Nghiên cứu bào chế phytosome quercetin bằng phương pháp kết tủa trong dung môi

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của quercetin 2 Hình 1.3 Phương pháp bào chế phytosome bằng phương pháp kết tủa Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn tương quan nồng độ quercetin và diện tích peak 24 Hìn

VŨ THỊ THU HÀ

Mã sinh viên: 1101140 NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ PHYTOSOME QUERCETIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP KẾT TỦA TRONG

DUNG MÔI

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2016

VŨ THỊ THU HÀ

Mã sinh viên: 1101140

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ PHYTOSOME QUERCETIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP KẾT TỦA TRONG

Nơi thực hiện:

Bộ môn Bào chế

HÀ NỘI – 2016

ThS Nguyễn Hồng Trang

Là những người cô đã giúp tôi có những định hướng đúng đắn về đề tài, hướng dẫn và tạo điều kiện để tôi có thể hoàn thành được các mục tiêu của đề tài Trong suốt quá trình thực hiện đề tài, cô cũng luôn động viên để tôi vượt qua những khó khăn, đưa

ra nhiều góp ý để đề tài được hoàn thiện hơn

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến PGS TS Phạm Thị Minh Huệ và toàn thể

các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên bộ môn Bào chế - Trường Đại học Dược Hà Nội

đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện đề tài tại bộ môn

Nhân đây, tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn thầy cô tại trường Đại học Dược Hà Nội đã luôn tận tâm giảng dạy chúng tôi

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình thân yêu, bạn bè đã giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành khóa luận

Hà Nội, tháng 5 năm 2016 Sinh viên:

Vũ Thị Thu Hà

1.1 Đại cương về quercetin 2

1.1.1 Công thức hóa học 2

1.1.2 Tính chất lý hóa 2

1.1.3 Tác dụng dược lý 3

1.1.4 Dược động học 4

1.1.5 Chỉ định 4

1.1.6 Tương tác thuốc 4

1.1.7 Một số chế phẩm chứa quercetin lưu hành trên thị trường 5

1.2 Đại cương về phytosome 6

1.2.1 Khái niệm phytosome 6

1.2.2 Thành phần của phytosome 6

1.2.3 Tính chất của phytosome 7

1.2.4 Ưu, nhược điểm của phytosome 8

1.2.5 Phương pháp bào chế phytosome 9

1.2.6 Phương pháp đánh giá tương tác giữa dược chất và phospholipid trong phytosome 10

1.3 Một số nghiên cứu về phytosome 14

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị, và đối tượng nghiên cứu 17

2.1.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu………17

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu……… 17

2.1.3 Đối tượng nghiên cứu……… 17

2.2 Nội dung nghiên cứu 18

2.3 Phương pháp nghiên cứu 18

2.3.3 Phương pháp xác định độ tan bão hòa của quercetin và phytosome

quercetin 20

2.3.4 Phương pháp đánh giá một số đặc tính của phytosome 20

2.3.5 Phương pháp đánh giá khả năng tạo phức quercetin - phospholipid 21

2.3.6 Nghiên cứu độ ổn định của phytosome quercetin 22

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 23

3.1 Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng quercetin bằng phương pháp HPLC……… 23

3.1.1 Độ đặc hiệu 23

3.1.2 Khảo sát tính tương thích của hệ thống sắc kí 23

3.1.3 Tính tuyến tính 24

3.1.4 Độ lặp lại 25

3.1.5 Độ đúng 25

3.1.6 Giới hạn phát hiện 26

3.2 Độ tan của quercetin trong các môi trường khác nhau 26

3.3 Bào chế phytosome quercetin bằng phương pháp kết tủa trong dung môi với phospholipid là phosphatidylcholin đậu nành được hydrogen hóa 27

3.4 Đánh giá độ ổn định của phytosome quercetin 35

3.5 Đánh giá khả năng tạo phức hợp giữa quercetin và phospholipid trong phytosome bằng phương pháp vật lý 37

3.6 Nâng cấp quy mô 40

3.7 Bàn luận 42

3.7.1 Về phương pháp bào chế phytosome quercetin 42

3.7.2 Về xây dựng công thức bào chế phytosome quercetin 43

PHỤ LỤC

Phosphatidylcholin)

TEM Kính hiển vi điện tử truyền qua

SEM Kính hiển vi điện tử quét

XRD Nhiễu xạ tia X (XRay diffraction)

Bảng 1.1 Một số chế phẩm chứa quercetin lưu hành trên thị trường 5

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát tính tương thích của hệ thống sắc ký 23 Bảng 3.2 Tương quan giữa nồng độ quercetin và diện tích peak 24 Bảng 3.3 Kết quả khảo sát tính lặp lại của hệ thống sắc kí 25 Bảng 3.4 Bảng kết quả khảo sát độ đúng của hệ thống sắc kí 25 Bảng 3.5 Độ tan của quercetin trong các môi trường khác nhau 27

Bảng 3.13 Đánh giá ảnh hưởng của tỷ lệ quercetin : HSPC đến độ tan của

Bảng 3.15 Sự khác nhau giữa các đặc tính của mẫu làm trên cất quay so với

mẫu làm trên máy khuấy từ

40

Bảng 3.16 Đánh giá ảnh hưởng của lượng mẫu bào chế đến một số đặc tính

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của quercetin 2

Hình 1.3

Phương pháp bào chế phytosome bằng phương pháp kết tủa

Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn tương quan nồng độ quercetin và diện tích peak 24

Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến một số

Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ khuấy từ đến một số

Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi KTTP, phân bố KTTP sau 1 tuần

Hình 3.6 Hình ảnh các mẫu bào chế với các dung môi kết tủa khác nhau

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay, xu hướng sử dụng các hợp chất từ thiên nhiên trong phòng và chữa bệnh ngày càng tăng Quercetin là một flavonoid polyphenol tự nhiên, phân bố rộng rãi trong thực vật và mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe Tuy nhiên, hiện nay quercetin vẫn được sử dụng khá hạn chế trong ngành dược do sinh khả dụng của quercetin thấp và dao động giữa các cá thể sau khi uống Nguyên nhân của vấn đề này là do dược chất có kích thước phân tử lớn và kém tan trong nước nên khó được hấp thu vào cơ thể

Để khắc phục nhược điểm đó, nhiều nghiên cứu đã thực hiện theo nhiều hướng khác nhau như: bào chế chế phẩm dưới dạng tiểu phân nano, thay đổi cấu trúc hóa học, tạo phức với cyclodextrin… Một trong những hướng nghiên cứu được chú ý hiện nay là bào chế phytosome Phytosome là sản phẩm kết hợp giữa các hoạt chất

có nguồn gốc thiên nhiên với phospholipid tạo ra phức hợp vừa thân nước vừa thân dầu, giúp dược chất dễ dàng được hấp thu vào cơ thể, làm tăng sinh khả dụng của hoạt chất

Hướng nghiên cứu tạo phức hợp quercetin - phospholipid còn khá mới mẻ, chưa

có nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới, cũng như trong nước về lĩnh vực này Nhằm phát triển một dạng bào chế mới với hiệu quả điều trị vượt trội, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu bào chế phytosome quercetin bằng phương pháp kết tủa trong dung môi” với các mục tiêu như sau:

1 Bào chế được phytosome quercetin bằng phương pháp kết tủa trong dung môi

2 Đánh giá một số đặc tính của phytosome quercetin đã bào chế được

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Đại cương về quercetin

- Trọng lượng phân tử: 302,24g/mol [18]

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của quercetin [19]

- Độ tan: Ít tan trong nước và ether, dễ tan trong aceton và ethanol

- Khối lượng riêng (mg/m3): 12,36 × ppm

- Phản ứng cyanidin: Trong môi trường HCl, quercetin bị khử bởi Mg tạo

thành dẫn chất màu cyaniding chlorid [3]

- Phản ứng với dung dịch FeCl3: Thêm vài giọt FeCl3 5% vào dung dịch quercetin trong ethanol, lắc sẽ xuất hiện màu xanh [3]

- Phản ứng diazo hóa: Kiềm hóa dung dịch quercetin trong ethanol bằng dung

dịch kiềm (dung dịch NaOH, KOH, Na2CO3), thêm vài giọt thuốc thử diazoni tạo thành chất màu azoic vàng cam đến đỏ [3]

- Phản ứng với H2SO4 đậm đặc: Acid H2SO4 khi nhỏ lên quercetin sẽ cho màu vàng đậm [1]

1.1.3 Tác dụng dược lý

Quercetin có các tác dụng dược lý sau:

- Chống oxy hóa mạnh: Các gốc tự do có thể được tạo ra từ các chất oxy hóa

mạnh mang gốc kim loại (Fe) hay các hợp chất hữu cơ chứa các gốc như nitrit (NO), carboxyl (COO), carbonyl (CHO)…dưới tác dụng của các tác nhân gây oxy hóa như oxy phân tử (O2), tia cực tím (UV), phóng xạ, các chất xúc tác (enzym)… Các chất mang gốc tự do sinh ra nhiều là nguyên nhân gây tăng sự lão hóa, đột biến, bất thường sinh tế bào (ung thư) và các tác hại cho hoạt động sinh lý (như sinh hóa máu, rối loạn tiêu hóa, gan thận…) Quercetin là hoạt chất có khả năng chống oxy hóa thông qua việc thu dọn trực tiếp các gốc tự do; liên kết với các ion kim loại chuyển tiếp để ngăn chặn phản ứng oxy hóa xảy ra; và tăng cường chức năng của các chất chống oxy hóa nội sinh [5]

- Giảm nguy cơ mắc các bệnh tim mạch: Quercetin tác động lên peroxyl

radical nên ức chế sự hình thành của hydroperoxid, đồng thời tác động lên alkoxyl radical nên ngăn chặn sự oxy hóa của LDL-Cholesterol [5]

- Chống dị ứng: Quercetin ức chế mạnh sự giải phóng histamin từ tế bào ưa

base [5]

- Trong điều trị ung thư: Quercetin ngăn chặn quá trình sản xuất “mutant p53

protein” và cản trở hoạt động của enzym tyrosine kinase, do đó làm chậm sự phát triển của bướu ung thư [5]

- Điều trị bệnh gout: Quercetin ức chế hoạt động của xanthin oxidase, enzym

có vai trò xúc tác phản ứng oxy hóa xanthin thành acid uric, nên làm giảm lượng uric máu [5]

- Ngăn chặn các biến chứng của bệnh đái tháo đường: Quercetin ức chế mạnh

aldose reductase - enzym có nhiệm vụ chuyển glucose máu thành sorbitol, một hợp chất liên quan chặt chẽ với sự tiến triển các biến chứng của bệnh đái tháo đường (đục thủy tinh thể, tổn thương thần kinh, bệnh võng mạc đái tháo đường) [5]

1.1.4 Dược động học

Dược động học của thuốc [7], [26], [36], [37]:

- Hấp thu: Quercetin là dược chất kém hấp thu qua đường tiêu hóa Sinh khả

dụng đường uống của quercetin thấp và dao động từ 0 đến 50% Nồng độ quercetin trong huyết tương là 0,1 – 10µmol /lit

- Phân bố: Sau khi được hấp thu ở ruột non, quercetin được chuyển hóa lần

đầu qua gan, và sau đó được phân bố đến khắp các mô trong cơ thể Quercetin có khả năng liên kết mạnh với albumin trong huyết tương

- Chuyển hóa và thải trừ:

+ Quercetin không tồn tại ở dạng tự do trong máu, mà chủ yếu được tìm thấy dưới dạng các sản phẩm liên hợp với acid glucuronic, nhóm sulfat hoặc nhóm methyl

+ Thời gian bán thải cùa quercetin khoảng 25 giờ Sự thanh thải hoạt chất sẽ

bị trì hoãn một cách đáng kể nếu uống thuốc sau bữa ăn giàu chất béo (p<0.05)

1.1.5 Chỉ định

Dùng để phòng và điều trị các bệnh dị ứng, ung thư (ung thư tuyến tiền liệt,

vú, dạ dày, ruột kết), tim mạch, bệnh gout, các biến chứng của bệnh đái tháo đường [4]

1.1.6 Tương tác thuốc

- Chống chỉ định dùng kèm quercetin với kháng sinh nhóm quinolon vì quercetin cạnh tranh với quinolon để gắn vào DNA gyrase của vi khuẩn Do đó, theo lý thuyết quercetin làm giảm hoạt tính kháng sinh của quinolon [17]

- Quercetin ức chế enzym CYP2C8 nên làm giảm khả năng chuyển hóa ở gan của paclitaxel Vì vậy, nồng độ paclitaxel trong huyết tương tăng, dẫn đến sinh khả dụng của Paclitaxel tăng thất thường, kết quả làm tăng tác dụng phụ của hoạt chất [10]

1.1.7 Một số chế phẩm chứa quercetin lưu hành trên thị trường

Bảng 1.1 Một số chế phẩm chứa quercetin lưu hành trên thị trường

phytosome và ứng dụng dạng phytosome này vào viên nang, viên nén với hàm lượng hoạt chất thấp hơn 250mg Nhưng ở Việt Nam, dạng bào chế này vẫn còn khá mới mẻ, hầu như chưa có nhiều nghiên cứu chuyên sâu Vì vậy, với mục tiêu phát triển công nghệ bào chế thuốc dựa trên các hoạt chất nguồn gốc dược liệu thay thế dần các hoạt chất tổng hợp hóa dược, từ đó làm tiền đề để tận dụng được nguồn dược liệu phong phú của nước nhà, chúng tôi đã quyết định tiến hành đề tài nghiên cứu bào chế phytosome quercetin

1.2 Đại cương về phytosome

1.2.1 Khái niệm phytosome

Phytosome là phức hợp của hoạt chất có nguồn gốc thiên nhiên gắn với phospholipid ở mức độ phân tử [15], [34]

Hình 1.2 Cấu tạo của phytosome

1.2.2 Thành phần của phytosome

- Cấu tạo của phytosome gồm 2 thành phần: hoạt chất dược liệu ít tan trong nước và phospholipid Trong phức hợp, các nhóm phân cực của dược chất tương tác với nhóm phosphat của phospholipid thông qua liên kết hydro, hình thành sự sắp xếp không gian đặc trưng có thể được chứng minh bằng các loại phổ [9]

 Phospholipid

- Phân loại phospholipid:

+Phospholipid tự nhiên: Hay dùng nhất là phosphatidylcholin (PC) từ lecithin

của trứng hoặc đậu tương, ngoài ra còn có phosphatidylethanolamin (PE), phosphatidylserin (PS), phosphatidylglycerol (PG),…

+ Phospholipid tổng hợp: Phosphatidylcholin đậu nành được hydrogen hóa

(HSPC), disteroyl phosphatidylcholin (DSPC), dioleyl phosphatidylcholin (DOPC), dioleyl phosphatidylethanolamin (DOPE),…

+ Một số lipid khác như sphingolipid (sphingomyelin, sphingosin,…)

- Vai trò của phospholipid trong phytosome: Phospholipid là phân tử lưỡng

cực, trộn lẫn được trong môi trường thân nước và môi trường thân dầu, do đó nếu được sử dụng như là chất mang hoạt chất sẽ giúp cải thiện độ tan và độ hòa tan của hoạt chất, từ đó tăng khả năng hấp thu dược chất qua đường tiêu hóa Ngoài vai trò

là một chất mang thuốc, phosphatidylcholin là thành phần quan trọng của màng tế bào, là phân tử gốc để xây dựng nên các lipoprotein và màng tế bào, ngoài ra nó cũng là nguồn cung cấp cholin thiết yếu cho các tế bào trong cơ thể Đồng thời, phospholipid còn làm giảm sức căng bề mặt của hệ phân tán với dịch tiêu hóa, bằng cách đó phytosome dễ dàng được vận chuyển vào màng, mô, thành tế bào trong cơ thể [8], [27], [30]

- Trong khuôn khổ khóa luận này, chúng tôi sử dụng HSPC để tiến hành nghiên cứu HSPC có ưu điểm là độ tinh khiết cao, và bền về mặt hóa học hơn các phosphatidylcholin khác, do hạn chế quá trình peroxyd hóa các gốc acid béo chưa

no, từ đó giúp màng lipid bền vững hơn, hạn chế được quá trình rò rỉ dược chất vào môi trường bên ngoài

 Dược chất

- Hoạt chất được gắn vào đầu phân cực của phospholipid, trở thành bộ phận cấu tạo của màng, và có sự hình thành các liên kết hydro giữa hydroxyl phenol của hoạt chất và ion phosphat trên nhánh phospholipid cho từng phân tử hoạt chất

1.2.3 Tính chất của phytosome

Phytosome có các tính chất sau [11], [16], [21], [25]:

- Phytosome là một phức hợp được hình thành từ 2 thành phần là hoạt chất nhóm polyphenol có nguồn gốc từ dược liệu và phospholipid với một tỷ lệ phối hợp nhất định trong một dung môi thích hợp Từ dữ liệu của các phổ chứng minh có sự hình thành liên hydro giữa đầu phân cực (nhóm phosphat và nhóm amoinium) của

phospholipid với nhóm phân cực của hoạt chất, chính các liên kết này sẽ giúp

phytosome có độ ổn định cao hơn các dạng bào chế khác

- Từ dữ liệu 1HNMR và 13CNMR có thể nhận thấy chuỗi acid béo cho tín hiệu không thay đổi trong cả phospholipid dạng tự do và phospholipid trong phức hợp phytosome Kết quả này chứng minh hai chuỗi béo dài không tham gia liên kết mà chỉ đóng vai trò là bao quanh, tạo thành lớp vỏ thân dầu, che chắn cho đầu phân cực của phospholipid và phân tử flavonoid, từ đó làm tăng độ tan của phức hợp trong

dung môi ít phân cực

- Kích thước của phytosome dao động từ 50nm đến vài trăm μm

- Khi tiếp xúc với nước, phytosome có dạng micell tương tự cấu trúc của liposome Tuy nhiên, trong liposome, hoạt chất được hòa tan trong một cái túi hoặc nổi trên lớp màng; nhưng với phytosome hoạt chất liên kết với đầu phân cực của

phospholipid bằng liên kết hóa học, trở thành một phần không thể thiếu của màng

- Phytosome thường có sinh khả dụng cao hơn các dạng bào chế truyền thống Điều này đã được chứng minh bằng các nghiên cứu dược động học và dược lực học

trên động vật và người

- Tính chất của phytosome được quyết định bởi các yếu tố: kích thước tiểu phân, khả năng thấm qua màng, tỷ lệ % chất tan hấp phụ, thành phần hóa học cũng

như số lượng và độ tinh khiết của nguyên liệu ban đầu

1.2.4 Ưu, nhược điểm của phytosome

 Ưu điểm

Phytosome có các ưu điểm sau [11], [14], [29] :

- Phytosome dễ tan trong cả dung môi thân dầu và thân nước nên khi các phân tử này đi vào đường ruột, nó có thể dễ dàng chuyển từ môi trường thân nước của đường ruột sang môi trường thân dầu của màng tế bào ruột từ đó đi vào trong tế bào Kết quả, làm tăng khả năng hấp thu dược chất, tăng hiệu quả điều trị và giảm được liều dùng thuốc

- Phytosome cải thiện được độ tan của dược chất trong muối mật nên có thể tăng hiệu quả điều trị của thuốc tại gan Phosphatidylcholin không chỉ đóng vai trò

như là một chất mang dược chất, nó còn có tác dụng bảo vệ gan và mang lại giá trị dinh dưỡng

- Phytosome được tạo thành từ hoạt chất dược liệu và phospholipid Phospholipid có độc tính thấp, tương hợp sinh học tốt và có khả năng phân hủy sinh học Hoạt chất dược liệu ít tác dụng phụ hơn so với các hoạt chất tổng hợp hóa học

Do đó, có thể thấy thành phần của phytosome tương đối an toàn

- Khác với liposome, phytosome được tạo thành từ liên kết hóa học giữa hoạt chất và phosphatidylcholin Vì vậy, phytosome có độ ổn định cao hơn các dạng bào chế khác

- Phytosome có khả năng bảo vệ các hoạt chất sinh học chống lại sự phân hủy của enzym cũng như của vi khuẩn đường ruột Do hoạt chất được bao bọc bởi các phân tử phospholipid nên không bị ảnh hưởng bởi các tác nhân bên ngoài trong quá trình bảo quản và những tác nhân bên trong cơ thể trong quá trình sử dụng Hoạt chất chỉ phát huy tác dụng khi giải phóng khỏi tiểu phân tại đích sinh học

- Hướng các hoạt chất đến mô đích hiệu quả hơn

- Quy trình bào chế phytosome tương đối đơn giản

- Phytosome được sử dụng khá phổ biến trong lĩnh vực mỹ phẩm do tăng tính thấm của dược chất qua da, bên cạnh đó đặc tính thân dầu của phytosome giúp hoạt chất dễ dàng vượt qua lớp màng sinh học giàu lipid

 Nhược điểm

Mặc dù có rất nhiều ưu điểm như trên nhưng hiện phytosome vẫn chưa được

sử dụng rộng rãi vì một số nhược điểm sau [22], [33]:

- Hầu hết các phương pháp bào chế phytosome đều sử dụng các dung môi hữu cơ độc hại như: dichloromethan, methanol… để hòa tan lipid gây ảnh hưởng đến sức khỏe con người và môi trường Bào chế phytosome bằng phương pháp siêu tới hạn có thể khắc phục được nhược điểm này, nhưng đòi hỏi kỹ thuật phức tạp và yêu cầu áp suất cao

1.2.5 Phương pháp bào chế phytosome

Hiện nay có 3 phương pháp bào chế phytosome bao gồm:

- Phương pháp bốc hơi dung môi

- Phương pháp kết tủa trong dung môi

- Phương pháp siêu tới hạn

Trong khuôn khổ khóa luận này, chúng tôi lựa chọn phương pháp: “Bào chế phytosome quercetin bằng phương pháp kết tủa trong dung môi” Phương pháp này được sử dụng khá phổ biến trong các nghiên cứu bào chế phytosome

Tiến hành: Phối hợp phospholipid (tổng hợp hoặc tự nhiên) và hoạt chất

polyphenol có nguồn gốc từ dược liệu với tỷ lệ phosphoipid : DC dao động từ 2,0 trong môi trường phản ứng là dung môi aprotic như: dioxan, methylen chlorid, aceton…Khuấy từ hồi lưu trong một thời gian thích hợp Sau khi tạo thành phytosome, tiến hành phân lập phức hợp bào chế được bằng cách kết tủa trong dung môi không phân cực như hydrocarbon béo, n-hexan hoặc áp dụng phương pháp phun sấy [38]

0,5-Hình 1.3 Phương pháp bào chế phytosome bằng phương pháp kết tủa trong dung môi

Lưu ý: Tùy thuộc vào bản chất của hoạt chất và phospholipid sử dụng mà tỷ lệ dược chất : phospholipid khác nhau giữa các nghiên cứu Tuy nhiên, trong hầu hết các nghiên cứu, tỷ lệ tối ưu giữa hai thành phần này là 1:1 Dung môi kết tủa thường được chọn là n-hexan [23]

1.2.6 Phương pháp đánh giá tương tác giữa dược chất và phospholipid trong

phytosome

Trong các nghiên cứu về phytosome, đa phần các tác giả đều sử dụng các phương pháp như: phổ hồng ngoại (IR), phân tích nhiệt vi sai (DSC), phân tích phổ nhiễu xạ tia X để chứng minh khả năng tạo phức giữa dược chất và phospholipid [12], [13]

1.2.6.1 Phương pháp phổ hồng ngoại (IR)

Nguyên lý của phương pháp: Trong phân tử, nguyên tử ở mỗi liên kết sẽ dao động với một tần số đặc trưng, nằm trong vùng hồng ngoại Khi bị chiếu một chùm tia, liên kết đó sẽ hấp thụ bức xạ có bước sóng đúng bằng dao động giữa các nguyên

tử [6] Khi tạo thành phức hợp, đầu phân cực phân tử phospholipid (nhóm phosphat và/hoặc nhóm amoinium) liên kết với nhóm –OH của dược chất tạo sự tương tác liên phân tử, làm dịch chuyển bước sóng hấp thụ của các nhóm chức đó Dựa vào những thay đổi trên phổ hồng ngoại của mẫu phức hợp so với mẫu dược chất và phospholipid ta có thể đánh giá được tương tác giữa dược chất và phospholipd Khi nghiên cứu về phức hợp chrysophanol - phospholipid, Denvendra Singh

và cộng sự (2012) đã dùng phổ hồng ngoại (IR) để đánh giá tương tác giữa chrysophanol và phopsholipid trong phức hợp phytosome Từ hình 1.4 có thể nhận thấy mẫu phức hợp chrysophanol - phospholipid có sự dịch chuyển số sóng của nhóm –OH so với quercetin và nhóm P=O, P-O-C so với phospholipid, kết quả này

đã phần nào chứng minh được đã có sự hình thành phức hợp giữa dược chất và phospholipid [12]

Hình 1.4 Phổ hồng ngoại của phospholipid, chrysophanol và phức hợp

chrysophanol-phospholipid [12]

1.2.6.2 Phương pháp phân tích nhiệt vi sai

Nguyên lý của phương pháp: Bình thường, màng phospholipid ở trạng thái gel với sự sắp xếp trật tự của các phân tử phospholipid Khi gia nhiệt, màng

phospholipid kép chuyển từ trạng thái gel sang trạng thái tinh thể lỏng với sự sắp xếp lộn xộn của các phân tử lipid, làm ảnh hưởng tới lực liên kết Van der Waals giữa các chuỗi hydrocarbon, làm tăng sự linh động của màng lipid Khi dược chất liên kết với phospholipid làm tăng sự chặt chẽ của cấu trúc màng phospholipid kép,

do đó làm thay đổi nhiệt độ chuyển pha [4] Dựa vào những thay đổi trên giản đồ nhiệt có thể cho những thông tin về tương tác giữa dược chất và phospholipid Devendra Singh và cộng sự (2012) để chứng minh sự tạo thành phức hợp, tác giả đã sử dụng phương pháp phân tích nhiệt vi sai (DSC) cho các mẫu quercetin, phospholipid và phức hợp quercetin - phospholipid Kết quả cho thấy trên đồ thị phân tích nhiệt vi sai của phức hợp quercetin - phospholipid, các peak thu nhiệt đặc trưng của quercetin, phospholipid đã biến mất hoàn toàn Thay vào đó là xuất hiện peak thu nhiệt mới với nhiệt độ chuyển pha thấp hơn nhiệt độ chuyển pha của phospholipid nguyên liệu ban đầu Chứng tỏ có sự tương tác giữa dược chất và phospholipid làm giảm mức độ tinh thể của quercetin trong phức hợp so với

quercetin nguyên liệu [13]

Hình 1.5 Đồ thị phân tích nhiệt vi sai của phospholipid, quercetin và

phức hợp quercetin – phospholipid [13]

1.2.6.3 Phương pháp phân tích nhiễu xạ tia X

Nguyên lý của phương pháp : Sự biến mất của các peak nhiễu xạ đặc trưng của dược chất và phospholipid trên phổ nhiễu xạ tia X của phức hợp là cơ sở để chứng minh sự có sự chuyển dạng thù hình của hoạt chất trong phức hợp Từ đó khẳng định có sự tương tác giữa dược chất và phospholipid

Devendra Singh và cộng sự (2012) đã nghiên cứu phổ nhiễu xạ tia X của quercetin, phospholipid và phức hợp quercetin - phospholipid Kết quả cho thấy phổ nhiễu xạ của mẫu phức hợp quercetin - phospholipid không còn những peak nhiễu

xạ đặc trưng của quercetin và phospholid mà chỉ có một peak nhiễu xạ rộng, chứng

tỏ quercetin trong phức hợp đã chuyển từ trạng thái kết tinh sang trạng thái vô định hình [13]

Hình 1.6 Phổ nhiễu xạ tia X của phospholipid, quercetin và phức hợp

querectin – phospholipid [13]

Ngoài các phương pháp đã nêu, có thể sử dụng thêm phương pháp cộng hưởng

từ hạt nhân (NMR) để xác định chính xác nhóm chức nào tham gia vào liên kết với phospholipid, phương pháp chụp ảnh qua kính hiển vi điện tử (SEM, TEM) để đánh giá về hình thái và cấu trúc của phức hợp…

Phối hợp nhiều phương pháp đánh giá khác nhau trong việc chứng minh khả năng tạo phức giữa dược chất và phospholipid là một việc làm cần thiết, giúp chúng

ta đưa ra một kết quả đánh giá toàn diện hơn và chính xác hơn

1.3 Một số nghiên cứu về phytosome

Dạng bào chế phytosome như một cầu nối giữa hệ phân phối thuốc truyền thống và hệ phân phối thuốc hiện đại Nhiều nghiên cứu đã chứng minh công nghệ phytosome đã làm gia tăng đáng kể khả năng hấp thu và sinh khả dụng của các hoạt chất nguồn gốc dược liệu Dưới đây là một số nghiên cứu về dạng bào chế này:

1.3.1 Một số nghiên cứu về phức hợp phytosome của các hoạt chất khác

Ajay Semalty và cộng sự (2009) đã nghiên cứu bào chế phytosome narigenin bằng phương pháp kết tủa trong dung môi Quy trình bào chế được tiến hành như sau: khuấy hồi lưu narigenin và phosphatidylcholin (tỷ lệ 1:1) trong dung môi dichloromethan trong thời gian 3 giờ Sau đó cô dung dịch đến dung tích 5-10ml, thêm 30ml n-hexan để thu phức hợp dưới dạng kết tủa Tiến hành sấy kết tủa trong

tủ sấy chân không Phức hợp naringenin - phospholipid sau bào chế được đánh giá một số các thông số như kích thước tiểu phân, phân bố kích thước tiểu phân, thế zeta, độ tan bão hòa trong nước, khả năng giải phóng dược chất… Kết quả cho thấy

độ tan bão hòa trong nước của naringenin trong phức hợp so với narigenin tự do tăng từ 43,83μg/ml lên 79,31μg/ml; khả năng giải phóng dược chất của phức hợp cũng cao hơn narigenin tự do (sau 10 giờ, narigenin tự do chỉ giải phóng 27%, trong khi phức hợp giải phóng tới 99,8% dược chất) Hình ảnh chụp SEM của phytosome naringenin là những hình cầu nhỏ không đều với bề mặt thô ráp Kết quả nghiên cứu nhiễu xạ tia X (XRPD), phân tích nhiệt vi sai (DSC), phổ hồng ngoại (FTIR) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1HNMR) đều chứng minh có sự hình thành phức hợp Từ những kết quả nghiên cứu trên có thể sơ bộ kết luận phức hợp narigenin-phospholipid có thể làm tăng khả năng hấp thu dược chất từ đó làm tăng hiệu quả điều trị [20]

Malay K.D và cộng sự [24] đã tiến hành nghiên cứu bào chế rutin phytosome với tỷ lệ rutin : phospholipid lần lượt là 0,5:1; 0,75:1; 1:1; 1:0,75; 1:0,5 Tất cả các phức hợp phyto - phospholipid bào chế được đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng như: độ tan, hệ số khuếch tán, kích thước tiểu phân, hiệu quả nạp thuốc Kết quả cho thấy các phytosome bào chế đều có độ tan trong nước cao hơn rutin tinh khiết,

phytosome bào chế với tỷ lệ rutin : phospholipid 1:1 có sự cân bằng tốt hơn giữa đặc tính thân dầu và đặc tính thân nước (3,11 ± 0,08) khi so sánh với hoạt chất rutin Kết quả chụp TEM chỉ ra các phytosome có cấu trúc túi rời rạc Hình ảnh phổ hồng ngoại, biểu đồ nhiệt đã chứng minh sự hình thành phức hợp phyto - phospholipid Theo kết quả nghiên cứu nhiễu xạ tia X, rutin khi tạo phức với phopsholipid đã chuyển từ trạng thái kết tinh sang dạng vô định hình Nghiên cứu tính thấm qua da

ex-vivo cho thấy khả năng thấm hoạt chất qua da của phytosome (33 ± 1,33%) cao

hơn rutin tinh khiết (13 ± 0,87%)

1.3.2 Một số nghiên cứu về phytosome quercetin

Denvendra Singh và cộng sự (2012) đã bào chế phức hợp phytosome quercetin như sau: tiến hành khuấy hồi lưu quercetin và phospholipid (tỷ lệ 1:1) trong bình cất quay chứa 20ml dichloromethan ở nhiệt độ 45-50°C cho đến khi toàn bộ lượng dược chất phản ứng hết với phopsholipid Sau đó, giảm thể tích hỗn hợp xuống còn 2-3 ml và thêm một lượng n-hexan vừa đủ để thu được phức hợp như một sản phẩm

vô định hình Phức hợp được lọc sạch, sấy chân không và cất giữ trong bình không thấm khí cho đến khi sử dụng Phytosome quercetin bào chế sẽ được đánh giá các thông số lý hóa khác nhau như: phổ hồng ngoại (FT-IR), phân tích nhiệt vi sai (DSC), nhiễu xạ tia X (XRPD), kính hiển vi điện tử quét (SEM), độ hòa tan Các

nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa in-vitro cũng được tiến hành.Kết quả chụp SEM

cho thấy phức hợp quercetin - phospholipid cho hình ảnh mịn và xốp với bề mặt thô ráp Các dữ liệu FT-IR, DSC, XRPD đã chứng minh có sự hình thành phức hợp phospholipid Độ tan bão hòa của phức hợp so với dạng tự do cũng tăng lên 12 lần

(từ 3,44mg/ml tăng lên thành 36,81mg/ml) Tác dụng chống oxy hóa in-vitro của

phytosome quercetin có sự khác biệt không quá lớn so với quercetin tự do [28] Với mục đích tăng sinh khả dụng và độ ổn định của hoạt chất, Solmaz và cộng

sự [32] đã nghiên cứu bào chế quercetin phytosome và tiến hành đánh giá chất lượng phytosome thu được Phospholipid sử dụng trong nghiên cứu này là phosphatidylcholin (PC) và cholesterol (CH) Kết quả cho thấy phytosome bào chế với tỷ lệ quercetin:PC:CH là 1:2:0,2 có kích thước tiểu phân nhỏ (80nm) và % hiệu

quả nạp thuốc cao (98%) Nghiên cứu cũng chứng minh sự kết hợp CH và PC đã cải thiện một cách đáng kể độ ổn định vật lý của phytosome trong thời gian 3 tuần Biểu đồ nhiệt cho thấy sự kết hợp quercetin trong lớp phospholipid kép làm giảm nhiệt độ chuyển pha của cấu trúc lớp kép, do đó có thể làm tăng giải phóng dược chất và sinh khả dụng của quercetin

Với những thành công mà phytosome đem lại thì công nghệ tạo phytosome là một trong những lĩnh vực nghiên cứu đang thu hút sự quan tâm chú ý của các phòng thí nghiệm lớn trên thế giới Công nghệ hiện đại này đã và đang tạo ra một dòng sản phẩm từ dược liệu có hiệu quả điều trị cao, giảm tác dụng phụ và tăng giá trị của thuốc thảo dược Tuy nhiên, hiện nay có rất ít hoạt chất dược liệu được bào chế dưới dạng phytosome Tại Việt Nam chưa có cơ sở nào tiến hành nghiên cứu ứng dụng công nghệ này, tất cả các sản phẩm phytosome trà xanh, nghệ, bạch quả trên thị trường đều do các công ty nhập nguyên liệu phytosome đóng gói Do đó, nghiên cứu bào chế phytosome quercetin là cần thiết và có ý nghĩa nhằm góp phần thúc đẩy các nghiên cứu về các hoạt chất có nguồn gốc thiên nhiên ở Việt Nam Đây chính là

xu thế tất yếu của ngành công nghiệp dược trên thế giới, phù hợp vào nguồn tài nguyên phong phú của Việt Nam và có khả năng ứng dụng rất cao

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị, và đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu

Các nguyên liệu sử dụng, nguồn gốc và tiêu chuẩn nguyên liệu được trình bày ở bảng 2.1

Bảng 2.1 Nguyên liệu

2 Phosphatidylcholin đậu nành đã

hydrogen hóa (HSPC)

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu

- Máy khuấy từ gia nhiệt IKA RCT basic (Đức)

- Hệ thống cất quay Rovapor R – 210 (Buchi – Đức), bình cầu NS 29/32, dung tích 1000ml (Buchi – Đức)

- Hệ thống thiết bị phân tích kích thước Zetasizer nano ZS90 (Malvern – Anh)

- Hệ thống máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Aligent

- Thiết bị siêu âm Ultrasonic LC 60H

- Bể siêu âm Wise clean (Hàn Quốc)

- Máy đo phổ nhiễu xạ tia X D8 Advance, Brucker (Đức)

- Máy phân tích nhiệt vi sai Mettle Toledo AB 204S (Thụy sĩ)

- Máy quang phổ hồng ngoại FTIR Shimadzu (Nhật)

- Cân phân tích Satorius BP121S, tủ sấy, tủ lạnh, cân kĩ thuật, các dụng cụ thủy tinh

2.1.3 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu: phytosome quercetin

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Xây dựng phương pháp định lượng quercetin trong phytosome bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC)

- Khảo sát độ tan của quercetin trong một số môi trường khác nhau

- Đánh giá khả năng tạo phức giữa quercetin và phospholipid bằng các phương pháp vật lý: FTIR, XRD, DSC

- Đánh giá đặc tính của phức hợp phytosome bào chế được

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Bào chế phytosome quercetin bằng phương pháp kết tủa trong dung môi

 Cách tiến hành:

- Cân và hòa tan quercetin và phospholipid trong một lượng dung môi thích hợp (khoảng 20ml ethanol) Tiến hành khuấy từ qua đêm ở nhiệt độ thích hợp với tốc độ khuấy phù hợp (400 vòng/phút)

- Sau thời gian quy định, nhỏ từ từ n-hexan vào dung dịch cho đến khi bắt đầu xuất hiện hiện tượng kết tủa

- Tiến hành bốc hơi dung môi trong tủ sấy chân không ở nhiệt độ 45°C, áp suất -0,07 MPa

- Cạo lấy bột phytosome quercetin, tiến hành nghiền khô trong khoảng 5 phút, sau đó thêm nước cất hai lần để nghiền ướt và bổ sung thêm nước vừa đủ 40ml Khuấy từ với tốc độ khuấy 400 vòng/phút ở nhiệt độ 60°C để phân tán lại phytosome vào nước

- Hỗn dịch phytosome thô sau bào chế được làm nhỏ kích thước tiểu phân bằng một số phương pháp như phương pháp siêu âm, phương pháp đồng nhất hóa

- Sau đó, hỗn dịch phytosome quercetin được đóng trong lọ thủy tinh, đậy kín

và bảo quản ở nhiệt độ 2-80C

2.3.2 Định lượng quercetin trong phytosome bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC)

- Detector UV, bước sóng 370nm

 Pha mẫu chuẩn và mẫu thử

- Mẫu chuẩn: Cân chính xác khoảng 22,4mg quercetin dihydrat (tương đương 20mg quercetin) hòa tan trong bình định mức 100ml bằng methanol vừa đủ, thu được dung dịch gốc có nồng độ 200µg/ml Hút chính xác 1ml dung dịch gốc, pha loãng bằng methanol trong bình định mức 100ml, thu được dung dịch chuẩn có nồng độ thích hợp Lọc dung dịch qua màng 0,45µm trước khi tiêm mẫu vào hệ thống sắc kí

- Mẫu thử: Hút chính xác 1ml mẫu thử và pha loãng đến nồng độ thích hợp Lọc mẫu qua màng 0,45µm trước khi tiêm mẫu vào hệ thống sắc kí

- Hàm lượng quercetin trong chế phẩm được xác định bằng công thức:

CT = St

Sc× Cc × k

Trong đó:

CT: Nồng độ quercetin trong hỗn dịch phytosome quercetin (µg/ml)

St: diện tích peak mẫu thử (mAU.s)

Sc: diện tích peak mẫu chuẩn (mAU.s)

Cc: Nồng độ quercetin trong mẫu chuẩn (µg/ml)

k: hệ số pha loãng

2.3.3 Phương pháp xác định độ tan bão hòa của quercetin và phytosome quercetin

- Tiến hành khảo sát độ tan của quercetin và phytosome quercetin trong nước

và một số môi trường khác như methanol, ethanol…

- Cân một lượng dư quercetin (khoảng 0,1g quercetin hoặc khoảng 0,15g phức hợp) cho vào ống ly tâm dung tích 15ml, thêm 10ml môi trường và tiến hành lắc liên tục trong bể lắc điều nhiệt ở nhiệt độ 25°C

- Sau 72 giờ, đem ly tâm ở tốc độ 12000 vòng/phút trong 30 phút ở nhiệt độ 25°C để loại phần quercetin không tan trong môi trường Lấy phần dịch phía trên lọc qua màng ly tâm siêu lọc Amicon Ultra-4, 10kDa 7500 vòng trong 5 phút

- Tiến hành xác định nồng độ quercetin trong môi trường bằng phương pháp HPLC ở các điều kiện đã mô tả ở mục 2.3.2

2.3.4 Phương pháp đánh giá một số đặc tính của phytosome

2.3.4.1 Hình thức

-Đánh giá bằng cảm quan: Phytosome quercetin phải không có các tiểu phân

có kích thước lớn có thể quan sát được bằng mắt thường

2.3.4.2 Đánh giá kích thước tiểu phân và phân bố kích thước tiểu phân

-Nguyên tắc xác định KTTP: KTTP đựợc xác định bằng phương pháp tán xạ laser Chiếu 1 chùm tia laser vào hệ, ánh sáng tán xạ từ tiểu phân được hứng lên 1 màn chắn Phân tích sự dao động của cường độ ánh sáng tán xạ ta có thể đánh giá được chuyển động Brown và đánh giá kích thước hạt nhờ phương trình Stocks -Einstein

-Tiến hành: Pha loãng hỗn dịch phytosome 100 lần với nước cất 2 lần đã lọc qua màng lọc cellulose acetat 0,2 μm, tiến hành đo KTTP và chỉ số đa phân tán bằng hệ thống thiết bị Zetasizer ZS 90

2.3.4.3 Đánh giá thế zeta

-Nguyên tắc xác định thế zeta: Khi đặt 1 điện trường lên hệ, tiểu phân sẽ di chuyển về phía điện cực trái dấu với vận tốc tỉ lệ với thế zeta Tốc độ này được xác định dựa vào việc phân tích chuyển động của tiểu phân thông qua ánh sáng tán xạ

Thế zeta được xác định dựa vào độ nhớt môi trường và định luật Smoluchowski Huckel

Tiến hành: Tương tự như phương pháp xác định kích thước tiểu phân

2.3.4.4 Đánh giá hiệu suất phytosome hóa

 Định lượng quercetin toàn phần:

- Hút chính xác 1 ml phytosome quercetin, hòa tan phức hợp bằng methanol trong bình định mức 10 ml, bổ sung methanol vừa đủ đến vạch Hút chính xác 1 ml dung dịch trên, pha loãng 10 lần bằng methanol Sau đó lọc qua màng lọc 0,45μm rồi tiến hành định lượng bằng phương pháp HPLC thu được diện tích peak là S1

 Định lượng quercetin gắn với phospholipid trong phytosome:

- Để định lượng quercetin gắn với phospholipid trong phytosome ta cần phải loại bỏ quercetin ở dạng tự do bằng cách ly tâm hỗn dịch phytosome với vận tốc

5000 vòng/phút trong thời gian 10 phút, ở nhiệt độ 25°C Gạn lấy phần dịch trong

và tiến hành pha loãng như trên Sau đó lọc qua màng lọc 0,45μm, rồi định lượng bằng phương pháp HPLC thu được diện tích peak là S2

 Hiệu suất phytosome hóa được xác định bằng công thức:

𝑆1 x 100%

2.3.5 Phương pháp đánh giá khả năng tạo phức quercetin - phospholipid

2.3.5.1 Phổ nhiễu xạ tia X ( X Ray diffraction-XRD)

- Cách tiến hành: Lấy 5-10mg mẫu đã làm khô, cho vào đĩa đồng của thiết bị

chiếu tia Quét mẫu từ góc 5º-50º với tốc độ quay góc θ = 1º/phút, nhiệt độ 25oC

- Nghiên cứu phổ nhiễu xạ tia X của nguyên liệu quercetin, HSPC, và phức hợp quercetin-HSPC

2.3.5.2 Kỹ thuật phân tích nhiệt vi sai (DSC)

- Cách tiến hành: Lấy 2-5mg mẫu đã làm khô, đặt trong đĩa nhôm, hàn kín, đưa vào buồng máy Tiến hành quét nhiệt từ nhiệt độ phòng đến 200°C, tốc độ gia nhiệt 5°C/phút, lưu lượng nitơ 50ml/phút

- Tiến hành phân tích đối với các mẫu: HSPC, quercetin và phytosome quercetin