Nghiên cứu bào chế tạo cao chiết đông trùng hạ thảo có hàm lượng hợp chất thứ cấp cao (khóa luận tốt nghiệp)

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM O N N ỆS N Ọ -� � � - Ó LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀ : N ÊN ỨU BÀO Ế TẠO CAO CHIẾT Đ N TRÙN Ạ THẢO Ó ÀM LƢỢNG HỢP CHẤT THỨ CẤP CAO Nội -2022 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA N N ỆS N Ọ -� � � - Ó LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀ : N ÊN ỨU BÀO Ế TẠO CAO CHIẾT Đ N TRÙN Ạ THẢO Ó ÀM LƢỢNG HỢP CHẤT THỨ CẤP CAO Ngƣời thực : TRẦN THỊ DIỄM Mã sinh viên : 637115 Lớp : K63CNSHB Khoa : NG NGHỆ SINH HỌC : TS P Í T Ị CẨM MIỆN iáo viên hƣớng dẫn Nội -2022 LỜ M ĐO N Tơi xin cam đoan khóa luận thực hồn thành tìm hiểu nghiên cứu khoa học thân hướng dẫn TS Phí Thị Cẩm Miện, khoa Cơng nghệ Sinh học - Học viện Nông nghiệp Việt Nam Tất số liệu, hình ảnh, kết trình bày khóa luận hồn tồn trung thực, khơng chép tài liệu, cơng trình nghiên cứu người khác Các thơng tin trích đẫn, tham khảo khóa luận ghi rõ nguồn gốc Tôi xin chịu trách nhiệm lời cam đoan trước Hội đồng chấm khóa luận tốt nghiệp Học viện Hà Nội, ngày 28 tháng năm 2022 Sinh viên Trần Thị Diễm i LỜ ẢM ƠN Trước hết tơi xin gửi lời cảm ơn đến tồn thầy cô công tác Học viện Nông nghiệp Việt Nam, đặc biệt thầy cô khoa Công nghệ sinh học ln tận tình bảo truyền đạt kiến thức quý giá cho năm học tập rèn luyện trường Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Phí Thị Cẩm Miện tận tình giúp đỡ, hướng dẫn, quan tâm tạo điều kiện cho suốt q trình học tập thực khóa luận tốt nghiệp Tôi xin trân trọng cảm ơn tất anh, chị, bạn bè làm việc Viện nghiên cứu Vi tảo Dược mỹ phẩm - Học viện Nơng nghiệp Việt Nam tận tình giúp đỡ, đóng góp ý kiến bổ ích tạo điều kiện cho tơi hồn thành tốt khóa luận tốt nghiệp Mặc dù cố gắng hoàn thiện luận văn nhiệt tình, lực mình, nhiên khơng thể tránh khỏi thiếu sót, mong nhận đóng góp q thầy bạn để tơi hồn thành khóa luận tốt Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 28 tháng năm 2022 Sinh viên Trần Thị Diễm ii MỤ LỤ LỜ M ĐO N i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤ ÌN ẢNH vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT viii TÓM TẮT ix PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích yêu cầu 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu PHẦN 2: TỔN QU N TÀ L ỆU 2.1 Giới thiệu chung Đông trùng hạ thảo 2.1.1 Giới thiệu chung 2.1.2 Đặc điểm hình thái đơng trùng hạ thảo 2.2 Kĩ thuật nuôi trồng phương pháp nhân giống Đông trùng hạ thảo 2.3 Thành phần hóa học đơng trùng hạ thảo 2.4 Tác dụng Đông trùng hạ thảo 2.5 Tổng quan Adenosine Cordycepin 2.5.1 Công thức cấu tạo, đặc điểm vật lý hóa học 2.5.2 Dược động học cordycepin adenosine 10 2.5.3 Tác dụng cordycepin adenosine 11 2.6 Tình hình nghiên cứu tách chiết Đơng trùng hạ thảo Việt Nam giới13 2.6.1 Tình hình nghiên cứu tách chiết Đông trùng hạ thảo Việt Nam 13 2.6.2 Tình hình nghiên cứu tách chiết Đông trùng hạ thảo giới 14 2.7 Giới thiệu số phương pháp chiết 15 2.7.1 Phương pháp chiết Soxhlet 15 iii 2.7.2 Phương pháp chiết có hỗ trợ vi sóng (MAE) 17 2.7.3 Phương pháp ngấm kiệt 18 2.8 Các phương pháp tạo cao khô Đông trùng hạ thảo 18 2.8.1 Phương pháp sấy thăng hoa 18 2.8.2 Phương pháp sấy nhiệt 19 2.9 Phương pháp đánh giá hàm lượng hoạt chất thứ cấp 19 2.9.1 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 19 PHẦN 3: VẬT LIỆU, NỘ DUN VÀ P ƢƠN P ÁP N ÊN ỨU 22 3.1 Đối tượng, vật liệu nghiên cứu 22 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 22 3.1.2 Dụng cụ, thiết bị hóa chất 22 3.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 22 3.2.1 Địa điểm nghiên cứu 22 3.2.2 Thời gian nghiên cứu 22 3.3 Nội dung nghiên cứu 22 3.4 Các phương pháp nghiên cứu 23 3.4.1 Phương pháp xử lí mẫu 23 3.4.2 Phương pháp tách chiết thu cao chiết từ sợi nấm Đông trùng hạ thảo phương pháp Soxhlet 23 3.4.3 Nghiên cứu ảnh hưởng yếu tố vật lý, hóa học tới hiệu suất tách chiết Đông trùng hạ thảo 25 3.4.4 Nghiên cứu ảnh hưởng phương pháp sấy tới chất lượng cao khô Đông trùng hạ thảo 26 3.4.5 Định lượng adenosine cordycepin máy sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 27 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ T ẢO LUẬN 29 4.1 Nghiên cứu ảnh hưởng yếu tố vật lý hóa học tới hiệu suất tách chiết Đơng trùng hạ thảo 29 iv 4.1.1 Ảnh hưởng yếu tố dung môi tới hiệu suất tách chiết Đông trùng hạ thảo 29 4.1.2 Ảnh hưởng yếu thời gian tới hiệu suất chiết Đông trùng hạ thảo 32 4.2 Ảnh hưởng phương pháp sấy tới chất lượng cao khô Đông trùng hạ thảo 34 4.3 Đánh giá hàm lượng hợp chất thứ cấp cao khô Đông trùng hạ thảo HPLC 36 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ẾN NGHỊ 39 TÀ L ỆU THAM KHẢO 40 PHỤ LỤC 44 v D N MỤ BẢN Bảng 2.1 Thành phần acid béo Cordyceps militaris (Hur, 2008) Bảng 2.2 Độ tan adenosin số dung môi (Harry G Britain, 1998) 10 Bảng 4.1 Hiệu suất tách chiết sợi tươi Đông trùng hạ thảo loại dung môi khác 29 Bảng 4.2 Hiệu suất tách chiết sợi khô Đông trùng hạ thảo loại dung môi khác 30 Bảng 4.3 Bảng kết khảo sát ảnh hưởng yếu tố thời gian đến hiệu suất chiết sợi tươi Đông trùng hạ thảo 32 Bảng 4.4 Bảng kết khảo sát ảnh hưởng yếu tố thời gian đến hiệu suất chiết sợi khô Đông trùng hạ thảo 33 Bảng 4.5 Bảng kết ảnh hưởng phương pháp sấy tới cao khô sợi tươi Đông trùng hạ thảo 35 Bảng 4.6 Bảng kết ảnh hưởng phương pháp sấy tới cao khô sợi khô Đông trùng hạ thảo 35 Bảng 4.7 Xác định hàm lượng hợp chất cordycepin adenosine mẫu Đông trùng hạ thảo 37 vi D N MỤ ÌN ẢN Hình 2.1 Nấm Cordyceps militaris mặt cắt dọc thể chứa bào tử (Christian & cs., 1837) Hình 2.2 Cấu tạo số nucleotid Đông trùng hạ thảo (Yung- Jen Tsai & cs., 2010) Hình 2.3 Công thức cấu tạo cordycepin (P Karthe & cs., 1997) Hình 2.4 Cơng thức cấu tạo adenosine (Harry G Britain, 1998) Hình 2.5 Con đường chuyển hóa adenosine động vật có vú (Yung – Jen Tsai & cs., 2010) 11 Hình 2.6 Bộ chiết Soxhlet (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007) 16 Hình 2.7 Sơ đồ hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao (Nguyễn Văn Ri, 2011) 20 Hình 3.1 Mẫu đông trùng hạ thảo 23 Hình 3.2 Phương pháp tách chiết thu dịch chiết phương pháp Soxhlet 25 Hình 3.3 Máy sấy thăng hoa máy sấy hoa 26 Hình 4.1 Ảnh hưởng yếu tố dung môi sử dụng đến hiệu suất tách chiết Đông trùng hạ thảo 30 Hình 4.2 Khảo sát ảnh hưởng yếu tố thời gian đến hiệu suất tách chiết Đông trùng hạ thảo 33 Hình 4.3 Dịch chiết hai loại mẫu Đông trùng hạ thảo 34 sau chiết Soxhlet 34 Hình 4.4 Cao khô hai loại mẫu Đông trùng hạ thảo 36 Hình 4.5 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp 37 Hình 4.6 Sắc ký đồ dung dịch mẫu thử 37 Hình 4.7 Kết phân tích hàm lượng vi chất Đông trùng hạ thảo Viện nghiên cứu Vi tảo Dược mỹ phẩm – Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam sản xuất Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia ngày 5/4/2022 38 vii D N MỤ Ữ V ẾT TẮT Từ đầy đủ Từ viết tắt C militaris Cordyceps militaris C sinensis Cordyceps sinensis cs Cộng g gam HPLC High Performance Liquid Chromatography MAE Microwave Assisted Extraction mg miligam mg/g miligam/gam MeOH Methanol µg microgam SD Standard Deviation TB Trung bình viii Kết thu thể bảng 4.2 hình 4.1 cho thấy với mẫu sợi khô Đông trùng hạ thảo sau chiết với dung môi ethanol 96% cho khối lượng cao khơ trung bình 1,359 ± 0,021 g tương ứng với hiệu suất 13,59% hàm lượng adenosine đạt thấp 0,019 mg/g, sử dụng dung môi ethanol 70% cho khối lượng cao khô trung bình 1.424 ± 0,048g tương ứng với hiệu suất 14,24% với hàm lượng adenosine cordycepin đạt cao 0,051 mg/g 4,46 mg/g so với lượng cao khơ trung bình sử dung mơi nước tách chiết đạt 1,128 ± 0,039 g với hiệu suất 11,28% hàm lượng cordycepin thu đạt thấp 1,87 mg/g Như tách chiết sợi khô, sợi tươi Đông trùng hạ thảo dung môi ethanol 70% cho hiệu tốt Giải thích cho vấn đề mức độ phân cực dung môi phụ thuộc vào số điện môi giá trị liên kết hydro, phân tử nước có độ phân cực, số điện mơi liên kết hydro cao so với ethanol Do đó, pha ethanol xuống 70 % ethanol nước cho hỗn hợp ethanol nước có mức độ phân cực khác nhau, nồng độ dung mơi có độ phân cực tương đương với adenosine cordycepin adenosine cordycepin tan vào dung môi tốt Do đó, ethanol 70% lấy làm dung mơi tối ưu để thực thí nghiệm Trong nghiên cứu Nguyễn Thu Hà cộng năm 2020 chiết xuất adenosine từ Đông trùng hạ thảo phương pháp ngâm dầm nồng độ ethanol tăng lên khả ly trích Adenosine tăng đạt hiệu suất cao với ethanol 60%, ethanol tăng lên 96% hiệu suất giảm Điều lý giải hợp chất Adenosine có nhóm OH phân cực tương tác tốt với hợp chất phân cực Khi tăng hàm lượng hữu tương tác Adenosine hỗn hợp dung môi tăng Tuy nhiên, hàm lượng hữu tăng cao, đồng nghĩa với việc giảm độ phân cực hỗn hợp dung môi Khi độ phân cực dung môi giảm làm hạn chế lôi kéo Adenosine dung môi Hiệu suất cao khô thu dung môi ethanol 60% đạt cao 31 40,6% so với dung môi nước, ethanol 20%, ethanol 40%, ethanol 96% (Nguyễn Thu Hà & cs., 2020) 4.1.2 Ảnh hƣởng yếu thời gian tới hiệu suất chiết Đông trùng hạ thảo Để đánh giá ảnh hưởng yếu tố thời gian tách chiết tới hiệu suất chiết Đông trùng hạ thảo ta tiến hành thực với dung môi ethanol 70%, mốc thời gian giờ, giờ, 10 giờ, tỉ lệ nguyên liệu/dung môi 1:30 Kết khảo sát trình bày bảng 4.3, bảng 4.4 hình 4.2 Bảng 4.3 Bảng kết khảo sát ảnh hƣởng yếu tố thời gian đến hiệu suất chiết sợi tƣơi Đông trùng hạ thảo Thời gian Khối lƣợng cao Hiệu suất àm lƣợng àm lƣợng (giờ) khô sợi tƣơi tách chiết Adenosine Cordycepin C militaris (g) (%) (mg/g) (mg/g) (TB ± SD) 1,045 ± 0,055 10,45 1,93 4,23 1,224 ± 0,022 12,24 2,37 5,17 1,339 ± 0,038 13,39 2,79 5,56 10 1,398 ± 0,031 13,98 2,91 6,14 Kết thu thể bảng 4.3 hình 4.2 cho thấy, thời gian trích ly dài hiệu suất thu nhận cao chiết cao Ta thấy khoảng thời gian từ đến giờ, hàm lượng cao chiết tăng nhanh nhiều, từ 10,45% đến 13,39% Trong khoảng thời gian từ đến 10 giờ, hàm lượng cao chiết có tăng, tăng khơng đáng kể Thời gian tách chiết 10 chiết gần tối đa lượng cao chiết có nguyên liệu (13,98%) với hàm lượng adenosine cordycepin đạt cao tương ứng 2,91mg/g 6,14 mg/g Vậy thời gian 10 đem lại hiệu cao cho trình tách chiết sợi tươi Đông trùng hạ thảo 32 Bảng 4.4 Bảng kết khảo sát ảnh hƣởng yếu tố thời gian đến hiệu suất chiết sợi khô Đông trùng hạ thảo Thời gian Khối lƣợng cao Hiệu suất àm lƣợng àm lƣợng (giờ) khô sợi khô tách chiết Adenosine Cordycepin C militaris (g) (%) (mg/g) (mg/g) (TB ± sd) 1,138 ± 0,052 11,38 0,021 3,62 1,344 ± 0,031 13,44 0,029 4,07 1,424 ± 0,048 14,24 0,046 4,22 10 1,496 ± 0,023 14,96 0,051 4,46 ình 4.2 hảo sát ảnh hƣởng yếu tố thời gian đến hiệu suất tách chiết Đông trùng hạ thảo Kết thu thể bảng 4.4 hình 4.2 cho ta thấy khoảng thời gian từ đến giờ, hàm lượng cao chiết tăng nhanh nhiều, từ 33 11,38% đến 14,24% Trong khoảng thời gian từ đến 10 giờ, hàm lượng cao chiết có tăng, tăng khơng đáng kể Thời gian tách chiết 10 chiết gần tối đa lượng cao chiết có nguyên liệu (14,96%) với hàm lượng adenosine cordycepin đạt cao tương ứng 0,051 mg/g 4,46 mg/g Vậy thời gian 10 đem lại hiệu cao cho trình tách chiết sợi khô Đông trùng hạ thảo.Thời gian tách chiết dài hiệu suất thu nhận cao chiết cao Vì thời gian tăng làm tăng thời gian tiếp xúc nguyên liệu dung môi nên chiết nhiều hoạt chất Nhưng đến ngưỡng thời gian định lượng sản phẩm thu tăng thêm khơng đáng kể, đồng thời ảnh hưởng xấu đến chất lượng sản phẩm 4.2 Ảnh hƣởng phƣơng pháp sấy tới chất lƣợng cao khô Đông trùng hạ thảo Mẫu sợi tươi, sợi khô Đông trùng hạ thảo sau thu, xử lí nghiền nhỏ tiến hành tách chiết để thu dịch chiết Lượng mẫu dùng cho lần chiết 10g mẫu liên tục thời gian 10 chiết soxhlet dung môi ethanol 70%, dịch chiết thu đo lượng định đem sấy phương pháp sấy thăng hoa phương pháp sấy nhiệt thu cao khơ Đơng trùng hạ thảo Mỗi thí nghiệm lặp lại lần, kết lấy giá trị trung bình để đạt độ xác cao Kết thu mơ tả bảng 4.5 hình 4.4 ình 4.3 Dịch chiết hai loại mẫu Đông trùng hạ thảo sau chiết Soxhlet 34 Chú thích: A, B: Chiết rút hợp chất tự nhiên có loại vật liệu Sợi tươi đông trùng hạ thảo, Sợi khô đông trùng hạ thảo, tương ứng Bảng 4.5 Bảng kết ảnh hƣởng phƣơng pháp sấy tới cao khô sợi tƣơi Đông trùng hạ thảo Phƣơng Khối lƣợng cao khô àm lƣợng àm lƣợng pháp sấy sợi tƣơi C militaris Adenosine Cordycepin (g) (TB ± SD) (mg/g) (mg/g) 0,104 ± 0,011a 2,89 6,11 Sấy thăng Trạng thái/ màu sắc Cao khô, màu cam tươi hoa Sấy nhiệt 0,095 ± 0,008a 2,3 4,05 Cao khô, màu cam nâu Từ kết bảng 4.5 hình 4.4 cho ta thấy sấy sợi tươi Đông trùng hạ thảo phương pháp sấy thăng hoa khối lượng cao khô đạt 0,104 ± 0,011 g, hàm lượng adenosine 2,89 mg/g, hàm lượng cordycepin 6,11 mg/g cao khơ có màu tươi Trong sử dụng phương pháp sấy nhiệt cho khối lượng cao khô, hàm lượng adenosine cordycepin đạt thấp 0,095 ± 0,008 g, 2,3 mg/g 4,05 mg/g, cao khơ có màu cam nâu Bảng 4.6 Bảng kết ảnh hƣởng phƣơng pháp sấy tới cao khô sợi khô Đông trùng hạ thảo Phƣơng Khối lƣợng cao khô sợi àm lƣợng àm lƣợng pháp sấy khô C militaris (g) Adenosine Cordycepin (TB ± SD) (mg/g) (mg/g) màu sắc Cao khô, màu Sấy thăng hoa Trạng thái/ 0,165 ± 0,009a 0,047 4,45 cam tươi Cao khô, màu Sấy nhiệt 0,147 ± 0,009a 0,031 3,49 cam nâu 35 Từ kết bảng 4.5 hình 4.4 cho ta thấy sấy sợi khô Đông trùng hạ thảo phương pháp sấy thăng hoa khối lượng cao khô đạt 0,165 ± 0,009 g, hàm lượng adenosine 0,047 mg/g, hàm lượng cordycepin 4,45 mg/g cao khơ có màu tươi Trong sử dụng phương pháp sấy nhiệt cho khối lượng cao khô, hàm lượng adenosine cordycepin đạt thấp 0,147 ± 0,009 g, 0,031 mg/g 3,49 mg/g, cao khơ có màu cam nâu Như phương pháp sấy thăng hoa phương pháp sấy tối ưu cho hai mẫu sợi tươi sợi khô Đông trùng hạ thảo để tạo cao khơ sử dụng cho thí nghiệm ình 4.4 ao khơ hai loại mẫu Đơng trùng hạ thảo Chú thích: Cao khơ sấy phương pháp sấy thăng hoa mẫu sợi tươi Đông trùng hạ thảo (A) mẫu sợi khô Đông trùng hạ thảo (B), cao khô sấy phương pháp sấy nhiệt mẫu sợi tươi Đông trùng hạ thảo (C) mẫu sợi khô Đông trùng hạ thảo (D) 4.3 Đánh giá hàm lƣợng hợp chất thứ cấp cao khô Đông trùng hạ thảo HPLC Để tạo cao khô Đông trùng hạ thảo có hàm lượng hợp chất adenosine cordycepin cao Tiến hành thí nghiệm định lượng hàm lượng hợp chất thứ cấp (adenosine cordycepin) cao khô Đông trùng hạ thảo phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC), thu kết bảng 4.5 36 ình 4.5 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp ình 4.6 Sắc ký đồ dung dịch mẫu thử Bảng 4.7 Xác định hàm lƣợng hợp chất cordycepin adenosine mẫu Đông trùng hạ thảo Thành phần Cordycepin Adenosine (mg/100g) (mg/100g) Cao khô sợi khô đông trùng hạ thảo 474 5,44 Cao khô sợi tươi đông trùng hạ thảo 680 290 Mẫu Kết từ bảng 4.5 cho ta thấy cao khô sợi tươi đông trùng hạ thảo cho hàm lượng cordycepin 680 mg/100g adenosine 290 mg/100g cao hàm lượng cordycepin, adenosine cao khô sợi khô đông trùng hạ thảo tương ứng 474 mg/100g 5,44 mg/100g Hàm lượng cordycepin adenosine sợi tươi Đông trùng hạ thảo cao sợi khô Đơng trùng hạ thảo sợi khơ Đơng trùng hạ thảo trải qua trình nhiệt phân làm đáng kể hàm lượng hoạt chất 37 Theo phân tích nhà nghiên cứu có đến 169 – 250mg hàm lượng hàm lượng cordycepin 100g Đông trùng hạ thảo tự nhiên adenosine 100 – 120mg Với Đông trùng hạ thảo nhân tạo lượng hoạt chất ngày đạt đến 60 – 70% so với đông trùng hạ thảo tự nhiên Qua kiểm định cho thấy, loại đơng trùng ni cấy có mức hàm lượng đạt từ 60 đến 70%, trung bình khoảng từ 100 - 150mg 100g Hàm lượng cịn tùy thuộc vào chủng nấm quy trình ni cấy đơn vị sản xuất Không phải sản phẩm thị trường đạt hàm lượng đông trùng Theo kết kiểm định từ quan có thẩm quyền, hàm lượng cordycepin Đơng trùng hạ thảo Vietfarm có hàm lượng cordycepin đạt 122 mg/100g hàm lượng adenosine đạt 1,06 mg/100g.Theo kết phân tích, vi chất Đơng trùng hạ thảo Trường Đại học Tân Trào sản xuất Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia, hàm lượng adenosine 22,3 mg/100g, hàm lượng cordycepin 105mg/100g ình 4.8 Kết phân tích hàm lƣợng vi chất Đông trùng hạ thảo Viện nghiên cứu Vi tảo Dƣợc mỹ phẩm – Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam sản xuất Viện Kiểm nghiệm n toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia ngày 5/4/2022 38 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ẾN NGHỊ Cao chiết Đông trùng hạ thảo tách chiết phương pháp Soxhlet sử dụng dung môi chiết ethanol 70% thời gian chiết 10 tối ưu Mẫu sợi tươi Đơng trùng hạ thảo có hiệu suất cao chiết đạt 13,98% hàm lượng adenosine cordycepin tương ứng 2,91 mg/g 6,14 mg/g Đối với mẫu sợi khô Đông trùng hạ thảo hiệu suất cao chiết đạt 14,96%, hàm lượng adenosine cordycepin 0,051 mg/g 4,46 mg/g Phương pháp sấy thăng hoa cho khối lượng cao khô, hàm lượng adenosine cordycepin cao nhất, cao thu đạt trạng thái cao khô màu vàng cam Mẫu sợi tươi Đông trùng hạ thảo cho khối lượng cao khô 0,104 ± 0,011 g, hàm lượng adenosine cordycepin luần lượt 2,89 mg/g 6,11 mg/g Mẫu sợi khô Đông trùng hạ thảo có khối lượng cao khơ đạt 0,165 ± 0,009 g, hàm lượng adenosine cordycepin tương ứng 0,047 mg/g 4,45 mg/g Đánh giá hàm lượng hợp chất thứ cấp cao khô Đông trùng hạ thảo phương pháp HPLC cho thấy cao khô sợi tươi Đông trùng hạ thảo đạt hàm lượng cordycepin 680 mg/100g adenosine 290 mg/100g Kiến nghị: Do thời gian nghiên cứu có hạn nên số phương pháp tách chiết Đông trùng hạ thảo khác chưa thể thực Bên cạnh đó, nghiên cứu dừng mức quy mơ phịng thí nghiệm đề xuất thêm nghiên cứu cải thiện hiệu suất tách chiết, phương pháp sấy; Có thể sản xuất cao khơ Đông trùng hạ thảo giàu hợp chất thứ cấp quy mô lớn, phục vụ cho ngành sản xuất dược liệu, sản xuất dược phẩm, thực phẩm 39 TÀ L ỆU T A M ẢO Tài liệu tiếng việt Đoàn Thị Phương Thùy, Trần Thị Ngọc Ánh & Nguyễn Thị Mai (2018) Nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện tách chiết đến hiệu thu nhận hoạt chất cordycepin từ nhộng trùng thảo (Cordyceps militaris Linn Link) Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh 13(1): 93-102 Đỗ Thị Gấm, Bá Thị Châm & Nguyễn Tiến Mạnh (2020) Nghiên cứu bào chế hệ chất mang nano Chitosan-Peg chưa hoạt chất từ nấm đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris Link) Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Đại học Thái Nguyên 225(08): 126-133 Lê Thị Huyền Trang, Lê Minh Hoàng & Nguyễn Duy Bắc (2017) Nghiên cứu xây dựng quy trình chiết xuất adenosin cordycepin từ Đông trùng hạ thảo nuôi cấy (Cordyceps militaris) Tạp chí Dược học, (T57) Nguyễn Kim Phi Phụng (2007) Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, Nhà xuất Đại Học Quốc Gia TP.HCM, TP.HCM Nguyễn Thu Hà, Nguyễn Ngọc Trai Nguyễn Thiện Thảo (2020) Nghiên cứu quy trình ly trích xác định hàm lượng Adenosine cao ethanol đông trùng hạ thảo (Cordyceps Militaris) HPLC-PDA Tạp chí Cơng Thương - Các kết nghiên cứu khoa học ứng dụng công nghệ 225(9): 32- 43 Nguyễn Thu Quỳnh, Nguyến Thị Hồng Thúy Đỗ Thị Huyền (2020) Nghiên cứu bào chế cốm tan đơng trùng hạ thảo Tạp chí Khoa học Công nghệ Đại học Thái Nguyên 225(01): 24-28 Nguyễn Văn May (2004) Kỹ thuật sấy nông sản thực phẩm Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Hà Nội, Hà Nội Nguyễn Văn Ri (2011) Các phương pháp tách, Tài liệu dùng cho học viên cao học, Bộ mơn Hóa Phân Tích, Khoa Hóa Học, trường đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội B Tài liệu nƣớc Baoyan Fan & Haibo Zhu (2012) “Cordycepin: pharmacological properties and their relevant mechanisms”, TANG Humanitas medicine, 2, pp 141 – 147 Td cordycepin 40 Buenz E.J., Bauer B.A., Osmundson T.W & Motley T.J (2005) “The traditional Chinese medicine Cordyceps sinensis and its effects on the apoptotic homeostatic”, Journal of Ethnopharmacology, 96, pp 19 – 29 Chang H L., Chao G R., Chen C C & Mau J L (2001) Non-volatile taste components of Agaricus blazei, Antrodia camphorata and Cordyceps militarismtcelia Food Chemistry 74:203-207 Hardeep S Tuli., Sharma A K., Sandhu S S & Dharambir K (2013), “Cordycepin: A bioactive metabolite with therapeutic potential”, Life Sciences, 93, pp 863 – 869 Hardeep S Tuli1., Sandhu S S., Dharambir K & Sharma Anil K (2014) Optimization of extraction conditions and antimicrobial potential of a bioactive metabolite, cordycepin from cordyceps militaris 3936 World Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 3(4), pp 1525-1535 Harry G B (1998) Analytical profiles of Drug Substances and Excipients Volume 25, Academic Press, USA Hong Jue Lee (2012) “The nucleoside antagonist cordycepin causes DNA double strand breaks in breast cancer cells”, Invest New Drugs, 20, pp 1917 – 1925 Hsui- Ju Wang, Meng - Chun Pan, Chao - Kai Chang & Shu - Wei Chang (2014) Optimization of Ultrasonic-Assisted Extraction of Cordycepin from Cordyceps militaris Using Orthogonal Experimental Design Molecules 19(12):20808-20820 Hur H (2008) Chemical Ingredients of Cordyceps militaris Mycobiology 36(4):233-235 Karthe P., Gautham N., Anil Kumar & Katti S.B (1997) “β – D – 3’ – Deoxyadenosine (Cordycepin), Acta Cryst., C53, pp, 1694 – 1696 Kim S.W., Hwang H.J & Xu C.P (2003) Optimization of submerged culture process for the production of mycelial biomass and exo-polysaccharides by Cordyceps militaris C738 Journal of Apply Microbiology 94:120–126 Kobayasi Y (1982) Keys to the taxa of the genera Cordyceps and Torrubiella Transactions of the Mycological Society of Japan 23:329–364 Herbal, New York 41 Lei Huang, Qizhang Li, Yiyuan Chen, Xuefei Wang & Xuanwei Zhou (2009) Determination and analysis of cordycepin and adenosine in the products of Cordyceps spp African Journal of Microbiology Research Vol 3(12): 957-961 Li C.R., Nam.S.H & Geng D.G (2006) Artificial culture of seventeen Cordyceps spp Mycosystema 25:639–645 Li Ma, Song Zhang & Mei Du (2015) “Cordycein from Cordyceps militaris prevents hyperglycemia in alloxan – induced diabetic mice”, Nutrition research, 35, pp 431 – 439 Lim L., Lee C & Chang E (2012) Optimization of solid state culture conditions for the production of adenosine, cordycepin, and D-mannitol in fruiting bodies of medicinal caterpillar fungus Cordyceps militaris (L.:Fr.) Link (Ascomycetes) International Journal of Medicinal Mushrooms 14:181–188 Lu J.M., Zeng Z.J & He H.Q (2005) Culture technique of Cordyceps militaris on artificial media Guangdong Agricultural Science 2:88–89 Lucia Spicuzza, Giuseppe Di Maria & Riccardo Polosa (2006) “Adenosine in the airways: Implications and applications”, European Journal of Pharmacology, 533, pp 77 – 88 Masatsugu Hori & Masafumi Kitakaze (1991) “Adenosine, the Heart, and Coronary Circulation”, Hypertension, 18, pp 565 – 574 Patel K.J & Ingalhalli R.S (2013) “Cordyceps militaris (L.:Fr.) Link – An Important Medicinal Mushroom”, Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry, Vol 2, Issue 1, pp 315 – 319 Paul M K., Paul F C., David W.M & Stalpers J A (2008) Dictionary of the Fungi; CABI Peter C.K Cheung (2008) Mushrooms as functional foods, A John Wiley & Sons Inc, USA Shih I.L., Tsai K.L & Hsieh C.Y (2007) Effects of culture conditions on the mycelial growth and bioactive metabolite production in submerged culture of Cordyceps militaris Biochemical Engineering Journal 33, 193–201 42 Wang G.D (1995) Ecology, cultivation and application of Cordyceps and Cordyceps sinensis Scientific and Technical Documents Wol-Soon J., Yoo-Jin C., Hyoun-Ji K., Jae-Yun L., Byung-Hyouk N., Jae-Dong L., Sang-Wha L., Su-Yeong S & Min-Ho J (2010) The Antiinflammatory Effects of Water Extract from Cordyceps militaris in Murine Macrophage Mycobiology 38(1): 46-51 Xuanwei Zhou, Zhenghua Gong, Ying Su, Juan Lin & Kexuan Tang (2009) “Cordyceps fungi: natural products, pharmacological functions and developmental products”, Journal of Pharmacy and Pharmacology, 61, pp 279 – 291 Yan H., Zhu D., Xu D., Wu J & Bian X (2008) A study on Cordyceps militarispolysaccharide purification, composition and activity analysis African Journal of Biotechnology (22): 4004-4009 Yung – Jen Tsai, Lie – Chwen Lin & Tung – Hu Tsai (2010) “Pharmacokinetics of Adenosine and Cordycepin, a Bioactive Constituent of Cordyceps sinensis in Rat”, J Agric Food Chem., 58, pp 4638 – 4643 Zheng-Ming Qian,Chun-Hong Li, Yue-Lin Song, Miao-Xia Zhou & Wen-Jia Li (2018) Rapid Determination of Adenosine in Cordyceps by Online Extraction HPLC Journal of Chromatographic Science, 2019, Vol 57, No 4, 381–384 43 PHỤ LỤC Thí nghiệm: Ảnh hưởng phương pháp sấy tới chất lượng cao khô Đông trùng hạ thảo Source DF SS MS F P nghiệm thức 0.0001215 0.0001215 1.39 0.304 Error 0.0003500 0.0000875 Total 0.0004715 S = 0.009354 R-Sq = 25.77% R-Sq(adj) = 7.21% Level N Mean StDev sấy nhiệt 0.09500 0.00800 sấy thăng hoa 0.10400 0.01054 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level + -+ -+ -+ sấy nhiệt ( * ) sấy thăng hoa ( * ) + -+ -+ -+ 0.080 0.090 0.100 0.110 Pooled StDev = 0.00935 Grouping Information Using Tukey Method nghiệm thức N Mean Grouping sấy thăng hoa 0.104000 A sấy nhiệt 0.095000 A Means that not share a letter are significantly different Tukey 95% Simultaneous Confidence Intervals All Pairwise Comparisons among Levels of nghiệm thức Individual confidence level = 95.00% nghiệm thức = sấy nhiệt subtracted from: nghiệm thức Lower Center Upper sấy thăng hoa -0.012205 0.009000 0.030205 nghiệm thức + -+ -+ -+ sấy thăng hoa ( -* -) + -+ -+ -+ -0.015 0.000 0.015 0.030 44 One-way ANOVA: khối lƣợng versus nghiệm thức Source DF SS MS F P nghiệm thức 0.0005042 0.0005042 6.10 0.069 Error 0.0003307 0.0000827 Total 0.0008348 S = 0.009092 R-Sq = 60.39% R-Sq(adj) = 50.49% Level N Mean StDev sấy nhiệt 0.14700 0.00872 sấy thăng hoa 0.16533 0.00945 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level + -+ -+ -+ sấy nhiệt ( * -) sấy thăng hoa ( -* -) + -+ -+ -+ 0.132 0.144 0.156 0.168 Pooled StDev = 0.00909 Grouping Information Using Tukey Method nghiệm thức N Mean Grouping sấy thăng hoa 0.165333 A sấy nhiệt 0.147000 A Means that not share a letter are significantly different Tukey 95% Simultaneous Confidence Intervals All Pairwise Comparisons among Levels of nghiệm thức Individual confidence level = 95.00% nghiệm thức = sấy nhiệt subtracted from: nghiệm thức Lower Center Upper sấy thăng hoa -0.002278 0.018333 0.038945 nghiệm thức + -+ -+ -+ sấy thăng hoa ( -* -) + -+ -+ -+ -0.015 0.000 0.015 0.030 45