Nghiên cứu bào chế phytosome quercetin bằng phương pháp bốc hơi dung môi

Kích thước tiểu phân và phân bố kích thước tiểu phân của hỗn dịch phytosome quercetin bào chế với các nhiệt độ hydrat hóa khác nhau .... Nhằm khắc phục hạn chế này, nhiều công trình nghi

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

ĐÀO BÁ HOÀNG TÙNG

Mã sinh viên: 1101578

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ PHYTOSOME QUERCETIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP BỐC HƠI DUNG MÔI

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

1 TS Vũ Thị Thu Giang

2 Th.S Nguyễn Hồng Trang Nơi thực hiện:

Bộ môn bào chế

người cô giáo đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

Tôi cũng xin chân trọng cảm ơn ThS Nguyễn Hồng Trang về những chỉ bảo và

định hướng của cô cho đề tài

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến PGS.TS Phạm Thị Minh Huệ cùng toàn thể các

thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên bộ môn Bào chế - Trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành khóa luận này

Nhân đây tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô trong ban giám hiệu, các phòng ban và cán bộ nhân viên Trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã dạy bảo tôi trong suốt 5 năm học tập tại trường

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè những người đã động viên, giúp đỡ, động viên tôi trong quá trình học tập và làm khóa luận

Hà Nội, tháng 5 năm 2016

Sinh viên

Đào Bá Hoàng Tùng

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Quercetin 2

1.1.1 Nguồn gốc 2

1.1.2 Công thức hóa học 2

1.1.3 Tính chất lý hóa 2

1.1.4 Tác dụng dược lý 3

1.1.5 Dược động học 4

1.1.6 Chỉ định 4

1.1.7 Tác dụng không mong muốn 4

1.1.8 Liều dùng 4

1.1.9 Một số chế phẩm chứa quercetin lưu hành trên thị trường 4

1.2 Phytosome 5

1.2.1 Khái niệm phytosome 5

1.2.2 Thành phần cấu tạo phytosome 5

1.2.3 Ưu nhược điểm 6

1.2.4 Phương pháp đánh giá tương tác giữa dược chất và phospholipid trong phytosome 7

1.2.5 Đánh giá một số đặc tính của phytosome 10

1.3 Bào chế phytosome 11

1.3.1 Bào chế phức hợp phytosome thô bằng phương pháp bốc hơi dung môi 11

1.4.1 Một số nghiên cứu về phức hợp phytosome của các dược chất khác 12

1.4.2 Một số nghiên cứu về phytosome quercetin 13

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Đối tượng nghiên cứu, nguyên vật liệu, phương tiện nghiên cứu 15

2.2 Nội dung nghiên cứu 16

2.3 Phương pháp nghiên cứu 16

2.3.1 Phương pháp bào chế phytosome quercetin 16

2.3.2 Phương pháp xác định hàm lượng quercetin trong phytosome bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) 17

2.3.3 Phương pháp xác định độ tan của quercetin và phytosome quercetin 18

2.3.4 Phương pháp siêu âm làm giảm và đồng nhất kích thước tiểu phân 18

2.3.5 Đánh giá tương tác giữa quercetinvà phospholipid trong phức hợp phytosome 18

2.3.6 Phương pháp đánh giá một số đặc tính của phytosome quercetin 19

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21

3.1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng quercetin bằng HPLC 21

3.1.1 Độ đặc hiệu 21

3.1.2 Khảo sát tính tương thích của hệ thống sắc kí 21

3.1.3 Tính tuyến tính 22

3.1.4 Độ lặp lại 22

3.3 Bào chế phytosome quercetin với nguyên liệu lecithin 25

3.3.1 Khảo sát một số thông số của quy trình bào chế phytosome quercetin với nguyên liệu lecithin 26

3.3.2 Nghiên cứu phương pháp làm giảm kích thước tiểu phân phytosome 29

3.4 Bào chế phytosome quercetin với phosphatidyl cholin đậu nành hydrogen hóa…… 32

3.4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ hydrat hóa 32

3.4.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ mol dược chất:phospholipid tới các đặc tính của phytosome quercetin 33

3.4.3 Đánh giá khả năng giải phóng dược chất của phức hợp phytosome 37

3.4.4 Chứng minh khả năng tạo phức hợp giữa quercetin và phospholipid trong phytosome 38

3.5 Bàn luận 43

3.5.1 Về xây dựng công thức và quy trình bào chế phức hợp 43

3.5.2 Phương pháp đánh giá phức hợp 44

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 47

2 DSC Phân tích nhiệt quét vi sai (Differential Scanning Calorimetry)

3 1H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hydro đồng vị 1H

Sắc kí lỏng hiệu năng cao (high performance liquid chromatography)

5 HSPC Phosphatidylcholin đậu nành hydrogen hóa (Hydrogenated Soy

11 SEM Kính hiển vi điện tử quét (Scanning Electron Microscope)

12 TEM Kính hiển vi điện tử truyền qua (Transmission Electron Microscope)

13 TLTK Tài liệu tham khảo

14 XRD Phổ nhiễu xạ tia X (X-ray Diffraction)

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát tính tương thích của hệ thống sắc ký 21

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát tính lặp lại của hệ thống sắc kí 22

Bảng 3.3 Bảng kết quả khảo sát độ đúng của hệ thống sắc kí 23

Bảng 3.4 Độ tan của quercetin trong các môi trường khác nhau 24

Bảng 3.5 Kết quả đánh giá độ tan của phức hợp được bào chế 26

Bảng 3.6 Kích thước tiểu phân và phân bố kích thước tiểu phân của hỗn dịch phytosome quercetin bào chế với các nhiệt độ hydrat hóa khác nhau 27

Bảng 3.7 Một số đặc tính của hỗn dịch phytosome quercetin được siêu âm trong các khoảng thời gian khác nhau 30

Bảng 3.8 Kích thước tiểu phân và phân bố kích thước tiểu phân của hỗn dịch phytosome bào chế ở nhiệt độ hydrat hóa khác nhau 32

Bảng 3.9 Một số đặc tính của phức hợp bào chế với tỷ lệ mol quercetin:HSPC khác nhau 33

Bảng 3.10 Độ tan của phytosome quercetin trong môi trường nước khi thay đổi tỷ lệ quercetin:HSPC 34

Bảng 3.11 Số sóng gốc –OH trong phân tử quercetin, gốc N+(CH3)3, (RO)2PO2- trong phân tử HSPC của các mẫu 39

Hình 1.3 Cấu trúc phân tử của phosphatidylcholin đậu nành hydrogen hóa 6 Hình 1.4 Phổ 31P-NMR chất rắn của một số dạng phospholipid trong phức hợp 9 Hình 3.1 Đường chuẩn quercetin trong methanol 22 Hình 3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ hydrat hóa tới kích thước tiểu phân và phân bố kích thước tiểu phân hỗn dịch phytosome 27 Hình 3.3 Ảnh hưởng của thời gian hydrat hóa đến đặc tính của hỗn dịch phytosome 28 Hình 3.4 Một số đặc tính của hỗn dịch phytosome bào chế với tốc độ quay khác nhau 29 Hình 3.5 Ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến kích thước tiểu phân và phân bố kích thước tiểu phân của hỗn dịch phytosome quercetin 30 Hình 3.6 Kích thước tiểu phân, phân bố kích thước tiểu phân của hỗn dịch phytosome được bào chế với tỷ lệ quercetin:HSPC khác nhau 33 Hình 3.7 Sơ đồ quy trình bào chế hỗn dịch phytosome quercetin 36 Hình 3.8 Khả năng giải phóng dược chất của bột quercetin dihydrate, phytosome quercetin bào chế với lecithin và phytosome quercetin bào chế với HSPC 37 Hình 3.9 Phổ IR của quercetin dihydrat, phosphatidyl cholin đậu nành hydrogen hóa, hỗn hợp vật lý dược chất-phospholipid, và phytosome quercetin 38 Hình 3.10 Phổ 1H-NMR đoạn 9-13 ppm của quercetin và phytosome quercetin 40 Hình 3.11 Kết quả phân tích nhiệt quét vi sai của phospholipid, quercetin và phytosome 41 Hình 3.12 Phổ nhiễu xạ tia X của quercetin dihydrat, phospholipid và phytosome quercetin 42

ĐẶT VẤN ĐỀ

Quercetin là một flavonoid thường gặp trong tự nhiên và có nhiều tác dụng sinh học

có lợi đã được nghiên cứu như : tác dụng chống oxy hóa, chống viêm, chống ung thư, trị bệnh gout, một số bệnh về mắt… Tuy vậy, ứng dụng trong ngành dược của quercetin cho đến nay còn hạn chế do dược chất này ít tan trong nước dẫn đến khó được hấp thu vào cơ thể và sinh khả dụng thấp

Nhằm khắc phục hạn chế này, nhiều công trình nghiên cứu đã thực hiện theo các hướng khác nhau như: bào chế chế phẩm dưới dạng tiểu phân nano, tạo phức hợp với cyclodextrin… Một trong những phương pháp được tập trung nghiên cứu trong những năm gần đây đó là tạo phức hợp phytosome giữa quercetin và phospholipid, với nhiều

ưu điểm như: độ bền cao, khả năng nạp thuốc tốt, tăng thời gian lưu thông của thuốc trong hệ tuần hoàn, tăng khả năng thấm nội bào, tăng hấp thu dược chất qua da và có khả năng dưỡng da của phosphatidylcholin…

Để góp phần bước đầu ứng dụng công nghệ phytosome cho các dược chất ít tan có nguồn gốc dược liệu, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu bào chế phytosome quercetin bằng phương pháp bốc hơi dung môi” với hai mục tiêu chính :

- Bào chế được phytosome quercetin bằng phương pháp bốc hơi dung môi

- Đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng của hỗn dịch chứa phức hợp phytosome quercetin

1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Quercetin

1.1.1 Nguồn gốc

Quercetin là một flavonoid, được phát hiện đầu tiên ở dạng aglycon của quercitrin

có trong vỏ cây Quercus tinctoria Trong tự nhiên, quercetin phân bố rất rộng rãi và

được tìm thấy ở cả dạng tự do và glycoside, chẳng hạn dạng 3-glucoside tìm thấy trong ngô, hoa hòe … Dạng tự do có trong lá hành, trà xanh, trà đen…

- Phân tử khối: 302,23 g/mol

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của phân tử quercetin

1.1.3 Tính chất lý hóa

 Lý tính:

- Bột kết tinh màu vàng xanh, hình kim

- Bình thường tồn tại ở dạng dihydrat, trở nên khan ở 95-97oC

- Tính acid yếu: Quercetin trong dung dịch ammonic có màu vàng sáng [4]

- Phản ứng thế: Các flavonoid dễ tham gia phản ứng thế hơn so với benzene

- Phản ứng diazo hóa và azo hóa: Thường sử dụng để phát hiện flavonoid trên sắc

kí đồ Thuốc thử là các amin thơm như acid sulfanilic, benzidin, p-nitroanilin [8]

- Phản ứng Shinoda: Trong môi trường HCl, quercetin bị khử bởi Mg tạo thành dẫn chất màu cyaniding chlorid [3]

1.1.4 Tác dụng dược lý

Quercetinlà một flavonoid có hoạt tính sinh học đa dạng

- Tác dụng chống oxy hóa: Quercetin là một trong những flavonoid có hoạt tính mạnh nhất trong việc bảo vệ cơ thể chống lại các gốc tự do oxy hóa Cơ chế chống oxy hóa của quercetin có thể là thu thập gốc tự do, ức chế sự peroxi hóa lipid và tạo phức chelat với ion kim loại [22], [26] Bên cạnh đó, nhiều nghiên cứu đã chứng minh quercetin bảo vệ cơ thể khỏi tác dụng oxy hóa quang học của tia UVB, UVA theo cơ chế làm giảm enzym chống oxy hóa do phơi nhiểm UVB, UVA gây ra, giảm lượng malondialdehyd, chống viêm… [18], [26]

- Ức chế quá trình sinh tổng hợp chất màu melanin trên da: Quercetin ức chế hoạt động của enzym tyrosinase, enzym đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp chất màu melanin Do đó, dược chất này được sử dụng khá phổ biến trong mỹ phẩm và dược phẩm để điều trị các bệnh về da và làm đẹp da [9]

- Chống dị ứng: Quercetin ức chế mạnh sự giải phóng histamin từ tế bào ưa base [2]

- Tác dụng chống viêm: Quercetin làm giảm hiện tượng phù bàn chân do albumin, histamin, serotonin gây nên cũng như làm giảm triệu chứng sưng khớp khuỷu

do enzym hyaluronidase [2]

Ngoài ra, quercetin còn nhiều tác dụng khác như kìm hãm sự phát triển tế bào ung thư, kháng nấm phổ rộng, ức chế vi khuẩn Gram (+), ức chế virus HIV, chống nhiễm và chống sao chép đối với một số loại virus như virus á cúm, virus HSV, chống kết tập tiểu cầu, điều trị bệnh gout, ngăn chặn các biến chứng của bệnh đái tháo đường [5], [9], [16], [22]

1.1.5 Dược động học

Quercetin kém hấp thu qua đường tiêu hóa Trong huyết tương, 98% quercetin

liên kết với protein, và được tìm thấy ở dạng liên hợp với acid glucuronic, sulfat và

methyl trong khi hầu như không có dạng tự do Quercetin và dạng liên hợp của nó

được chuyển đến gan và từ gan có thể phân bố khắp các mô trong cơ thể nhờ các

albumin trong huyết tương Thời gian bán thải của quercetin trong cơ thể là

t1/2 = 25 giờ Chế độ ăn giàu mỡ, chất béo làm tăng sinh khả dụng và kéo dài thời gian

thải trừ quercetin [14], [16]

1.1.6 Chỉ định

Phòng và điều trị bệnh dị ứng, một số loại ung thư (tuyến tiền liệt, dạ dày, ruột

kết…), các biến chứng của bệnh đái tháo đường, bệnh tim mạch, bệnh gout, bệnh về

mắt (đục thủy tinh thể và thoái hóa điểm vàng ) [22]

1.1.7 Tác dụng không mong muốn

Rất ít xảy ra các tác dụng không mong muốn, thường gặp một số tác dụng phụ:

Đau đầu, dị cảm ( như ngứa chân, tay ), khó thở, có thể gây suy thận ở liều rất

cao [22]

1.1.8 Liều dùng

Lượng 15-40 mg quercetin mỗi ngày từ nguồn rau và quả Đối với mục đích

điều trị dị ứng, chống viêm và một số bệnh khác, liều cao hơn được sử dụng Liều điều

trị dao động từ 250-500 mg x 3 lần/ngày, tùy vào tình trạng sức khỏe của bệnh nhân

Ví dụ trong tình trạng dị ứng, liều 250-600 mg/ngày và đối với bệnh mề đay mạn tính,

liều 200-400 mg chia làm 3 lần/ngày được khuyến cáo [22]

1.1.9 Một số chế phẩm chứa quercetin lưu hành trên thị trường

Bảng 1.1 Một số chế phẩm chứa quercetin lưu hành trên thị trường

TT Tên chế phẩm Hàm lượng Thành phần Dạng bào chế

3 Quercetin phytosome

(Research Thorne) 250 mg

Phytosome quercetin:

phosphatidylcholin Viên nang

4 Quercetin, NutraDrops™ 1 mg/ml Quercetin, lecithin và

một số thành phần khác Hỗn dịch uống Như vậy, do độ tan rất thấp trong pha nước, quercetin hấp thu kém, có sinh khả dụng thấp, thay đổi thất thường và bị ảnh hưởng bởi chế độ ăn Điều này lý giải tại sao hầu hết các chế phẩm chứa quercetin trên thị trường đều phải sử dụng với liều cao Bào chế thuốc dựa trên công nghệ phytosome là một trong những biện pháp đầy triển vọng,

có thể cải thiện khả năng hấp thu, tăng sinh khả dụng, và giảm liều dùng quercetin

1.2 Phytosome

1.2.1 Khái niệm phytosome

Phytosome là phức hợp của cao chiết hoặc dược chất dược liệu chuẩn hóa gắn với phospholipid ở mức độ phân tử, nó có cấu trúc tương tự màng tế bào sinh học, tương hợp sinh học cao và được vận chuyển vào nội bào một cách dễ dàng [10], [23], [29]

1.2.2 Thành phần cấu tạo phytosome

Do phytosome là phức hợp của cao chiết hoặc dược chất dược liệu chuẩn hóa gắn với phospholipid ở mức độ phân tử, nên phytosome có đặc điểm vật lý, hóa học và quang phổ riêng và được coi là một phân tử mới

Hình 1.2 Cấu trúc của phytosome [23]

Cấu tạo của phytosome gồm hai phần chính: Phospholipid và dược chất dược liệu

Phospholipid

- Cấu trúc của phospholipid gồm 2 phần: phosphatidyl có bản chất thân dầu và cholin có bản chất thân nước Trong phức hợp phytosome, đầu cholin của phân tử phospholipid sẽ gắn với dược chất, trong khi đầu phosphatidyl bao bọc dược chất tạo nên tiêu phân hình cầu

- Hai loại phospholipid hay được sử dụng trong bào chế phytosome là lecithin, và một nguyên liệu tinh khiết hơn là phosphatidylcholin đậu nành hydrogen hóa (HSPC)

So với lecithin, HSPC có ưu điểm là độ tinh khiết cao và tương đối ổn định về mặt hóa học do hạn chế được các quá trình peroxyd hóa gốc acid béo chưa no, từ đó giúp màng lipid bền vững hơn, hạn chế hiện tượng hỏng màng

Hình 1.3 Cấu trúc phân tử của phosphatidylcholin đậu nành hydrogen hóa

Dược chất

- Dược chất ở đây là các flavonoid nguồn gốc dược liệu, được gắn vào đầu phân cực của phospholipid, trở thành bộ phận cấu tạo của màng, và có sự hình thành các liên kết hydro giữa hydroxyl phenol của dược chất và ion phosphat trên nhánh phospholipid cho từng phân tử dược chất [10], [23]

1.2.3 Ưu nhược điểm

Ưu điểm :

- Phytosome dễ tan trong cả dung môi thân dầu và thân nước Do đó, tăng khả năng hấp thu dược chất, gia tăng sinh khả dụng qua đường uống và qua da, giảm liều cần dùng và tăng hiệu quả điều trị

- Do hình thành các liên kết hóa học giữa phân tử phosphatidylcholin với dược chất dược liệu nên phytosome có độ ổn định cao hơn các dạng bào chế khác

- Hiệu quả nạp thuốc cao

- Phospholipid tự nhiên vừa là chất mang vừa có khả năng bảo vệ gan Các sản phẩm có sử dụng phosphatidylcholin đã chứng minh tác dụng hiệp đồng và bảo vệ đối với các tế bào gan

- Phytosome có thể làm gia tăng thời gian bán thải của một số hợp chất, giúp tăng thời gian tồn tại của chất đó trong cơ thể và qua đó tăng tác dụng sinh học

- Tác dụng hướng đích hiệu quả hơn và tăng vận chuyển vào nội bào

- Phytosome được sử dụng khá phổ biến trong lĩnh vực mỹ phẩm do có khả năng tăng tính thấm của dược chất qua da, lý do là đặc tính thân dầu của phytosome giúp dược chất dễ dàng vượt qua lớp màng sinh học giàu lipid

- Do phytosome cải thiện được độ tan của dược chất trong muối mật nên tăng tác dụng của thuốc tại gan [10], [23], [29]

vi sai (DSC), phổ nhiễu xạ tia X (XRD)

 Phân tích phổ hồng ngoại (IR)

Nguyên tắc: trong phân tử, các nguyên tử ở mỗi liên kết sẽ dao động với một tần

số đặc trưng nằm trong vùng hồng ngoại Khi bị chiếu một chùm tia, liên kết đó sẽ hấp thụ bức xạ có bước sóng đúng bằng dao động giữa các nguyên tử của liên kết Các nhóm có cấu tạo khác nhau sẽ dao động ở những số sóng khác nhau và đặc trưng cho nhóm đó [1]

Mục đích: Sau khi quét phổ và giải được phổ IR của phytosome, ta sẽ phân tích

sự thay đổi số sóng của các nhóm chức đặc trưng trên phổ đồ để chỉ ra các liên kết mới hình thành và các nhóm cũ mất đi, từ đó có thể chứng minh liên kết tạo phức giữa phospholipid và dược chất

 Phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

Nguyên tắc: các hạt nhân có spin khác 0 sẽ tự quay quanh trục của nó, khi điện tích hạt nhân chuyển động trên một vòng tròn sẽ xuất hiện một từ trường Trong điều kiện bình thường, các vectơ từ sắp xếp hỗn độn do đó từ trường bị triệt tiêu Khi có một từ trường mạnh B0 tác động lên hạt nhân, các vectơ từ sẽ sắp xếp song song với từ trường ngoài theo 2 chiều khác nhau: cùng chiều - ứng với mức năng lượng thấp và ngược chiều - ứng với mức năng lượng cao Khi đặt hạt nhân vào một vùng từ trường xoay chiều B1 vuông góc với B0 và có tần số thích hợp sẽ xảy ra hiện tượng cộng hưởng từ Khi đó các vec-tơ từ sẽ chuyển mức năng lượng để sắp xếp theo cùng một hướng Quá trình đó hấp thu năng lượng Đo năng lượng hấp thu và tần số cộng hưởng

sẽ xây dựng được phổ đồ cộng hưởng từ hạt nhân [25]

Mục đích: Dược chất quercetin và phospholipid trong phytosome tương tác với nhau sẽ làm thay đổi trường điện từ của một nhóm chức năng nào đó và làm độ dịch chuyển hóa học của nhóm đó thay đổi Dựa vào đó, có thể biết thông tin về những tương tác đã xảy ra [27], [32] Phổ 1H-NMR và 31P-NMR chất lỏng đã được sử dụng để đánh giá tương tác trong phức hợp phytosome silybin [32]

Ngoài ra, có thể sử dụng phổ 31P-NMR chất rắn để xác định trạng thái tập hợp của phospholipid trong phức hợp: Khi ở dạng lipid kép, phospholipid có tính chất đối

xứng trục, do đó phổ 31P-NMR doãng rộng bất đối xứng và vai doãng về phía trường thấp Khi ở dạng phospholipid lục giác, phổ hẹp hơn về phía trường cao với vai doãng

về phía trường cao Ở dạng khác của phospholipid như micell thì phổ đối xứng trung tâm do sự di chuyển đẳng hướng [19]

Hình 1.4 Phổ 31 P-NMR chất rắn của một số dạng phospholipid trong phức hợp

 Phân tích nhiệt quét vi sai (DSC)

Nguyên tắc: mẫu chuẩn và mẫu thử được đặt trong buồng kín và gia nhiệt để chúng có cùng nhiệt độ Sự chênh lệch nhiệt lượng cần thiết để duy trì nhiệt độ của 2 mẫu bằng nhau cho biết thông tin về quá trình nhiệt của mẫu thử xảy ra trong thời gian quét Nhiệt lượng chênh lệch này được xác định như một hàm của sự chênh lệch nhiệt

độ tức thời giữa 2 mẫu [12] Khi dược chất và tá dược có tương tác với nhau sẽ làm các quá trình nhiệt bị thay đổi, điều đó được thể hiện bằng những thay đổi trên đồ thị DSC [12]

Mục đích: Từ những phân tích về sự thay đổi trên đồ thị DSC, ta có thể chứng minh được sau khi tạo thành phức hợp, có sự thay đổi về nhiệt chuyển pha của phytosome, về mức độ tinh thể của dược chất cũng như trạng thái tồn tại của phức hợp

 Phương pháp bột nhiễu xạ tia X

Nguyên tắc: Khi chiếu tia X vào vật liệu tinh thể, các nguyên tử sẽ hấp thụ và tái bức xạ tia X (tán xạ) Các sóng tán xạ này giao thoa tăng cường với nhau tạo ra hiện tượng nhiễu xạ tia X Sự nhiễu xạ tia X xảy ra khi góc tới mặt phẳng tinh thể θ ứng với cực đại giao thoa, do cường độ nhiễu xạ là rất nhỏ nếu không phải cực đại Trong phương pháp bột nhiễu xạ tia X, mẫu ở dạng bột nhằm mục đích trong mẫu có nhiều tinh thể, có định hướng ngẫu nhiên để phần lớn hạt có định hướng thỏa mãn điều kiện nhiễu xạ Vulf – Bragg Góc giữa phương chiếu tia X với mặt phẳng là θ, với tia nhiễu

xạ là 2θ, do đó giản đồ nhiễu xạ tạo nên theo hình học này gọi là giản đồ quét θ-2θ Nguồn tia X được giữ cố định, mẫu quay với tốc độ θ và detector quay quanh với tốc

độ 2θ Cường độ nhiễu xạ theo 2θ được ghi lại thành giản đồ nhiễu xạ tia X [31]

Mục đích: Phổ nhiễu xạ tia X được sử dụng để phân tích sự thay đổi về cấu trúc tinh thể của phytosome quercetin khi so sánh với giản đồ tia X của dược chất ban đầu quercetin Đối với giản đồ tia X của một chất ở dạng tinh thể có nhiều pic hẹp, còn với dạng vô định hình có pic rộng

1.2.5 Đánh giá một số đặc tính của phytosome

- Cấu trúc: Được xác định nhờ kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) hoặc bởi kính hiển vi điện tử quét (SEM)

- Kích thước và phân bố kích thước: Xác định kích thước bởi phương pháp tán xạ ánh sáng động học (DLS)

- Độ bền vững của phytosome: Đánh giá bằng cách xem xét kích thước và cấu trúc của phytosome sau thời gian bảo quản

- Hiệu suất phytosome hóa hay hiệu suất nạp thuốc: được đo bằng cách ly tâm loại bỏ dược chất tự do lắng xuống, định lượng dược chất ở phần dịch còn lại

H% = (lượng DC tạo thành phức hợp/ lượng DC đưa vào ban đầu) x100%

- Định lượng dược chất: Bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) hoặc các phương pháp quang phổ phù hợp [10], [23], [29]

1.3 Bào chế phytosome

1.3.1 Bào chế phức hợp phytosome thô bằng phương pháp bốc hơi dung môi

Phương pháp bốc hơi dung môi là phương pháp hay được sử dụng trong bào chế phytosome vì tính tiện lợi, dễ thực hiện, không yêu cầu công nghệ cao, dễ bổ sung cải tiến và nâng cấp quy mô

Phospholipid, dược chất và các thành phần khác được hòa tan trong hỗn hợp dung môi hữu cơ thích hợp Yêu cầu của hỗn hợp dung môi là phải có khả năng hòa tan tốt dược chất, tá dược và dễ bay hơi Sau đó, dung dịch này được đưa vào cốc có

mỏ hoặc bình đáy tròn của máy cất quay, tiến hành khuấy trộn trong một khoảng thời gian thích hợp để hình thành liên kết trong phức hợp Kết thúc quá trình này, dung môi hữu cơ được loại khỏi dung dịch bằng cách bốc hơi, và thu được lớp màng phytosome

Từ lớp màng phytosome này, có thể hydrat hóa trực tiếp trong bình cất quay tương tự như phương pháp Bangham tạo hỗn dịch phytosome thô, hoặc cũng có thể lấy phức hợp phytosome ra dưới dạng bột khô và tiến hành hydrat hóa ngoài bình cất quay

1.3.2 Phương pháp làm giảm và đồng nhất kích thước phytosome

Mục đích của quá trình này là tạo ra phytosome có kích thước nhỏ và phân bố kích thước hẹp, điều này giúp tăng độ ổn định về mặt vật lý, cải thiện hình thức và độ tan cho dược chất

Phytosome được làm giảm KTTP bởi các tác dụng của lực cắt Các phương pháp được sử dụng để làm giảm và đồng nhất kích thước là siêu âm, đùn ép qua màng, đồng nhất hóa áp suất cao…

Siêu âm: Đây là một trong những phương pháp phổ biến để làm giảm kích

thước tiểu phân phytosome Nguyên tắc là sử dụng sóng siêu âm để làm giảm và đồng nhất kích thước tiểu phân Quá trình siêu âm phụ thuộc nhiều yếu tố ảnh hưởng như: cường độ, tần số siêu âm, thời gian, thể tích mẫu, kiểm soát nhiệt độ trong quá trình siêu âm Trong đó, cường độ và tần số là hai thông số rất quan trọng của siêu âm Đối với liposome, siêu âm tần số thấp có thể làm giảm kích thước nhanh hơn trong khoảng

kích thước mong muốn Thời gian ngắn sử dụng năng lượng siêu âm mạnh có hiệu quả hơn so với thời gian dài sử dụng năng lượng siêu âm yếu [30] Nhược điểm của phương pháp này là làm tăng nhiệt cục bộ, từ đó tăng quá trình thủy phân và oxy hóa phospholipid cũng như ảnh hưởng đến dược chất không bền với nhiệt Siêu âm que giải phóng kim loại ở đầu que siêu âm (titan) vào sản phẩm, nên cũng có ảnh hưởng đến độ

ổn định của phytosome bào chế [15]

Đồng nhất hóa áp suất cao: Nguyên tắc của phương pháp là dưới áp suất của

khí trơ, nén hỗn dịch qua một khe hẹp có kích thước xác định trong thiết bị đồng nhất hóa Nén tuần hoàn nhiều vòng cho đến khi thu được kích thước mong muốn Ưu điểm của phương pháp này là dễ nâng cấp quy mô, kích thước thu được khá đồng nhất [6] Đùn ép qua màng: Hỗn dịch phức hợp được đùn ép qua màng polycarbonat có

kích thước lỗ màng xác định, thu được hỗn dịch có kích thước tiểu phân gần với kích thước của lỗ màng Nguyên lí của phương pháp được mô tả như sau: hỗn dịch phức hợp được đùn qua màng có các lỗ màng hình trụ, xếp đồng trục và kích thước xác định,

ở áp suất vừa phải và với số lần thích hợp Các tiểu phân có kích thước lớn hơn lỗ màng sẽ đi qua màng, các tiểu phân nhỏ thì hầu như không thay đổi kích thước khi qua màng, do đó hỗn dịch sau đùn ép có kích thước đồng nhất Ưu điểm của phương pháp này là có tính lặp lại cao giữa các lô mẻ [19]

1.4 Một số nghiên cứu về Phytosome

1.4.1 Một số nghiên cứu về phức hợp phytosome của các dược chất khác

Angelico R và cộng sự (2014) đã bào chế phytosome silybin với phospholipid là Soybean lecithin epikuron 130P bằng phương pháp bốc hơi pha đảo Phức hợp sau khi bào chế được đánh giá bằng phổ 2D (1H-1H NOESY) NMR, kết quả cho thấy có sự tương tác giữa silybin và phospholipid để hình thành phức hợp phytosome [32]

Malay K.D và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu bào chế rutin phytosome bằng phương pháp bốc hơi dung môi Kết quả cho thấy các phytosome bào chế đều có độ tan trong nước cao hơn rutin tinh khiết, phytosome bào chế với tỷ lệ rutin:phospholipid 1:1

có sự cân bằng tốt hơn giữa đặc tính thân dầu và đặc tính thân nước (3,11 ± 0,08) khi

so sánh với dược chất rutin Kết quả chụp TEM chỉ ra các phytosome có cấu trúc túi rời rạc Hình ảnh phổ hồng ngoại, biểu đồ nhiệt đã chứng minh sự hình thành phức hợp phyto-phospholipid Theo kết quả nghiên cứu nhiễu xạ tia X, rutin khi tạo phức với phopsholipid đã chuyển từ trạng thái kết tinh sang dạng vô định hình Nghiên cứu tính thấm qua da ex-vivo cho thấy khả năng thấm dược chất qua da của phytosome (33 ± 1,33 %) cao hơn rutin tinh khiết (13 ± 0,87 %) [17]

Tại Việt Nam, năm 2015 Phạm Thị Minh Huệ và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu bào chế phytosome curcumin bằng phương pháp bốc hơi dung môi, với dung môi hòa tan là ethanol, phospholipid là phosphatidylcholin đậu nành được hydrogen hóa (HSPC) Phức hợp curcumin-phospholipid sau bào chế được đánh giá một số đặc tính vật lý như kích thước tiểu phân, phân bố kích thước tiểu phân, thế zeta, độ tan Kết quả nghiên cứu cho thấy dạng bào chế phytosome làm tăng độ tan của curcumin trong

cả pha nước và pha dầu, đây là một đặc điểm nổi bật của phytosome nhằm tăng SKD của dược chất đặc biệt là những dược chất được chiết xuất từ dược liệu Kích thước phytosome dưới 500 nm cũng là một trong các lợi thế về SKD khi dùng qua đường uống và ngoài da Bằng phương pháp DSC, bước đầu nghiên cứu đã chứng minh có phản ứng liên kết hoá học giữa curcumin và HSPC [7]

1.4.2 Một số nghiên cứu về phytosome quercetin

Năm 2014, Solmaz và cộng sự [49] đã tiến hành nghiên cứu bào chế quercetin phytosome bằng phương pháp hydrat hóa màng film Phospholipid sử dụng trong nghiên cứu này là phosphatidylcholin (PC) và cholesterol (CH) Phytosome sau khi bào chế được làm giảm kích thước tiểu phân bằng phương pháp siêu âm Kết quả cho thấy phytosome bào chế với tỷ lệ quercetin:PC:CH là 1:2:0,2 cho kích thước tiểu phân nhỏ (80 ± 2,89 nm) và hiệu quả nạp thuốc cao (96 ± 0,58 %) Sự kết hợp hai phospholipid CH và PC đã cải thiện một cách đáng kể độ ổn định vật lý của phytosome trong thời gian 3 tuần Từ biểu đồ DSC cho thấy pic hấp thụ nhiệt của phytosome

giảm, kết quả này đã chứng minh sự giảm mức độ tinh thể và khả năng làm tăng độ tan dược chất của phức hợp, đồng thời đặc tính này cũng góp phần kết luận có tồn tại tương tác giữa dược chất và phospholipid [28]

Singh D và cộng sự [11] đã nghiên cứu bào chế quercetin phytosome bằng phương pháp bốc hơi dung môi, với phospholipid sử dụng là phosphatidyl cholin đậu nành Kết quả cho thấy đã có liên kết được tạo thành giữa dược chất và phospholipid, cùng với các thay đổi về đặc tính lý hóa so với dược chất ban đầu như giảm nhiệt độ chảy và enthalpy, giảm mức độ kết tinh, tăng độ tan trong nước Tác dụng chống oxy hóa của phytosome so với dạng dược chất tự do là không có nhiều thay đổi đáng kể

 Từ kết quả nghiên cứu về phytosome quercetin cũng như một số các phytosome khác như phytosome rutin, phytosome curcumin đã phần nào chứng minh được ưu điểm vượt trội của dạng bào chế này trong việc làm tăng khả năng hấp thu của dược chất khó tan Tuy nhiên, số lượng các nghiên cứu đã công bố về phytosome nói chung

và phytosome quercetin nói riêng hiện nay là chưa nhiều Bên cạnh đó, trên thị trường chỉ lưu hành một số rất ít chế phẩm chứa phytosome quercetin như Quercetin Phytosome, Quercenase®… Từ thực tế trên, nhằm góp phần bước đầu ứng dụng công nghệ phytosome vào dược chất có nguồn gốc dược liệu, từ đó làm cơ sở để tận dụng được nguồn dược liệu phong phú của nước nhà, chúng tôi đã quyết định thực hiện đề tài này

2 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu, nguyên vật liệu, phương tiện nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu: Phytosome quercetin

- Nguyên liệu:

Bảng 2.1 Nguyên liệu

STT Tên nguyên liệu Nguồn gốc Tiêu chuẩn

9 Phosphatidylcholin đậu nành đã

- Phương tiện nghiên cứu:

+ Hệ thống cất quay Rovapor R – 210 (Buchi – Đức), bình cầu NS 29/32, dung tích 1000 ml (Buchi – Đức)

+ Cân phân tích Satorius BP121S, máy đo pH InoLab, tủ sấy, tủ lạnh, cân kỹ thuật, các dụng cụ thủy tinh, lọ thủy tinh trung tính, màng lọc 0,2 µm, màng lọc Amicon Ultra-4

+ Máy đo pH Eutech instrument pH 510 (Mỹ)

+ Máy siêu âm Ultrasonic LC60H (Đức)

+ Máy hòa tan Erweka-DT700 (Đức)

+ Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent HPLC 1260 (Mỹ)

+ Máy đo kích thước tiểu phân Zetasizer Nano ZS90 (Anh)

+ Máy đo phổ nhiễu xạ tia X D8 Advance, Brucker (Đức)

+ Máy phân tích nhiệt quét vi sai Mettle Toledo AB 204S (Thụy sĩ)

+ Máy quang phổ hồng ngoại FTIR Shimadzu (Nhật)

+ Máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker Avance 500 (Đức)

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Xây dựng phương pháp định lượng quercetin trong phytosome bằng phương pháp HPLC

- Khảo sát độ tan của quercetin trong methanol và các dung dịch pH khác nhau

- Đánh giá các đặc tính của phức hợp được bào chế với 2 loại nguyên liệu phospholipid khác nhau là lecithin và HSPC

- Đánh giá khả năng tạo phức giữa quercetin và phospholipid thông qua các phổ1H-NMR, FTIR, XRD, DSC

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp bào chế phytosome quercetin

Quy trình bào chế phytosome quercetin như sau:

- Cân và hòa tan quercetin trong 20 ml methanol

- Cân và hòa tan phospholipid trong 30 ml dichloromethan

- Phối hợp hai dung dịch trên Sau đó đưa vào bình cầu dung tích 1000 ml của hệ thống cất quay Cho bình quay trong điều kiện thời gian và nhiệt độ nhất định, tốc độ quay 150 vòng/phút Sau đó, hệ thống cất quay được hút chân không, điều chỉnh áp suất để dung môi bay hơi từ từ Sau 15 phút hút chân không, dung môi bay hơi hết và màng film được hình thành thì giảm tốc độ quay xuống 100 vòng/phút Tiếp tục cất quay trong 16 giờ để đảm bảo loại hết hoàn toàn dung môi hữu cơ

Phytosome quercetin sau khi tạo thành có thể được lấy ra để bảo quản khô hoặc hydrat trực tiếp trong bình cất quay tạo hỗn dịch phytosome thô

- Hydrat hóa trực tiếp màng film: Môi trường hydrat hóa: 50 ml nước cất 2 lần Quá trình hydrat hóa được tiến hành ở điều kiện nhiệt độ, tốc độ quay và thời gian nhất định, để đảm bảo màng film đã được hydrat hóa hoàn toàn

2.3.2 Phương pháp xác định hàm lượng quercetin trong phytosome bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC)

- Mẫu thử:

Hút chính xác 1 ml mẫu thử, hòa tan bằng dung môi methanol trong bình định mức 10 ml, bổ sung thể tích đến vạch Lọc mẫu qua màng 0,2 µm trước khi tiêm mẫu vào hệ thống sắc kí

Hàm lượng quercetin trong chế phẩm được xác định bằng công thức:

CT = 𝑆𝑡

𝑆𝑐× 𝐶𝑐 × 𝑘

Trong đó:

CT: Nồng độ quercetin trong hỗn dịch phytosome (µg/ml)

St: Diện tích pic mẫu thử (mAU.s)

Sc: Diện tích pic mẫu chuẩn (mAU.s)

Cc: Nồng độ quercetin trong mẫu chuẩn (µg/ml)

k: Hệ số pha loãng

2.3.3 Phương pháp xác định độ tan của quercetin và phytosome quercetin

- Cân một lượng dư quercetin dihydrat hoặc một lượng dư phức hợp chứa 0,1 g

dược chất, cho vào ống ly tâm dung tích 15 ml, thêm 10 ml môi trường thử, lắc liên tục trong bể lắc ở khoảng 25oC

- Sau 72 giờ, đem ly tâm ở tốc độ 6000 vòng/phút trong 20 phút ở nhiệt độ phòng

Lấy phần dịch phía trên, tiếp tục lọc qua màng ly tâm siêu lọc Amicon Ultra-4 kDa

7500 vòng trong 3 phút

- Lấy phần dịch lọc, tiến hành sắc ký với các điều kiện được mô tả ở mục 2.3.2

thu được kết quả là diện tích pic Si- Diện tích pic mẫu thử (mAU.s)

- Xác định nồng độ quercetin (Ci) trong từng môi trường bằng phương pháp so sánh độ hấp thụ quang với dung địch quercetin chuẩn pha trong dung môi thử có nồng

độ C0, diện tích pic S0, xác định Ci = 𝑆𝑖

𝑆0 x C0

2.3.4 Phương pháp siêu âm làm giảm và đồng nhất kích thước phytosome

Phytosome sau bào chế được siêu âm để làm giảm KTTP và mẫu đồng nhất hơn: siêu âm liên tục 50 ml hỗn dịch phytosome trong vòng 5 phút, 10 phút, 15 phút bằng thiết bị siêu âm cầm tay, trong quá trình siêu âm có điều nhiệt bằng nước để nhiệt

độ mẫu 50-60o

C Thông số cài đặt cho máy: cường độ 50%, công suất C = 60W

2.3.5 Phương pháp đánh giá khả năng tạo phức hợp giữa quercetin và phospholipid trong phytosome

Phức hợp lấy ra dưới dạng bột khô ở phần 2.3.1 được sử dụng để đánh giá tương tác giữa dược chất và phospholipid

 Phân tích phổ hồng ngoại (IR)

Lấy khoảng 5 -10 mg mẫu đã làm khô, trộn đều và nghiền mịn với KBr, khi được hỗn hợp đồng nhất đem dập thành viên mỏng Tiến hành quét phổ với viên nén thu được

 Phân tích nhiệt quét vi sai (DSC)

Lấy khoảng 5 -10 mg mẫu đã làm khô, cho vào đĩa nhôm, hàn kín, đưa vào buồng máy, sử dụng một đĩa nhôm trắng để làm mẫu so sánh và nắp được đục 2 lỗ để phân biệt Dùng kẹp đưa 2 đĩa nhôm vào buồng gia nhiệt, bắt đầu tăng nhiệt độ từ 40-200oC với tốc độ gia nhiệt là 5oC /phút Lưu lượng khí nitơ 40 µl/phút

 Phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

Hòa tan mẫu trong DMSO đã khử khí với nồng độ 20 mg/ml Cho dung dịch vào một ống thủy tinh chuyên dụng sao cho độ cao của mực chất lỏng khoảng 4,5 đến 5 cm sau đó đậy nắp kín lại Đặt ống thủy tinh vào buồng đo, tiến hành quét phổ ở 500 MHz

 Phương pháp bột nhiễu xạ tia X

Mẫu được giữ trong bộ giữ mẫu và đưa vào thiết bị Quét mẫu từ góc 5º-50º với tốc

 Khả năng giải phóng dược chất của phức hợp

Dựa theo một số tài liệu tham khảo [20], [21], phép thử giải phóng được thực hiện như sau:

Khối lượng mẫu: tương đương 50 mg quercetin

Nhiệt độ: 37 ± 0,5oC

Thiết bị thử: Cánh khuấy

Tốc độ quay: 100 vòng/phút

Môi trường thử: 900 ml dung dịch HCl pH 1,2 có 20 % ethanol

Hút 4ml mẫu tại các thời điểm 5, 10, 15, 30, 45, 60 phút, 2, 3, 4 giờ Sau khi hút mẫu, bù 4ml môi trường thử vào bình thử hòa tan Mẫu được xử lý như sau: đưa vào tuýp ly tâm siêu lọc Amicon Ultra-4, ly tâm 7500 vòng/phút trong 3 phút Dịch thu được định lượng bằng phương pháp HPLC ở mục 2.3.2

 Kích thước tiểu phân, phân bố kích thước tiểu phân, thế Zeta

Pha loãng hỗn dịch phytosome 200 lần bằng nước cất 2 lần đã lọc qua màng cellulose acetat 0,2 µm, tiến hành đo KTTP, chỉ số đa phân tán PDI và thế zeta của hệ bằng thiết bị Zetasizer Nano ZS90

 Xác định hiệu suất phytosome hóa

Định lượng quercetin toàn phần (quercetin dạng tự do và quercetin trong phức hợp phytosome): Hút chính xác 1 ml hỗn dịch phytosome, đưa vào bình định mức

25 ml, bổ sung methanol đến vạch, tiếp tục pha loãng và định lượng bằng phương pháp HPLC với các điều kiện được mô tả ở mục 2.3.2 thu được diện tích pic là S1

Định lượng quercetin phytosome: Để xác định hiệu suất phytosome hóa, cần loại phần quercetin tự do Trong nước, quercetin tự do không tan và kích thước tiểu phân tương đối lớn, khi ly tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút sẽ lắng, bám vào thành ống Lấy phần dịch còn lại, định lượng bằng phương pháp HPLC với các điều kiện được mô tả ở mục 2.3.2.thu được diện tích pic là S2

Hiệu suất phytosome hóa được xác định bằng công thức: H % = 𝑆2

𝑆1 × 100

2.3.7 Phương pháp xử lý số liệu

Các kết quả được xử lý thống kê với sự hỗ trợ của phần mềm Microsoft Excel

2013

3 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng quercetin bằng HPLC

3.1.1 Độ đặc hiệu

- Chuẩn bị mẫu chuẩn, mẫu thử có nồng độ quercetin là 15 µg/ml

- Chuẩn bị mẫu trắng là lipid trắng có thành phần HSPC tương tự mẫu thử và pha loãng giống mẫu thử

- Tiêm mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu trắng qua cột sắc kí, đánh giá pic sắc kí xuất hiện trên sắc kí đồ

- Kết quả cho thấy: xuất hiện pic cân xứng, có thời gian lưu (tR) 7,307 phút trên sắc

kí đồ của mẫu chuẩn, không xuất hiện pic ở thời gian lưu này trên sắc kí đồ của mẫu trắng Chứng tỏ phương pháp có độ đặc hiệu cao, dược chất quercetin có thời gian lưu 7,307 phút với điều kiện sắc kí trình bày ở mục trên

3.1.2 Khảo sát tính tương thích của hệ thống sắc kí

- Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần trên một dung dịch chuẩn có nồng độ quercetin

15 µg/ml, với các điều kiện chạy sắc ký đã chọn, ghi lại các giá trị về thời gian lưu, diện tích pic Độ lặp lại của hệ thống được biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD của diện tích pic Kết quả được trình bày ở bảng 3.1

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát tính tương thích của hệ thống sắc ký

Lần đo Thời gian lưu t R (phút) Diện tích pic (mAU.s)

Hình 3.1 Đường chuẩn quercetin trong methanol

- Nhận xét: giá trị R2 gần bằng 1 chứng tỏ trong khoảng nồng độ khảo sát có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ quercetin trong mẫu chuẩn với diện tích pic Khoảng tuyến tính này phù hợp để định lượng quercetin trong phytosome quercetin

3.1.4 Độ lặp lại

- Tiến hành định lượng 6 lần với một mẫu chế phẩm thử, mỗi lần định lượng tiêm mẫu 3 lần và lấy diện tích pic trung bình Kết quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 3.2

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát tính lặp lại của hệ thống sắc kí

y = 77124x + 32593 R² = 0,9994

0500000

STT Diện tích pic (mAU.s)

- Tiến hành thêm chuẩn vào mẫu trắng để thu đƣợc dung dịch mẫu tự tạo có nồng

độ 15, 20, 25 µg/ml, mỗi nồng độ tiến hành trên 3 mẫu riêng biệt Tiến hành định lƣợng lại lƣợng chuẩn trong các mẫu trên, từ đó tính toán đƣợc % thu hồi

Bảng 3.3 Bảng kết quả khảo sát độ đúng của hệ thống sắc kí

STT Nồng độ quercetin

ban đầu (µg/ml) Diện tích pic

Nồng độ quercetin thu hồi (µg/ml) % thu hồi

- Nhận xét: Phương pháp có độ thu hồi từ 98,4 đến 100,7 % với RSD < 2 % Do

đó, phương pháp đạt yêu cầu về độ đúng

- Kết quả cho thấy: ở nồng độ 0,05 µg/ml vẫn xuất hiện pic trên sắc kí đồ, ở nồng

độ 0,01 µg/ml không xuất hiện pic với thời gian lưu 7,3 phút trên sắc kí đồ

Như vậy, phương pháp có khả năng phát hiện dược chất ở khoảng nồng độ từ 0,01µg/ml trở lên

Kết luận: Phương pháp định lượng quercetin bằng HPLC có tính thích hợp, độ

đặc hiệu, tính tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại cao Do vậy có thể ứng dụng phương pháp này để định lượng quercetin trong chế phẩm phytosome quercetin

3.2 Độ tan của quercetin trong các môi trường khác nhau

- Tiến hành xác định độ tan của quercetin trong các môi trường khác nhau như

mô tả ở mục 2.3.3, ở nhiệt độ 25 ± 2oC Kết quả được trình bày ở bảng 3.4

Bảng 3.4 Độ tan của quercetin trong các môi trường khác nhau

- Trong quy trình bào chế phytosome quercetin thì bắt buộc phải thu được một dung dịch dược chất-phospholipid trong suốt Dung môi DMSO dễ hòa tan các thành phần dược chất, phospholipid nhưng có nhiệt hóa hơi cao 189 °C nên không phù hợp với phương pháp bốc hơi dung môi Methanol có khả năng hòa tan tốt quercetin, đồng thời có nhiệt hóa hơi thấp 64,7oC nên dễ loại dung môi trong quá trình cất quay Chính

vì vậy, chúng tôi sử dụng methanol làm dung môi hòa tan quercetin Đối với phospholipid, dựa vào các tài liệu tham khảo và khảo sát sơ bộ, chúng tôi lựa chọn dung môi hòa tan là hệ dung môi methanol:dicloromethan tỉ lệ 1:2 (v/v)

3.3 Bào chế phytosome quercetin với nguyên liệu lecithin

Do nguyên liệu lecithin là hỗn hợp gồm một số loại phospholipid (trong đó thành phần chính là SPC) nên chúng tôi quy tỷ lệ mol của lecithin theo SPC

Dựa vào việc tham khảo một số tài liệu, điều kiện cất quay ban đầu như sau:

Tốc độ quay khi phối hợp dược chất, phospholipid: 150 vòng/phút

Tỷ lệ mol quercetin:lecithin: 1:1

Nhiệt độ cất quay: 45 o C

Tốc độ quay khi tráng film: 100 vòng/phút

Thời gian hút chân không: 16 giờ