Tóm tắt luận án: Nghiên cứu bào chế phytosome quercetin ứng dụng vào viên nang cứng.

Nghiên cứu bào chế phytosome quercetin ứng dụng vào viên nang cứng.Nghiên cứu bào chế phytosome quercetin ứng dụng vào viên nang cứng.Nghiên cứu bào chế phytosome quercetin ứng dụng vào viên nang cứng.Nghiên cứu bào chế phytosome quercetin ứng dụng vào viên nang cứng.Nghiên cứu bào chế phytosome quercetin ứng dụng vào viên nang cứng.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI Nguyễn Hồng Trang NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ PHYTOSOME QUERCETIN ỨNG DỤNG VÀO VIÊN NANG CỨNG Chuyên ngành: Công nghệ dược phẩm bào chế thuốc Mã số 62720402 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC Hà Nội, năm 2020 Cơng trình hồn thành tại: Trường Đại học Dược Hà Nội Trường Đại học Y Dược Huế Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Vũ Thị Thu Giang GS.TS Phạm Thị Minh Huệ Phản biện 1:……………………………………………… ……………………………………………… Phản biện 2:……………………………………………… ……………………………………………… Phản biện 3:……………………………………………… ……………………………………………… Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Trường họp tại: ……………………………………… Vào hồi……… …… ngày …… tháng …… năm…… Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện Quốc gia Việt Nam Thư viện Trường Đại học Dược Hà Nội DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI LUẬN ÁN Nguyễn Hồng Trang, Vũ Thị Thu Hà, Vũ Thị Thu Giang, Phạm Thị Minh Huệ (2016), “Nghiên cứu bào chế phytosome quercetin phương pháp kết tủa dung môi”, Tạp chí Dược học, 448, tr 13-17 Nguyễn Hồng Trang, Trịnh Viết Đạt, Vũ Thị Thu Giang, Phạm Thị Minh Huệ (2018), “Nghiên cứu quy trình bào chế đánh giá phytosome quercetin”, Tạp chí Nghiên cứu dược & Thông tin thuốc, 9, 6, tr 19-26 A-GIỚI THIỆU LUẬN ÁN 1.Tính cấp thiết luận án Quercetin flavonoid tự nhiên chứng minh có nhiều tác dụng sinh học khác chống viêm, chống oxy hóa Tuy nhiên, đặc tính bất lợi khơng tan nước, bị chuyển hóa, thải trừ nhanh dùng đường uống, hạn chế khả ứng dụng quercetin lâm sàng Trong năm gần đây, bào chế hoạt chất dạng tạo phức hợp với phospholipid (phytosome) xem hướng nghiên cứu bào chế đại, có hiệu việc nâng cao sinh khả dụng đường uống quercetin Trong phytosome, hoạt chất liên kết với phospholipid (PL) thông thường phosphatidyl cholin (PC) tạo thành cấu trúc tiểu phân hình cầu có tính chất lưỡng tính, qua vừa cải thiện độ tan hoạt chất dịch ruột vừa tăng vận chuyển hoạt chất qua lớp màng lipid kép Mặt khác, phytosome hấp thu theo chế chủ động nhờ tế bào M ruột non vào tuần hồn chung qua hệ lympho, qua giảm chuyển hóa bước qua gan tăng sinh khả dụng quercetin [78] Hoạt chất sau bào chế dạng phytosome dễ dàng ứng dụng vào dạng viên với quy trình bào chế đơn giản, khơng địi hỏi công nghệ cao thiết bị đặc biệt Tại Việt Nam, chế phẩm chứa hoạt chất bào chế dạng phytosome bắt đầu đưa vào nghiên cứu sản xuất, phytosome chủ yếu nhập từ nước ngồi với giá thành cao Do đó, việc tiến hành nghiên cứu bào chế phytosome cần thiết, góp phần phát triển cơng nghệ phytosome bào chế thuốc Xuất phát từ thực tiễn trên, đề tài “Nghiên cứu bào chế phytosome quercetin ứng dụng vào viên nang cứng” thực Mục tiêu luận án Xây dựng cơng thức quy trình bào chế phytosome quercetin Bước đầu đánh giá tác dụng chống oxy hoá in vitro tác dụng bảo vệ gan in vivo phytosome quercetin Xây dựng cơng thức quy trình bào chế viên nang cứng chứa phytosome quercetin Những đóng góp luận án - Lần Việt Nam, phytosome quercetin nghiên cứu hoàn thiện từ xây dựng cơng thức, quy trình bào chế đến xây dựng tiêu chuẩn chất lượng nghiên cứu độ ổn định Phytosome quercetin bào chế có tỷ lệ hoạt chất phytosome hóa 90 %, tiểu phân thu có kích thước từ 450 - 500 nm, phân bố kích thước đồng với giá trị PDI < 0,4, ổn định 06 tháng theo dõi điều kiện thực lão hóa cấp tốc - Ứng dụng thành công phytosome quercetin bào chế vào dạng thuốc nang cứng với hàm lượng hoạt chất 50 mg Viên bào chế có độ hồ tan > 96 % sau 45 phút ổn định thời gian nghiên cứu (06 tháng điều kiện lão hóa cấp tốc 12 tháng điều kiện thực) - Đã chứng minh tác dụng bảo vệ gan phytosome quercetin viên nang chứa phytosome quercetin mơ hình chuột bị gây độc carbon tetraclorid so với quercetin tự Bố cục luận án Luận án gồm chương, 66 bảng, 35 hình, 152 tài liệu tham khảo với 16 tài liệu tiếng Việt 136 tài liệu tiếng Anh, phụ lục Luận án có 150 trang gồm phần chính: Đặt vấn đề (2 trang); Chương Tổng quan (28 trang); Chương Đối tượng, nội dung phương pháp nghiên cứu (24 trang); Chương Kết nghiên cứu (67 trang); Chương Bàn luận (28 trang); Kết luận kiến nghị (1 trang) B.N ỘI DUNG LUẬN ÁN CHƯƠNG TỔNG QUAN Đã trình bày tập hợp có hệ thống nội dung liên quan đến luận án, bao gồm: - Về hoạt chất: Nguồn gốc, cơng thức hóa học, tính chất lý hóa độ ổn định quercetin; tác dụng dược lý, dược động học, định, liều dùng, tương tác thuốc Những nội dung trình bày giúp lý giải nguyên nhân dẫn đến sinh khả dụng đường uống quercetin thấp Đã tổng hợp cơng trình nghiên cứu giới đề cập đến hệ mang thuốc có khả cải thiện sinh khả dụng đường uống quercetin - Phytosome: Khái niệm thành phần cấu tạo phytosome; phân biệt phytosome với liposome; ưu nhược điểm; kỹ thuật bào chế phương pháp đánh giá số đặc tính lý hóa phytosome; ứng dụng phytosome lĩnh vực dược phẩm Từ đó, có định hướng cho nghiên cứu luận án - Một số mơ hình đánh giá tác dụng bảo vệ gan in-vivo: Tổng quan mơ hình nghiên cứu nước giới đánh giá tác dụng bảo vệ gan in-vivo, cách bố trí thí nghiệm thơng số đánh giá CHƯƠNG NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu thiết bị nghiên cứu 2.1.1 Nguyên liệu - Chất chuẩn: Viện Kiểm nghiệm thuốc Tp Hồ Chí Minh - Nguyên liệu: Quercetin dihydrat đạt tiêu chuẩn nhà sản xuất Phosphatydin cholin đậu nành hydrogen hóa (HSPC) cholesterol hãng Lipoid - Đức Nguyên liệu, hóa chất khác đạt tiêu chuẩn dược điển tiêu chuẩn nhà sản xuất (tùy theo mục đích sử dụng) 2.1.2 Thiết bị nghiên cứu Hệ thống cất quay Rovapor R - 210 (Buchi) Hệ thống máy sắc ký lỏng hiệu cao HPLC Aligent 1260 Hệ thống thiết bị Zetasizer NanoZS90 (Malvern) Kính hiển vi điện tử quét FESEM Hitachi S-4800 Máy phân tích nhiệt vi sai Mettler Toledo AB 204S Máy thử độ hòa tan Erweka DT700 Các trang thiết bị, dụng cụ khác phịng thí nghiệm trường Đại học Dược Hà Nội trường Đại học Y Dược Huế 2.1.3 Động vật thí nghiệm Chuột chủng dòng BALB/c khoảng - tuần tuổi có khối lượng khoảng 20 - 35 g, khoẻ mạnh, khơng phân biệt giống, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm Viện Công nghệ sinh học cung cấp 2.1.4 Địa điểm thực nghiên cứu Bộ môn Bào chế - Trường Đại học Dược Hà Nội; trường Đại học Y Dược Huế; viện Hóa học; viện vệ sinh dịch tễ TW viện Công nghệ sinh học 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp bào chế phytosome quercetin 2.2.1.1 Bào chế phytosome theo phương pháp bốc dung môi Cân 3,56 g quercetin, PL với tỷ lệ hoạt chất : PL (mol:mol) từ 1:0,5 đến 1:1,5, tá dược khác (nếu cần), hòa tan 20 ml ethanol tuyệt đối Đưa vào bình cầu dung tích 1000 ml hệ thống cất quay Cất quay với tốc độ (50, 100 150 vòng/phút) nhiệt độ từ 60 đến 80oC Kết thúc thời gian phản ứng (khảo sát), hút chân không, điều chỉnh áp suất giảm để dung môi bay từ từ Sau 15 phút hút chân không, dung môi bay hết màng phim hình thành giảm tốc độ quay xuống 100 vịng/phút Tiếp tục cất quay 16 để đảm bảo loại hết hồn tồn dung mơi hữu Phytosome sau tạo thành hydrat hóa trực tiếp bình cất quay tạo hỗn dịch phytosome thô Điều kiện hydrat hóa: 40 ml nước cất, nhiệt độ 60oC, tốc độ quay 100 vịng/phút, thời gian Hỗn dịch thơ làm giảm kích thước phương pháp siêu âm liên tục thời gian phút với tần số 50 Hz, công suất 60 W, nhiệt độ 50 - 60oC Để thu phytosome quercetin dạng bột có hàm ẩm không %, tiến hành sấy tủ sấy chân không nhiệt độ 40oC thời gian 24 2.2.1.2 Bào chế phytosome theo phương pháp kết tủa dung môi Cân 3,56 g quercetin, PL với tỷ lệ hoạt chất : PL (mol:mol) từ 1:0,5 đến 1:1,5, tá dược khác (nếu cần), hòa tan 20 ml ethanol tuyệt đối Tiến hành khuấy từ điều kiện nhiệt độ từ 60 đến 80oC với tốc độ 400 vòng/phút Kết thúc thời gian phản ứng (khảo sát), nhỏ từ từ n-hexan vào hỗn hợp phản ứng kết hợp khuấy trộn nhiệt độ phịng Do thay đổi dung mơi, phytosome kết tủa lại tạo hỗn dịch phytosome thô Nhằm đảm bảo loại hết dung môi hữu cơ, tiến hành ly tâm tốc độ 6000 vịng/phút phút, sau sấy tủ sấy chân không nhiệt độ 45oC, áp suất 0,07 mmHg Bột phytosome quercetin lấy ra, thêm nước cất để nghiền ướt bổ sung thêm nước vừa đủ 40 ml Khuấy từ với tốc độ 400 vòng/phút nhiệt độ 60oC để phân tán lại phytosome vào nước Hỗn dịch + Quercetin, HSPC, cholesterol (tỷ lệ 1:1:0,2) Hịa tan lít ethanol + Nhiệt độ: 80oC + Tốc độ quay: 50 v/ph + Thời gian: + Áp suất thường + Nhiệt độ: 40oC + Thời gian: + Áp suất: 100 mbar Tạo phytosome quercetin Bốc dung môi + Nhiệt độ: 40oC + Thời gian: 24 Sấy khô phytosome + Áp suất: - 0,07 mmHg Rây bột phytosome + Rây 250 Túi nhơm Đóng gói,+ bảo quản kín Hình 3.13 Sơ đồ quy trình bào chế phytosome quercetin quy mơ 500 g/mẻ 3.2.2.2 Đánh giá số đặc tính phytosome quercetin bào chế quy mô 500 g/mẻ Tiến hành đánh giá số tiêu chất lượng lô phytosome bào chế: Bảng 3.29 Một số đặc tính hỗn dịch phytosome quercetin (n = 3) Lơ KTTP (nm) 470,6 ± 4,1 465,5 ± 3,2 464,5 ± 2,3 Hình ảnh chụp SEM cho thấy tiểu phân quercetin tồn dạng tinh thể hình đa giác với cạnh sắc rõ Trong khi, phytosome quercetin có dạng tiểu phân hình cầu, với KTTP trung bình khoảng 350 - 400 nm, phù hợp với kết bảng 3.29 (KTTP P 0,364 0,361 0,367 đo phương pháp phổ tán xạ ánh sáng DLS) Bảng 3.30 Độ tan Mơi trƣờng trung Mẫu bình Quercetin (µg/ml) Phytosome quercetin quercetin nguyên liệu quercetin phytoso me môi trường khác = 3) (n Nƣớc Dung dịch HCl pH 1,2 Đệm phosphat pH 4,5 Đệm phosphat pH 6,8 0,85 ± 0,12 9,21 ± 0,51 0,44 ± 0,09 4,26 ± 0,29 1,48 ± 0,19 9,33 ± 0,36 1,91 ± 0,15 10,38 ± 0,44 Bảng 3.31 Hệ số phân bố log D quercetin phytosome quercetin (n=3) Mẫu Quercetin Phytosome quercetin pH pha nước 1,2 4,5 6,8 1,2 4,5 6,8 Log D 3,80 ± 0,42 3,32 ± 0,38 3,21 ± 0,57 3,02 ± 0,22 2,64 ± 0,15 2,59 ± 0,44 Theo kết bảng 3.30 bảng 3.31, nhận thấy quercetin dạng phytosome có độ tan nước (ở pH khác nhau) cao đạt cân dầu – nước tốt Thông qua kết đánh giá khả giải phóng hoạt chất từ phytosome quercetin bào chế nhận thấy so với quercetin dihydrat, lượng hoạt chất hòa tan từ phytosome nhiều với tốc độ giải phóng nhanh Kết phù hợp với kết đánh giá độ tan log D Nhằm xác định tương tác quercetin với PL phytosome, nghiên cứu tiến hành quét phổ Xray, DSC, IR, NMR MS Dựa phân tích hình ảnh phổ chứng minh có hình thành phytosome, nhóm P-O-C, -P=O nhóm -N+(CH3)3 phân tử HSPC tương tác yếu với nhóm phenolic hoạt chất quercetin liên kết hydro tương tác ion lưỡng cực 3.2.2.3 Dự kiến tiêu chuẩn sở phytosome quercetin Dựa kết đánh giá đặc tính phytosome quercetin từ mẻ nghiên cứu, số tiêu chuẩn chất lượng phytosome quercetin đề xuất bảng 3.40 Bảng 3.40 Kết đánh giá đặc tính phytosome quercetin bào chế đề xuất Tiêu chuẩn chất lƣợng Lôtiêu chuẩn Lơ 2chất lượng Lơ Đề xuất tiêu chuẩn Tính chất bột phytosome Bột khô, mịn, màu vàng nhạt q 500 nm 470,6 465,5 464,5 Khơng Kích thước tiểu phân (nm) hóa quercetin trước hydrat ± 4,1 ± 3,2 ± 2,3 (n = 3) Tính chất bột phytosome dịch đồng nhất, lắng cặn 0,400 0,364 Hỗn 0,361 0,367khơng Khơng Hệ số đa phân tánhydrat PDI hóa quercetin sau ± 0,044 ± 0,051 ± 0,013 (n = khối 3) lượng làm khô Mất 2,29 2,82 2,65 Khơng q 9,00% (kl/kl) Sắc ký đồ có pic với thời (%) (n = 3) ± 0,11 ± 0,09 ± 0,13gian lưu trùng với thời gian Định tính lưu pic quercetin chuẩn Hàm lượng quercetin toàn phần phytosome (%) (n = 3) Tỷ lệ quercetin phytosome hóa (%) (n = 3) Độ tan nước (µg/ml) (n = 3) 27,75 ± 0,51 97,03 ± 0,92 9,21 ± 0,51 26,81 ± 0,73 96,84 ± 0,75 8,95 ± 0,32 26,62 ± 0,55 95,94 ± 0,68 9,25 ± 0,16 Từ 25 % đến 29 % Khơng 90 % so với quercetin ban đầu Trên µg/ml 3.2.3 Theo dõi độ ổn định phytosome quercetin Sau tháng bảo quản điều kiện thực điều kiện lão hóa cấp tốc, bột phytosome giữ đặc tính ban đầu: Khơ, tơi, mịn, màu vàng nhạt KTTP PDI mẫu nằm giới hạn cho phép (KTTP < 500,0 nm PDI < 0,4) Hàm lượng quercetin phytosome tỷ lệ quercetin phytosome hóa giảm khơng đáng kể (dưới % so với giá trị ban đầu) Trong đó, hàm ẩm có xu hướng tăng, đặc biệt điều kiện lão hóa cấp tốc (sau tháng, hàm ẩm 8,02 % so với ban đầu 2,29 %) Như vậy, thấy khó khăn ứng dụng phytosome vào dạng rắn dùng đường uống trì hàm ẩm bột phytosome Độ hòa tan bột phytosome sau tháng bảo quản hai điều kiện nghiên cứu không thay đổi đáng kể so với ban đầu (p > 0,05) Từ số liệu thu được, thấy bột phytosome quercetin bào chế ổn định tháng theo dõi điều kiện thực lão hóa cấp tốc 3.3 Đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro phytosome quercetin thơng qua khả trung hịa gốc tự DPPH Bảng 3.43 Khả trung hòa gốc tự DPPH mẫu (n = 3) Nồng độ (µg/ml) 200 100 50 25 12,5 6,25 3,125 IC50 (µg/ml) Phần trăm trung hịa gốc tự DPPH (%) Quercetin dihydrat Phytosome quercetin Acid ascorbic 76,79 ± 1,08 76,74 ± 0,66 74,77 ± 0,55 74,53 ± 0,93 84,43 ± 1,43 74,49 ± 0,63 74,34 ± 1,51 81,47 ± 1,22 72,19 ± 1,03 73,97 ± 1,09 78,57 ± 1,97 72,15 ± 0,48 72,42 ± 0,84 74,56 ± 1,07 65,42 ± 0,79 62,20 ± 1,15 48,54 ± 1,42 49,02 ± 0,41 49,38 ± 0,53 24,78 ± 0,71 3,22 ± 0,07 3,30 ± 0,03 5,93 ± 1,44 So sánh giá trị IC50 hai mẫu thử nhận thấy sau tạo phức với phospholipid, tác dụng chống oxy hóa in vitro quercetin rõ phép thử Nguyên nhân phytosome tăng sinh khả dụng thông qua việc cải thiện độ tan hạn chế q trình chuyển hóa quercetin thể Nhưng trình thực nghiệm, quercetin phytosome quercetin hòa tan DMSO 3.4 Đánh giá tác dụng bảo vệ gan mơ hình chuột bị gây độc carbon tetraclorid Bảng 3.45 Sự thay đổi nồng độ AST ALT huyết chuột BALB/c bị nhiễm độc CCl4 (n = 6) TT Lô Đối chứng sinh lý Đối chứng bệnh lý Lô uống silymarin: 50 mg/kgP/ngày Lô uống quercetin: 50 mg/kgP/ngày Lô uống quercetin: 100 mg/kgP/ngày Lô uống phytosome: 50 mg quercetin/kgP/ngày Lô uống phytosome: 100 mg quercetin/kgP/ngày AST (UI/L) 115,20 ± 6,56 1528,59 ± 86,53 1366,06 ± 84,31 1397,96 ± 81,60 645,75** ± 78,02 598,34** ± 74,11 323,84** ± 30,86 ALT (UI/L) 42,97 ± 3,97 553,38 ± 45,86 336,75** ± 58,69 445,07 ± 54,31 267,94** ± 39,26 230,34** ± 49,97 104,47** ± 13,32 **: p < 0,01 so với đối chứng bệnh lý; p6-7 < 0,01; p5-6 > 0,01 Từ bảng 3.45 nhận thấy phytosome quercetin hai mức liều có tác dụng bảo vệ gan tốt quercetin đối chứng tham khảo Hiệu bảo vệ gan in vivo tỷ lệ thuận với tăng liều hoạt chất Kết phù hợp với việc phytosome quercetin làm giảm hàm lượng MDA tăng hàm lượng GSH gan theo hướng mức bình thường so với chứng sinh lý Với kết nghiên cứu thu được, chứng minh việc tạo phức hợp phytosome quercetin cải thiện tác dụng bảo vệ gan in vivo quercetin 3.5 Nghiên cứu bào chế viên nang cứng chứa phytosome quercetin 3.5.1 Xây dựng công thức bào chế 3.5.1.1.Lựa chọn vỏ nang Bảng 3.50 Đánh giá số tiêu chất lượng cốm phytosome (n=3) Độ ẩm (%) 2,31 ± 0,14 Khối lượng riêng biểu kiến (dbk) (g/ml) 0,80 ± 0,06 Chỉ số Carr (%) 12,93 ± 0,72 Hàm lượng quercetin toàn phần (%) 10,09 ± 0,56 Từ kết khảo sát nhận thấy cốm phytosome trơn chảy tốt, phù hợp để tiến hành đóng nang thiết bị đóng nang thủ cơng bán tự động Dựa vào giá trị Vbk, nghiên cứu lựa chọn nang cứng HPMC số Việc đóng nang khơng ảnh hưởng đến khả giải phóng quercetin 3.5.1.2 Lựa chọn tá dược để bào chế viên nang phytosome Dựa kết khảo sát khả giải phóng quercetin từ viên nang thay đổi tỷ lệ tá dược, nghiên cứu xây dựng công thức bào chế: Phytosome quercetin (tương ứng với 50 mg quercetin) 187,41 mg; lactose 250,00 mg; natri starch glycolat 22,00 mg (rã trong:rã 1:1); Tween 80 15,00 mg; ethanol tuyệt đối 0,15 ml; Aerosil 2,50 mg talc 3,18 mg 3.5.2 Dự kiến tiêu chuẩn sở viên nang chứa phytosome quercetin Tiến hành bào chế lô viên nang theo cơng thức trình bày mục 3.5.1.2 Dựa kết đánh giá số tiêu chất lượng cốm viên nang, số tiêu chuẩn chất lượng đề xuất sau: Bảng 3.60 Kết đánh giá đặc tính viên nang chứa phytosome quercetin đề xuất tiêu chuẩn chất lượng Mẫu Tiêu chuẩn chất lƣợng Chỉ số Carr (%) (n = 3) Cốm Mất khối lượng làm khô (%) (n = 3) Hàm lượng quercetin toàn phần (%) (n = 3) Khối lượng riêng biểu kiến (g/ml) (n = 3) Hình thức Viên nang Sai số so với khối lượng trung bình (%) (n = 20) Hàm lượng quercetin so với ghi nhãn (%) (n=3) % quercetin hòa tan sau 45 phút (n = 6) Lô Lô Lô Đề xuất tiêu chuẩn 13,08 12,75 13,44 11 - 15 ± 0,43 ± 0,31 ± 0,37 2,42 2,55 2,51 ≤5 ± 0,09 ± 0,17 ± 0,15 10,13 10,03 10,20 - 11 ± 0,41 ± 0,51 ± 0,59 0,80 0,81 0,80 0,78 - 0,82 ± 0,04 ± 0,03 ± 0,05 Viên nang HPMC số 0, thân nắp màu trắng chứa hạt cốm màu vàng nhạt, đồng đều, không vón cục 1,31 1,14 0,85 100,14 ± 0,88 96,58 ± 1,47 101,24 ± 0,74 97,05 ± 1,52 100,34 ± 0,56 97,03 ± 1,56 ≤5 90 - 110 ≥ 80 3.5.3 Đánh giá tác dụng bảo vệ gan in vivo viên nang cứng chứa phytosome quercetin Bảng 3.62 Sự thay đổi nồng độ AST, ALT huyết chuột hàm lượng MDA gan chuột BALB/c bị nhiễm độc CCl4 (n = 6) STT Lô AST (UI/L) ALT (UI/L) Chứng bệnh lý Nang quercetin Nang phytosome 1529,33 ± 116,16 1446,82 ± 111,02 682,12**± 68,59 533,93 ± 42,46 407,42 ± 39,46 256,33** ± 18,87 MDA (nM/ml dịch đồng thể gan) 3,09 ± 0,28 3,08 ± 0,25 2,25* ± 0,32 Với kết nghiên cứu bảng 3.62, bước đầu chứng minh viên nang chứa phytosome quercetin có tác dụng bảo vệ gan in vivo So sánh kết bảng 3.45 bảng 3.62 nhận thấy quy trình bào chế viên khơng ảnh hưởng tới chất lượng phytosome quercetin bào chế 3.6 Theo dõi độ ổn định viên nang chứa phytosome quercetin Sau 12 tháng bảo quản điều kiện thực 06 tháng điều kiện lão hóa cấp tốc, mẫu viên nang phytosome quercetin đạt tiêu hình thức độ đồng khối lượng Hàm lượng quercetin viên nang giảm nằm giới hạn cho phép (90 - 110 %) Độ hòa tan viên nang khơng có thay đổi đáng kể mức độ tốc độ hòa tan quercetin thời điểm khảo sát 12 tháng Từ số liệu thu được, thấy viên bào chế ổn định thời gian nghiên cứu Tuy nhiên, để đưa kết luận hạn dùng thực chế phẩm, cần có nghiên cứu dõi độ ổn định điều kiện thực thời gian dài CHƯƠNG BÀN LUẬN 4.1 Về xây dựng công thức quy trình bào chế phytosome quercetin 4.1.1 Về phương pháp bào chế Có nhiều phương pháp bào chế phytosome khác phụ thuộc vào việc tách phytosome sau trình tạo phức Trong nghiên cứu này, phương pháp bốc dung mơi lựa chọn có nhiều ưu điểm, phù hợp ứng dụng vào dạng viên: Quy trình bào chế đơn giản, khơng u cầu trang thiết bị phức tạp, triển khai qui mô bào chế khác nhau, dung môi thân thiện với môi trường dễ dàng thu hồi để tái sử dụng Phytosome bào chế dạng rắn, có hiệu suất phytosome hóa độ tan nước cao 4.1.2 Về công thức bào chế - Dung môi: Nhằm tăng khả ứng dụng phytosome đồng thời đảm bảo độ tan hoạt chất PL ethanol lựa chọn phù hợp Bên cạnh đó, so với methanol, ethanol có số điện mơi thấp nên hạn chế trao đổi proton dung môi phospholipid - Phospholipid: Độ ổn định phytosome yêu cầu quan trọng ứng dụng vào dạng bào chế Do vậy, HSPC chọn kết hợp với cholesterol Đặc tính ổn định mặt vật lý HSPC hình thành liên kết hydro cholesterol với HSPC góp phần tạo nguyên liệu phytosome quercetin ổn định, sử dụng bào chế thuốc nang - Tùy theo độ tinh khiết nguyên liệu tỷ lệ phosphatidyl cholin PL sử dụng mà tỷ lệ quercetin:HSPC có khác nghiên cứu Theo kết bảng 3.21, luận án lựa chọn tỷ lệ 1:1 (mol:mol) 4.1.3 Về thông số kỹ thuật trình bào chế Hiện nay, chưa có nhiều nghiên cứu đánh giá sâu ảnh hưởng thơng số kỹ thuật q trình bào chế tới đặc tính phytosome thu Nhưng việc khảo sát lựa chọn thông số cần thiết để đảm bảo quy trình bào chế phytosome xây dựng phù hợp với quy mô thiết bị sử dụng đảm bảo tính ổn định quy trình Thực tế nghiên cứu cho thấy thông số đánh giá ảnh hưởng đến hiệu suất phytosome hóa, thời gian phản ứng yếu tố ảnh hưởng nhiều 4.1.4 Về nâng cấp quy mô bào chế Để thuận lợi tiến hành nâng quy mơ, quy trình bào chế xây dựng bỏ qua giai đoạn hydrat hóa phương pháp bốc dung môi truyền thống thực tế nghiên cứu chứng minh khơng có chênh lệch q lớn tỷ lệ quercetin phytosome hóa mẫu hydrat màng film mẫu không hydrat (94,26 % 93,07 %) Bên cạnh đó, bào chế phytosome dạng bột phù hợp ứng dụng vào dạng viên Chất lượng bột kiểm sốt chặt chẽ đồng lơ Ngồi ra, với quy trình xây dựng, dung mơi dễ dàng thu hồi để tái sử dụng Trong trình thực nghiệm, có số thay đổi thơng số quy trình để phù hợp với điều kiện thực tế 4.1.5 Về phương pháp đánh giá số đặc tính phytosome quercetin  Kích thước tiểu phân, phân bố KTTP Zeta So với nghiên cứu khác, KTTP phytosome bào chế tương đối lớn khoảng 450 - 500 nm Nguyên nhân khác kích thước việc hydrat hóa bột hydrat màng film Bên cạnh đó, định hướng vào dạng viên nên luận án không không sâu nghiên cứu phối hợp phương pháp giảm KTTP Thực tế cho thấy, với kích thước 500 nm, phytosome có khả cải thiện hoạt tính sinh học quercetin cách hiệu (bảng 3.30, bảng 3.45) Ngoài đánh giá DLS, theo SEM, kích thước phytosome khoảng 400 nm Sự khác kết hai phương pháp SEM đánh giá KTTP mẫu trạng thái khơ, cịn DLS xác định kích thước mơi trường nước nên kết bị ảnh hưởng môi trường phân tán  Độ tan hoạt chất Nghiên cứu không áp dụng phương pháp lọc để loại tiểu phân giai đoạn đầu lượng tiểu phân lớn, tiến hành lọc gây bịt kín lỗ lọc Ngồi ra, quercetin hoạt chất có màu nên sau lần lọc phải xử lý màng lọc Nhằm đảm bảo tách loại hồn tồn tiểu phân hoạt chất kích thước nano, phương pháp siêu ly tâm chọn kết hợp với phương pháp lọc qua màng Amicon Ultra - kDa  Hệ số phân bố dầu - nước Cấu trúc quercetin có năm nhóm -OH phenol, trung tâm ion hóa phụ thuộc vào pH mơi trường Vì vậy, nghiên cứu lựa chọn đánh giá hệ số phân bố log D thay cho log P  Tỷ lệ hoạt chất phytosome hóa Nhằm đảm bảo kết phản ánh mức độ hình thành phytosome khơng phụ thuộc vào q trình đồng KTTP, phương pháp dùng dung mơi hịa tan chọn lọc loại quercetin tự áp dụng Tính chọn lọc khơng hồn tồn dung mơi gây sai số cho phương pháp, làm cho hiệu suất phytosome hóa tính toán thấp so với thực tế Nhưng vấn đề khó giải triệt để, nhà nghiên cứu chưa đưa phương pháp tối ưu  Về chứng minh hình thành phytosome quercetin Do cấu trúc hoạt chất đặc tính phytosome, muốn chứng minh tạo thành phytosome cần phối hợp nhiều phương pháp vật lý khác Phổ X-Ray phổ DSC giúp theo dõi thay đổi trạng thái kết tinh mức độ kết tinh quercetin tự so với quercetin phytosome Phổ hồng ngoại có hiệu việc xác định nhóm chức phân tử quercetin liên kết với đầu phân cực phospholipid Nhưng phổ IR không xác định xác nhóm chức vị trí tham gia liên kết Vì vậy, cần phải đánh giá thêm phổ cộng hưởng từ hạt nhân 4.1.6 Về theo dõi độ ổn định bột phytosome quercetin Độ ổn định phytosome vấn đề cần quan tâm Với công thức chứa tỷ lệ lớn HSPC cholesterol, bột phytosome quercetin dễ hút ẩm thay đổi thể chất q trình bảo quản Do đó, cần đóng bột bao bì kín, khơng thấm ẩm khí bao bì thủy tinh, túi nhơm 4.2 Về đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro phytosome quercetin Đặc trưng phytosome tăng sinh khả dụng thông qua tăng khả hấp thu qua đường uống kéo dài thời gian tồn hoạt chất thể Vì vậy, nghiên cứu thử hoạt tính sinh học phytosome thường sử dụng động vật thí nghiệm Tuy nhiên, với lĩnh vực nghiên cứu mới, trước khởi động nghiên cứu in vivo, việc hiểu rõ chế chống gốc tự in vitro quercetin dạng phytosome cần thiết, tạo sở khoa học để xây dựng mô hình đánh giá in vivo phù hợp 4.3 Về đánh giá tác dụng bảo vệ gan in vivo phytosome quercetin Mơ hình in-vivo áp dụng nghiên cứu mơ hình gây tổn thương gan chuột BALB/c cách tiêm màng bụng CCl4 Về liều gây độc, nhằm giảm mức độ phơi nhiễm CCl4 với môi trường quan sát tổn thương gan mức độ vừa phải chuột không chết sau gây độc, dùng liều 0,2 ml/kg Về thông số đánh giá, số AST, ALT, MDA, GSH kết hợp với quan sát đại thể gan chuột Nghiên cứu sử dụng silymarin chứng dương silymarin chứng minh có tác dụng bảo vệ phục hồi tổn thương gan 4.4 Về bào chế viên nang cứng chứa phytosome quercetin Khi ứng dụng phytosome quercetin vào viên nang vấn đề gặp phải lượng hoạt chất tá dược sử dụng lớn, nên việc tạo hạt trước tiến hành đóng nang phù hợp việc đóng bột vào nang Hạt bào chế theo phương pháp xát hạt ướt Tuy nhiên, phytosome quercetin nhạy cảm với nhiệt ẩm (cơng thức chứa tỷ lệ HSPC cao) Chính vậy, trình bào chế phải thực điều kiện kiểm sốt độ ẩm mơi trường, nhiệt độ sấy nguyên liệu cốm phải khống chế 50oC Đồng thời, nghiên cứu lựa chọn sử dụng vỏ nang HPMC KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Đề tài hoàn thành mục tiêu đề ra, bao gồm: Xây dựng cơng thức quy trình bào chế phytosome quercetin - Đã bào chế phytosome quercetin phương pháp bốc dung môi với tỷ lệ quercetin:HSPC:cholesterol (mol/mol/mol) 1:1:0,2 - Đã xây dựng quy trình bào chế phytosome quercetin quy mô 500 g/mẻ - Đã đề xuất tiêu chuẩn sở cho phytosome quercetin bào chế - Đã đánh giá độ ổn định phytosome quercetin điều kiện thực điều kiện lão hóa cấp tốc Đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro tác dụng bảo vệ gan in vivo phytosome quercetin Xây dựng công thức quy trình bào chế viên nang cứng chứa phytosome quercetin - Đã xây dựng công thức bào chế viên nang cứng HPMC chứa phytosome quercetin 187,41 mg (tương ứng với 50 mg quercetin) Viên nang bào chế có độ hồ tan quercerin 96 % sau 45 phút - Đã đề xuất tiêu chuẩn sở cho viên nang chứa phytosome quercetin - Đã đánh giá độ ổn định viên nang chứa phytosome quercetin điều kiện thực điều kiện lão hóa cấp tốc - Đã đánh giá tác dụng bảo vệ gan in vivo viên nang phytosome quercetin so với viên nang quercetin KIẾN NGHỊ: - Mở rộng quy mô bào chế viên nang cứng chứa phytosome quercetin quy mô pilot công nghiệp ... trên, đề tài ? ?Nghiên cứu bào chế phytosome quercetin ứng dụng vào viên nang cứng” thực Mục tiêu luận án Xây dựng công thức quy trình bào chế phytosome quercetin Bước đầu đánh giá tác dụng chống... tác dụng bảo vệ phục hồi tổn thương gan 4.4 Về bào chế viên nang cứng chứa phytosome quercetin Khi ứng dụng phytosome quercetin vào viên nang vấn đề gặp phải lượng hoạt chất tá dược sử dụng. .. phytosome quercetin Xây dựng công thức quy trình bào chế viên nang cứng chứa phytosome quercetin - Đã xây dựng công thức bào chế viên nang cứng HPMC chứa phytosome quercetin 187,41 mg (tương ứng với