẻ nguồn nguyên liệu sẵn có, lecithin phù hợp bào chế phytosome sử dụng đường uống Tuy nhiên, PL hút ẩm nhanh nên thể chất phytosome bào chế thường đặc quánh, dễ thay đổi bảo quản thời gian dài (sau tháng điều kiện thực, hàm ẩm bột phytosome tăng từ 4,13 % lên 8,04 %) Ngoài ra, phức hợp quercetin với HSPC ổn định vật lý (độ tan nước tỷ lệ hoạt chất phytosome hóa thay đổi không đáng kể sau tháng bảo quản điều kiện thực lão hóa cấp tốc) Do đó, HSPC lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu 11  Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ quercetin:HSPC tới đặc tính phytosome Bảng 3.21 Đặc tính phytosome quercetin bào chế với tỷ lệ quercetin : HSPC (mol:mol) khác (n = 3) Tỷ lệ quercetin : HSPC 1:0,5 1:0,75 1:1,0 1:1,25 1:1,5 KTTP (nm) PDI Thế Zeta (mV) Độ tan nƣớc (µg/ml) 434,0 ± 3,8 376,6 ± 4,1 347,6 ± 3,5 384,5 ± 2,9 498,6 ± 5,6 0,263 ± 0,014 0,319 ± 0,008 0,303 ± 0,015 0,362 ± 0,019 0,330 ± 0,049 -13,2 ± 0,1 -19,7 ± 0,3 -22,1 ± 0,3 -20,3 ± 0,4 -12,4 ± 0,1 4,31 ± 0,22 6,75 ± 0,17 9,88 ± 0,13 9,56 ± 0,32 9,23 ± 0,28 Độ tan tăng so với quercetin (lần) Tỷ lệ hoạt chất phytosome hóa (%) 5,1 7,9 11,6 11,2 10,8 60,31 ± 0,65 76,33 ± 0,93 96,13 ± 0,26 95,79 ± 0,79 92,45 ± 0,83 Nhận thấy, mẫu phytosome thu có KTTP 500 nm, không chênh lệch nhiều mẫu với PDI < 0,4 Phytosome quercetin bào chế theo tỷ lệ quercetin:HSPC 1:1 có KTTP nhỏ, phân bố KTTP tương đối hẹp, độ tan nước tỷ lệ hoạt chất phytosome hóa cao Vì vậy, lựa chọn tỷ lệ cho nghiên cứu  Khảo sát ảnh hưởng cholesterol tới đặc tính phytosome Bảng 3.22 Đặc tính phytosome quercetin bào chế với tỷ lệ quercetin : HSPC: cholesterol khác (n = 3) Mẫu bào chế M1’ M2’ M3’ M4’ Tỷ lệ quercetin : HSPC : cholesterol 1:1:0 1:1:0,1 1:1:0,2 1:1:0,5 KTTP (nm) PDI 347,6 ± 3,5 354,9 ± 4,2 364,0 ± 5,7 503,0 ± 7,2 0,303 ± 0,015 0,311 ± 0,022 0,310 ± 0,031 0,365 ± 0,029 Thế Zeta (mV) -22,1 ± 0,3 -21,3 ± 0,5 -21,2 ± 0,5 -22,3 ± 0,7 EE (%) 96,13 ± 0,26 94,29 ± 0,69 97,01 ± 0,72 71,94 ± 0,45 Nhận thấy, khơng có thay đổi đáng kể cơng thức có cholesterol (M2’, M3’) không sử dụng cholesterol (M1’) Ảnh hưởng cholesterol tới độ ổn định phytosome quercetin thể rõ bảng sau: 12 Bảng 3.23 Độ ổn định hỗn dịch phytosome quercetin bào chế với tỷ lệ quercetin : HSPC : cholesterol khác (n = 3) Sau tuần Mẫu M1’ M2’ M3’ KTTP (nm) 416,3 ± 6,8 364,5 ± 5,2 360,7 ± 5,8 Sau tuần Zeta (mV) -22,1 ± 0,5 -21,7 ± 0,5 -21,5 ± 0,4 PDI 0,302 ± 0,011 0,316 ± 0,010 0,311 ± 0,017 KTTP (nm) PDI Sau tuần Zeta (mV) KTTP (nm) PDI Zeta (mV) Mẫu hỏng, xuất kết tủa vẩn đục 373,5 ± 4,2 367,2 ± 7,3 0,322 ± 0,012 0,318 ± 0,018 -20,4 ± 0,3 -21,3 ± 0,6 402,2 ± 6,1 362,9 ± 5,0 0,328 ± 0,009 0,321 ± 0,012 -19,6 ± 0,2 -21,7 ± 0,3 Theo kết nghiên cứu bảng 3.23, lựa chọn tỷ lệ quercetin: HSPC:cholesterol (mol:mol:mol) 1:1:0,2 (M3’) 3.2.1.3 Xác định số thông số kỹ thuật trình bào chế phytosome  Lựa chọn thời gian phản ứng Tiến hành bào chế phytosome quercetin nhiệt độ 80oC với tốc độ quay 150 vòng/phút Kết khảo sát ảnh hưởng thời gian phản ứng đến tỷ lệ hoạt chất phytosome hóa thể bảng 3.25: Bảng 3.25 Ảnh hƣởng thời gian phản ứng đến tỷ lệ hoạt chất phytosome hóa (n = 3) Thời gian (giờ) EE (%) 77,10 ± 0,35 77,63 ± 0,40 77,69 ± 0,34 78,07 ± 0,43 85,08 ± 0,31 Thời gian (giờ) 10 16 20 EE (%) 93,33 ± 0,42 94,82 ± 0,51 96,07 ± 0,40 97,79 ± 0,37 98,99 ± 0,39 Để đạt hiệu suất phytosome hóa cao ≥ 90 % thời gian bào chế không kéo dài, lựa chọn thời gian phản ứng  Lựa chọn nhiệt độ phản ứng Bảng 3.26 Đặc tính phytosome quercetin bào chế với nhiệt độ phản ứng khác (n = 3) Nhiệt độ KTTP (nm) PDI 80oC 70oC 60oC 358,4 ± 4,4 367,6 ± 3,1 393,0 ± 2,8 0,281 ± 0,019 0,339 ± 0,016 0,318 ± 0,015 13 Thế Zeta (mV) -21,9 ± 0,3 -24,4 ± 1,1 -19,5 ± 0,7 Tỷ lệ hoạt chất phytosome hóa (%) 93,33 ± 0,42 91,83 ± 0,43 84,78 ± 0,67 Từ kết bảng 3.26, lựa chọn nhiệt độ phối hợp quercetin với phospholipid 80oC Ngoài ra, quercetin PL dễ hòa tan nhiệt độ nên giảm thể tích dung mơi ethanol, thuận lợi cho việc nâng quy mô  Lựa chọn tốc độ quay bình cất quay phối hợp quercetin với phospholipid Bảng 3.27 Đặc tính phytosome quercetin bào chế với tốc độ quay khác (n = 3) Tốc độ (vòng/phút) 50 100 150 KTTP (nm) PDI 368,9 ± 4,2 376,4 ± 3,6 358,4 ± 4,4 0,312 ± 0,022 0,314 ± 0,012 0,281 ± 0,019 Thế Zeta (mV) -20,8 ± 0,3 -21,3 ± 0,2 -21,9 ± 0,3 Tỷ lệ hoạt chất phytosome hóa (%) 92,83 ± 0,76 93,65 ± 0,76 93,33 ± 0,42 Nhằm đảm bảo hiệu suất phytosome hóa ≥ 90 %, đồng thời để thuận lợi tiến hành nâng quy mơ với bình cầu dung tích 20 lít thời gian kéo dài, chọn tốc độ quay giai đoạn phối hợp 50 vòng/phút 3.2.2 Nghiên cứu nâng quy mô bào chế phytosome quercetin lên 500 g/mẻ dự kiến tiêu chuẩn chất lượng 3.2.2.1 Bào chế phytosome quercetin quy mô 500 g/mẻ Để phù hợp với điều kiện thực tế, nghiên cứu tiến hành khảo sát thay đổi số thông số kỹ thuật: Giảm thể tích ethanol đảm bảo tỷ lệ quercetin phytosome hóa 90 % Loại ethanol thông qua hai giai đoạn, bốc dung môi máy cất quay thu lấy bột nhão, sau sấy tủ sấy chân không 24 Tiến hành bào chế lô phytosome quercetin với công thức thể bảng 3.28 theo quy trình hình 3.13 Bảng 3.28 Thành phần công thức bào chế phytosome quercetin STT Thành phần Quercetin HSPC Cholesterol Ethanol tuyệt đối 14 Khối lƣợng (g) 149 g 351 g 34 g lít + Quercetin, HSPC, cholesterol (tỷ lệ 1:1:0,2) Hịa tan lít ethanol Tạo phytosome quercetin + Nhiệt độ: 80oC + Tốc độ quay: 50 v/ph + Thời gian: + Áp suất thường + Nhiệt độ: 40oC + Thời gian: + Áp suất: 100 mbar Bốc dung môi Sấy khô phytosome + Nhiệt độ: 40oC + Thời gian: 24 + Áp suất: - 0,07 mmHg Rây bột phytosome + Rây 250 quercetin Đóng gói, bảo quản + Túi nhơm kín Hình 3.13 Sơ đồ quy trình bào chế phytosome quercetin quy mơ 500 g/mẻ 3.2.2.2 Đánh giá số đặc tính phytosome quercetin bào chế quy mô 500 g/mẻ Tiến hành đánh giá số tiêu chất lượng lơ phytosome bào chế: Bảng 3.29 Một số đặc tính hỗn dịch phytosome quercetin (n = 3) Lô KTTP (nm) 470,6 ± 4,1 465,5 ± 3,2 464,5 ± 2,3 PDI 0,364 ± 0,044 0,361 ± 0,051 0,367 ± 0,013 Zeta (mV) -21,6 ± 0,8 -21,5 ± 0,9 -21,9 ± 1,3 Hình ảnh chụp SEM cho thấy tiểu phân quercetin tồn dạng tinh thể hình đa giác với cạnh sắc rõ Trong khi, phytosome quercetin có dạng tiểu phân hình cầu, với KTTP trung bình khoảng 350 - 400 nm, phù hợp với kết bảng 3.29 (KTTP đo phương pháp phổ tán xạ ánh sáng DLS) Bảng 3.30 Độ tan trung bình (µg/ml) quercetin ngun liệu quercetin phytosome môi trƣờng khác (n = 3) Môi trƣờng Mẫu Quercetin Phytosome quercetin Nƣớc Dung dịch HCl pH 1,2 Đệm phosphat pH 4,5 Đệm phosphat pH 6,8 0,85 ± 0,12 9,21 ± 0,51 0,44 ± 0,09 4,26 ± 0,29 15 1,48 ± 0,19 9,33 ± 0,36 1,91 ± 0,15 10,38 ± 0,44 Bảng 3.31 Hệ số phân bố log D quercetin phytosome quercetin (n=3) Mẫu Quercetin Phytosome quercetin pH pha nƣớc 1,2 4,5 6,8 1,2 4,5 6,8 Log D 3,80 ± 0,42 3,32 ± 0,38 3,21 ± 0,57 3,02 ± 0,22 2,64 ± 0,15 2,59 ± 0,44 Theo kết bảng 3.30 bảng 3.31, nhận thấy quercetin dạng phytosome có độ tan nước (ở pH khác nhau) cao đạt cân dầu – nước tốt Thông qua kết đánh giá khả giải phóng hoạt chất từ phytosome quercetin bào chế nhận thấy so với quercetin dihydrat, lượng hoạt chất hòa tan từ phytosome nhiều với tốc độ giải phóng nhanh Kết phù hợp với kết đánh giá độ tan log D Nhằm xác định tương tác quercetin với PL phytosome, nghiên cứu tiến hành quét phổ Xray, DSC, IR, NMR MS Dựa phân tích hình ảnh phổ chứng minh có hình thành phytosome, nhóm P-O-C, -P=O nhóm -N+(CH3)3 phân tử HSPC tương tác yếu với nhóm phenolic hoạt chất quercetin liên kết hydro tương tác ion lưỡng cực 3.2.2.3 Dự kiến tiêu chuẩn sở phytosome quercetin Dựa kết đánh giá đặc tính phytosome quercetin từ mẻ nghiên cứu, số tiêu chuẩn chất lượng phytosome quercetin đề xuất bảng 3.40 Bảng 3.40 Kết đánh giá đặc tính phytosome quercetin bào chế đề xuất tiêu chuẩn chất lượng Tiêu chuẩn chất lƣợng Tính chất bột phytosome quercetin trước hydrat hóa Tính chất bột phytosome quercetin sau hydrat hóa Lơ Mất khối lượng làm khô (%) (n = 3) 2,29 ± 0,11 Lô Lô Đề xuất tiêu chuẩn Bột khô, mịn, màu vàng nhạt Hỗn dịch đồng nhất, không lắng cặn 2,82 ± 0,09 16 2,65 ± 0,13 Khơng q 9,00% (kl/kl) Kích thước tiểu phân (nm) (n = 3) Hệ số đa phân tán PDI (n = 3) Định tính Hàm lượng quercetin tồn phần phytosome (%) (n = 3) Tỷ lệ quercetin phytosome hóa (%) (n = 3) Độ tan nước (µg/ml) (n = 3) 470,6 465,5 464,5 Không 500 nm ± 4,1 ± 3,2 ± 2,3 0,364 0,361 0,367 Không 0,400 ± 0,044 ± 0,051 ± 0,013 Sắc ký đồ có pic với thời gian lưu trùng với thời gian lưu pic quercetin chuẩn 27,75 26,81 26,62 Từ 25 % đến 29 % ± 0,51 ± 0,73 ± 0,55 97,03 96,84 95,94 Khơng 90 % so ± 0,92 ± 0,75 ± 0,68 với quercetin ban đầu 9,21 8,95 9,25 Trên µg/ml ± 0,51 ± 0,32 ± 0,16 3.2.3 Theo dõi độ ổn định phytosome quercetin Sau tháng bảo quản điều kiện thực điều kiện lão hóa cấp tốc, bột phytosome giữ đặc tính ban đầu: Khơ, tơi, mịn, màu vàng nhạt KTTP PDI mẫu nằm giới hạn cho phép (KTTP < 500,0 nm PDI < 0,4) Hàm lượng quercetin phytosome tỷ lệ quercetin phytosome hóa giảm khơng đáng kể (dưới % so với giá trị ban đầu) Trong đó, hàm ẩm có xu hướng tăng, đặc biệt điều kiện lão hóa cấp tốc (sau tháng, hàm ẩm 8,02 % so với ban đầu 2,29 %) Như vậy, thấy khó khăn ứng dụng phytosome vào dạng rắn dùng đường uống trì hàm ẩm bột phytosome Độ hòa tan bột phytosome sau tháng bảo quản hai điều kiện nghiên cứu không thay đổi đáng kể so với ban đầu (p > 0,05) Từ số liệu thu được, thấy bột phytosome quercetin bào chế ổn định tháng theo dõi điều kiện thực lão hóa cấp tốc 3.3 Đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro phytosome quercetin thơng qua khả trung hòa gốc tự DPPH Bảng 3.43 Khả trung hòa gốc tự DPPH mẫu (n = 3) Nồng độ (µg/ml) 200 100 50 25 12,5 Phần trăm trung hòa gốc tự DPPH (%) Quercetin dihydrat Phytosome quercetin Acid ascorbic 76,79 ± 1,08 76,74 ± 0,66 74,77 ± 0,55 74,53 ± 0,93 84,43 ± 1,43 74,49 ± 0,63 74,34 ± 1,51 81,47 ± 1,22 72,19 ± 1,03 73,97 ± 1,09 78,57 ± 1,97 72,15 ± 0,48 72,42 ± 0,84 74,56 ± 1,07 17 6,25 3,125 IC50 (µg/ml) 65,42 ± 0,79 49,02 ± 0,41 3,22 ± 0,07 62,20 ± 1,15 49,38 ± 0,53 3,30 ± 0,03 48,54 ± 1,42 24,78 ± 0,71 5,93 ± 1,44 So sánh giá trị IC50 hai mẫu thử nhận thấy sau tạo phức với phospholipid, tác dụng chống oxy hóa in vitro quercetin khơng thể rõ phép thử Nguyên nhân phytosome tăng sinh khả dụng thông qua việc cải thiện độ tan hạn chế q trình chuyển hóa quercetin thể Nhưng trình thực nghiệm, quercetin phytosome quercetin hòa tan DMSO 3.4 Đánh giá tác dụng bảo vệ gan mô hình chuột bị gây độc carbon tetraclorid Bảng 3.45 Sự thay đổi nồng độ AST ALT huyết chuột BALB/c bị nhiễm độc CCl4 (n = 6) TT Lô Đối chứng sinh lý Đối chứng bệnh lý Lô uống silymarin: 50 mg/kgP/ngày Lô uống quercetin: 50 mg/kgP/ngày Lô uống quercetin: 100 mg/kgP/ngày Lô uống phytosome: 50 mg quercetin/kgP/ngày Lô uống phytosome: 100 mg quercetin/kgP/ngày AST (UI/L) 115,20 ± 6,56 1528,59 ± 86,53 1366,06 ± 84,31 1397,96 ± 81,60 645,75** ± 78,02 598,34** ± 74,11 323,84** ± 30,86 ALT (UI/L) 42,97 ± 3,97 553,38 ± 45,86 336,75** ± 58,69 445,07 ± 54,31 267,94** ± 39,26 230,34** ± 49,97 104,47** ± 13,32 **: p < 0,01 so với đối chứng bệnh lý; p6-7 < 0,01; p5-6 > 0,01 Từ bảng 3.45 nhận thấy phytosome quercetin hai mức liều có tác dụng bảo vệ gan tốt quercetin đối chứng tham khảo Hiệu bảo vệ gan in vivo tỷ lệ thuận với tăng liều hoạt chất Kết phù hợp với việc phytosome quercetin làm giảm hàm lượng MDA tăng hàm lượng GSH gan theo hướng mức bình thường so với chứng sinh lý Với kết nghiên cứu thu được, chứng minh việc tạo phức hợp phytosome quercetin cải thiện tác dụng bảo vệ gan in vivo quercetin 3.5 Nghiên cứu bào chế viên nang cứng chứa phytosome quercetin 3.5.1 Xây dựng công thức bào chế 3.5.1.1 Lựa chọn vỏ nang 18 Bảng 3.50 Đánh giá số tiêu chất lượng cốm phytosome (n=3) Độ ẩm (%) 2,31 ± 0,14 Khối lƣợng riêng biểu kiến (dbk) (g/ml) 0,80 ± 0,06 Chỉ số Carr (%) 12,93 ± 0,72 Hàm lƣợng quercetin toàn phần (%) 10,09 ± 0,56 Từ kết khảo sát nhận thấy cốm phytosome trơn chảy tốt, phù hợp để tiến hành đóng nang thiết bị đóng nang thủ công bán tự động Dựa vào giá trị Vbk, nghiên cứu lựa chọn nang cứng HPMC số Việc đóng nang khơng ảnh hưởng đến khả giải phóng quercetin 3.5.1.2 Lựa chọn tá dược để bào chế viên nang phytosome Dựa kết khảo sát khả giải phóng quercetin từ viên nang thay đổi tỷ lệ tá dược, nghiên cứu xây dựng công thức bào chế: Phytosome quercetin (tương ứng với 50 mg quercetin) 187,41 mg; lactose 250,00 mg; natri starch glycolat 22,00 mg (rã trong:rã 1:1); Tween 80 15,00 mg; ethanol tuyệt đối 0,15 ml; Aerosil 2,50 mg talc 3,18 mg 3.5.2 Dự kiến tiêu chuẩn sở viên nang chứa phytosome quercetin Tiến hành bào chế lơ viên nang theo cơng thức trình bày mục 3.5.1.2 Dựa kết đánh giá số tiêu chất lượng cốm viên nang, số tiêu chuẩn chất lượng đề xuất sau: Bảng 3.60 Kết đánh giá đặc tính viên nang chứa phytosome quercetin đề xuất tiêu chuẩn chất lượng Mẫu Tiêu chuẩn chất lƣợng Chỉ số Carr (%) (n = 3) Cốm Mất khối lượng làm khơ (%) (n = 3) Hàm lượng quercetin tồn phần (%) (n = 3) Khối lượng riêng biểu kiến (g/ml) (n = 3) Hình thức Viên nang Sai số so với khối lượng trung bình (%) (n = 20) Hàm lượng quercetin so với ghi nhãn (%) (n=3) % quercetin hịa tan sau 45 phút (n = 6) Lơ Lô Lô Đề xuất tiêu chuẩn 13,08 12,75 13,44 11 - 15 ± 0,43 ± 0,31 ± 0,37 2,42 2,55 2,51 ≤5 ± 0,09 ± 0,17 ± 0,15 10,13 10,03 10,20 - 11 ± 0,41 ± 0,51 ± 0,59 0,80 0,81 0,80 0,78 - 0,82 ± 0,04 ± 0,03 ± 0,05 Viên nang HPMC số 0, thân nắp màu trắng chứa hạt cốm màu vàng nhạt, đồng đều, khơng vón cục 1,31 1,14 0,85 100,14 ± 0,88 96,58 ± 1,47 19 101,24 ± 0,74 97,05 ± 1,52 100,34 ± 0,56 97,03 ± 1,56 ≤5 90 - 110 ≥ 80 3.5.3 Đánh giá tác dụng bảo vệ gan in vivo viên nang cứng chứa phytosome quercetin Bảng 3.62 Sự thay đổi nồng độ AST, ALT huyết chuột hàm lƣợng MDA gan chuột BALB/c bị nhiễm độc CCl4 (n = 6) STT Lô AST (UI/L) ALT (UI/L) Chứng bệnh lý Nang quercetin Nang phytosome 1529,33 ± 116,16 1446,82 ± 111,02 682,12**± 68,59 533,93 ± 42,46 407,42 ± 39,46 256,33** ± 18,87 MDA (nM/ml dịch đồng thể gan) 3,09 ± 0,28 3,08 ± 0,25 2,25* ± 0,32 Với kết nghiên cứu bảng 3.62, bước đầu chứng minh viên nang chứa phytosome quercetin có tác dụng bảo vệ gan in vivo So sánh kết bảng 3.45 bảng 3.62 nhận thấy quy trình bào chế viên không ảnh hưởng tới chất lượng phytosome quercetin bào chế 3.6 Theo dõi độ ổn định viên nang chứa phytosome quercetin Sau 12 tháng bảo quản điều kiện thực 06 tháng điều kiện lão hóa cấp tốc, mẫu viên nang phytosome quercetin đạt tiêu hình thức độ đồng khối lượng Hàm lượng quercetin viên nang giảm nằm giới hạn cho phép (90 - 110 %) Độ hịa tan viên nang khơng có thay đổi đáng kể mức độ tốc độ hòa tan quercetin thời điểm khảo sát 12 tháng Từ số liệu thu được, thấy viên bào chế ổn định thời gian nghiên cứu Tuy nhiên, để đưa kết luận hạn dùng thực chế phẩm, cần có nghiên cứu dõi độ ổn định điều kiện thực thời gian dài CHƢƠNG BÀN LUẬN 4.1 Về xây dựng cơng thức quy trình bào chế phytosome quercetin 4.1.1 Về phương pháp bào chế Có nhiều phương pháp bào chế phytosome khác phụ thuộc vào việc tách phytosome sau trình tạo phức Trong nghiên cứu này, phương pháp bốc dung môi lựa chọn có nhiều ưu điểm, phù hợp ứng dụng vào dạng viên: Quy trình bào chế đơn giản, khơng u cầu trang thiết bị phức tạp, triển khai qui mô bào chế khác nhau, dung môi thân thiện với môi trường dễ dàng thu hồi để tái sử dụng Phytosome bào chế dạng rắn, có hiệu suất phytosome hóa độ tan nước cao 20 4.1.2 Về công thức bào chế - Dung môi: Nhằm tăng khả ứng dụng phytosome đồng thời đảm bảo độ tan hoạt chất PL ethanol lựa chọn phù hợp Bên cạnh đó, so với methanol, ethanol có số điện môi thấp nên hạn chế trao đổi proton dung môi phospholipid - Phospholipid: Độ ổn định phytosome yêu cầu quan trọng ứng dụng vào dạng bào chế Do vậy, HSPC chọn kết hợp với cholesterol Đặc tính ổn định mặt vật lý HSPC hình thành liên kết hydro cholesterol với HSPC góp phần tạo nguyên liệu phytosome quercetin ổn định, sử dụng bào chế thuốc nang - Tùy theo độ tinh khiết nguyên liệu tỷ lệ phosphatidyl cholin PL sử dụng mà tỷ lệ quercetin:HSPC có khác nghiên cứu Theo kết bảng 3.21, luận án lựa chọn tỷ lệ 1:1 (mol:mol) 4.1.3 Về thông số kỹ thuật q trình bào chế Hiện nay, chưa có nhiều nghiên cứu đánh giá sâu ảnh hưởng thông số kỹ thuật trình bào chế tới đặc tính phytosome thu Nhưng việc khảo sát lựa chọn thông số cần thiết để đảm bảo quy trình bào chế phytosome xây dựng phù hợp với quy mô thiết bị sử dụng đảm bảo tính ổn định quy trình Thực tế nghiên cứu cho thấy thông số đánh giá ảnh hưởng đến hiệu suất phytosome hóa, thời gian phản ứng yếu tố ảnh hưởng nhiều 4.1.4 Về nâng cấp quy mô bào chế Để thuận lợi tiến hành nâng quy mơ, quy trình bào chế xây dựng bỏ qua giai đoạn hydrat hóa phương pháp bốc dung mơi truyền thống thực tế nghiên cứu chứng minh khơng có chênh lệch lớn tỷ lệ quercetin phytosome hóa mẫu hydrat màng film mẫu khơng hydrat (94,26 % 93,07 %) Bên cạnh đó, bào chế phytosome dạng bột phù hợp ứng dụng vào dạng viên Chất lượng bột kiểm soát chặt chẽ đồng lơ Ngồi ra, với quy trình xây dựng, dung môi dễ dàng thu hồi để tái sử dụng Trong q trình thực nghiệm, có số thay đổi thơng số quy trình để phù hợp với điều kiện thực tế 21 4.1.5 Về phương pháp đánh giá số đặc tính phytosome quercetin  Kích thước tiểu phân, phân bố KTTP Zeta So với nghiên cứu khác, KTTP phytosome bào chế tương đối lớn khoảng 450 - 500 nm Nguyên nhân khác kích thước việc hydrat hóa bột hydrat màng film Bên cạnh đó, định hướng vào dạng viên nên luận án không không sâu nghiên cứu phối hợp phương pháp giảm KTTP Thực tế cho thấy, với kích thước 500 nm, phytosome có khả cải thiện hoạt tính sinh học quercetin cách hiệu (bảng 3.30, bảng 3.45) Ngoài đánh giá DLS, theo SEM, kích thước phytosome khoảng 400 nm Sự khác kết hai phương pháp SEM đánh giá KTTP mẫu trạng thái khơ, cịn DLS xác định kích thước môi trường nước nên kết bị ảnh hưởng môi trường phân tán  Độ tan hoạt chất Nghiên cứu không áp dụng phương pháp lọc để loại tiểu phân giai đoạn đầu lượng tiểu phân lớn, tiến hành lọc gây bịt kín lỗ lọc Ngồi ra, quercetin hoạt chất có màu nên sau lần lọc phải xử lý màng lọc Nhằm đảm bảo tách loại hoàn toàn tiểu phân hoạt chất kích thước nano, phương pháp siêu ly tâm chọn kết hợp với phương pháp lọc qua màng Amicon Ultra - kDa  Hệ số phân bố dầu - nước Cấu trúc quercetin có năm nhóm -OH phenol, trung tâm ion hóa phụ thuộc vào pH mơi trường Vì vậy, nghiên cứu lựa chọn đánh giá hệ số phân bố log D thay cho log P  Tỷ lệ hoạt chất phytosome hóa Nhằm đảm bảo kết phản ánh mức độ hình thành phytosome khơng phụ thuộc vào trình đồng KTTP, phương pháp dùng dung mơi hịa tan chọn lọc loại quercetin tự áp dụng Tính chọn lọc khơng hồn tồn dung môi gây sai số cho phương pháp, làm cho hiệu suất phytosome hóa tính tốn thấp so với thực tế Nhưng vấn đề khó giải triệt để, nhà nghiên cứu chưa đưa phương pháp tối ưu 22  Về chứng minh hình thành phytosome quercetin Do cấu trúc hoạt chất đặc tính phytosome, muốn chứng minh tạo thành phytosome cần phối hợp nhiều phương pháp vật lý khác Phổ X-Ray phổ DSC giúp theo dõi thay đổi trạng thái kết tinh mức độ kết tinh quercetin tự so với quercetin phytosome Phổ hồng ngoại có hiệu việc xác định nhóm chức phân tử quercetin liên kết với đầu phân cực phospholipid Nhưng phổ IR khơng xác định xác nhóm chức vị trí tham gia liên kết Vì vậy, cần phải đánh giá thêm phổ cộng hưởng từ hạt nhân 4.1.6 Về theo dõi độ ổn định bột phytosome quercetin Độ ổn định phytosome vấn đề cần quan tâm Với công thức chứa tỷ lệ lớn HSPC cholesterol, bột phytosome quercetin dễ hút ẩm thay đổi thể chất trình bảo quản Do đó, cần đóng bột bao bì kín, khơng thấm ẩm khí bao bì thủy tinh, túi nhôm 4.2 Về đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro phytosome quercetin Đặc trưng phytosome tăng sinh khả dụng thông qua tăng khả hấp thu qua đường uống kéo dài thời gian tồn hoạt chất thể Vì vậy, nghiên cứu thử hoạt tính sinh học phytosome thường sử dụng động vật thí nghiệm Tuy nhiên, với lĩnh vực nghiên cứu mới, trước khởi động nghiên cứu in vivo, việc hiểu rõ chế chống gốc tự in vitro quercetin dạng phytosome cần thiết, tạo sở khoa học để xây dựng mơ hình đánh giá in vivo phù hợp 4.3 Về đánh giá tác dụng bảo vệ gan in vivo phytosome quercetin Mơ hình in-vivo áp dụng nghiên cứu mơ hình gây tổn thương gan chuột BALB/c cách tiêm màng bụng CCl4 Về liều gây độc, nhằm giảm mức độ phơi nhiễm CCl4 với mơi trường quan sát tổn thương gan mức độ vừa phải chuột không chết sau gây độc, dùng liều 0,2 ml/kg Về thông số đánh giá, số AST, ALT, MDA, GSH kết hợp với quan sát đại thể gan chuột Nghiên cứu sử dụng silymarin chứng dương silymarin chứng minh có tác dụng bảo vệ phục hồi tổn thương gan 23 4.4 Về bào chế viên nang cứng chứa phytosome quercetin Khi ứng dụng phytosome quercetin vào viên nang vấn đề gặp phải lượng hoạt chất tá dược sử dụng lớn, nên việc tạo hạt trước tiến hành đóng nang phù hợp việc đóng bột vào nang Hạt bào chế theo phương pháp xát hạt ướt Tuy nhiên, phytosome quercetin nhạy cảm với nhiệt ẩm (công thức chứa tỷ lệ HSPC cao) Chính vậy, q trình bào chế phải thực điều kiện kiểm soát độ ẩm môi trường, nhiệt độ sấy nguyên liệu cốm phải khống chế 50oC Đồng thời, nghiên cứu lựa chọn sử dụng vỏ nang HPMC KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Đề tài hoàn thành mục tiêu đề ra, bao gồm: Xây dựng công thức quy trình bào chế phytosome quercetin - Đã bào chế phytosome quercetin phương pháp bốc dung môi với tỷ lệ quercetin:HSPC:cholesterol (mol/mol/mol) 1:1:0,2 - Đã xây dựng quy trình bào chế phytosome quercetin quy mô 500 g/mẻ - Đã đề xuất tiêu chuẩn sở cho phytosome quercetin bào chế - Đã đánh giá độ ổn định phytosome quercetin điều kiện thực điều kiện lão hóa cấp tốc Đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro tác dụng bảo vệ gan in vivo phytosome quercetin Xây dựng cơng thức quy trình bào chế viên nang cứng chứa phytosome quercetin - Đã xây dựng công thức bào chế viên nang cứng HPMC chứa phytosome quercetin 187,41 mg (tương ứng với 50 mg quercetin) Viên nang bào chế có độ hồ tan quercerin 96 % sau 45 phút - Đã đề xuất tiêu chuẩn sở cho viên nang chứa phytosome quercetin - Đã đánh giá độ ổn định viên nang chứa phytosome quercetin điều kiện thực điều kiện lão hóa cấp tốc - Đã đánh giá tác dụng bảo vệ gan in vivo viên nang phytosome quercetin so với viên nang quercetin KIẾN NGHỊ: - Mở rộng quy mô bào chế viên nang cứng chứa phytosome quercetin quy mô pilot công nghiệp 24 ... trên, đề tài ? ?Nghiên cứu bào chế phytosome quercetin ứng dụng vào viên nang cứng? ?? thực Mục tiêu luận án Xây dựng công thức quy trình bào chế phytosome quercetin Bước đầu đánh giá tác dụng chống... phytosome quercetin Xây dựng công thức quy trình bào chế viên nang cứng chứa phytosome quercetin - Đã xây dựng công thức bào chế viên nang cứng HPMC chứa phytosome quercetin 187,41 mg (tương ứng với... Về bào chế viên nang cứng chứa phytosome quercetin Khi ứng dụng phytosome quercetin vào viên nang vấn đề gặp phải lượng hoạt chất tá dược sử dụng lớn, nên việc tạo hạt trước tiến hành đóng nang