Nghiên cứu đánh giá khả năng ức chế enzyme tyrosinase của cao chiết đông trùng hạ thảo

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC ~~~~~***~~~~~ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ ENZYME TYROSINASE CỦA CAO CHIẾT ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO Hà Nội, 2020 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC ~~~~~***~~~~~ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ ENZYME TYROSINASE CỦA CAO CHIẾT ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO Sinh viên thực LÊ THỊ LY Mã sinh viên 610736 Lớp K61CNSHB Giảng viên hướng dẫn PHÍ THỊ CẨM MIỆN Hà Nội, 2020 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan kết quả, hình ảnh, số liệu nghiên cứu sử dụng luận văn trung thực, chưa sử dụng báo cáo Tất thơng tin trích dẫn khóa luận rõ nguồn gốc giúp đỡ cảm ơn Tôi xin chịu trách nhiệm lời cam đoan trước Học viện Hội đồng Hà Nội, ngày tháng Sinh viên i năm 2020 LỜI CẢM ƠN Sau kết thúc quãng thời gian thực tập Khoa Công nghệ Sinh học- Học viện Nông nghiệp Việt Nam Được quan tâm, bảo tận tình Thầy, Cơ cán phịng thí nghiệm Cùng với cố gắng, nỗ lực thân, em rút nhiều học kinh nghiệm quý báu cho thân Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học tồn thể Thầy, Cơ truyền đạt cho tơi kiến thức chuyên ngành, kỹ việc phịng thí nghiệm học q báu suốt thời gian học tập, rèn luyện Học viện Nông nghiệp Việt Nam Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn biết ơn sâu sắc tới ThS PHÍ THỊ CẨM MIỆN , người cô hướng dẫn tận tâm, giải đáp thắc mắc câu hỏi giúp đỡ tơi nhiệt tình q trình làm thí nghiệm thu kết tốt Cuối cùng, với tất lịng kính trọng biết ơn vơ hạn, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình người thân,bạn bè Thầy Cơ luôn động viên, giúp đỡ, tạo động lực cho tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu q trình làm khóa luận Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng Sinh viên ii năm 2020 MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN .ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi DANH MỤC ĐỒ THỊ viii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ix TÓM TẮT x PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích yêu cầu đề tài 1.2.1 Mục đích đề tài 1.2.2 Yêu cầu đề tài 1.3.Ý nghĩa đề tài 1.3.1.Ý nghĩa khoa học 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1: Giới thiệu enzyme tyrosinase 2.1.1 Khái niệm nguồn gốc enzyme tyrosinase tự nhiên 2.1.2.Vai trò ứng dụng enzyme tyrosinase 2.1.3 Sự hình thành enzyme tyrosinase tự nhiên hình thành sắc tố da người 2.1.4 Cơ chế hoạt động enzyme tyrosinase 2.1.5 Ảnh hưởng chất ức chế đến hoạt động enzyme tyrosinase 2.2 Động học phản ứng enzyme tyrosinase 11 2.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ enzyme đến tốc độ chuyển hóa chất 11 2.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ chất 12 2.3 Các chất ức chất enzyme tyrosinase 14 2.5 Các nghiên cứu sàng lọc chất ức chế enzyme tyrosinase 19 iii 2.5.1 Nghiên cứu hoạt động ức chế ezyme tyrosinase từ đông trùng hạ thảo 19 2.5.2 Nghiên cứu hoạt động ức chế enzyme tyrosinase từ loại khác 20 2.6 Cây dược liệu có hoạt tính ức chế tyrosinase 20 2.6.1.Giới thiệu đông trùng hạ thảo 20 2.6.2 Khái quát chung số loại khác có hoạt tính ức chế tyrosinase 21 2.6.3 Hoạt chất sinh học có đông trùng hạ thảo 23 2.7 Giới thiệu số phương pháp chiết 24 2.7.1 Phương pháp chiết Soxhlet 25 2.7.2 Ngấm kiệt 26 2.7.3 CO tới hạn 27 2.7.4 Lôi nước 28 2.8.Các nghiên cứu khả ức chế enzyme tyrosinase việt nam giới 28 2.8.1.Việt nam 28 2.8.2 Thế giới 29 PHẦN : ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 3.1 Đối tượng, vật liệu nghiên cứu 32 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 32 3.1.2 Nguyên liệu, hóa chất, dụng cụ 32 3.1.3 Thiết bị 32 3.1.4 Địa điểm thời gian nghiên cứu 32 3.2 Nội dung nghiên cứu 32 3.3 Phương pháp nghiên cứu 32 3.3.1 Phương pháp tách chiết thu dịch chiết đông trùng hạ thảo 32 3.3.2 Phương pháp thử hoạt tính enzyme tyrosinase 34 PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43 4.1 Ảnh hưởng dung môi đến hiệu tách chiết 43 4.2 Xác định động học enzyme tyrosinase 45 4.2.1 Xác định nồng độ enzyme tối ưu cho phản ứng 45 4.2.2 Ảnh hưởng nồng độ chất L-DOPA đến phản ứng 46 4.2.3 Đánh giá khả ức chế enzyme tyrosinase arbutin 48 iv 4.3 Xác định động học enzyme tyrosinase có mặt dịch chiết đơng trùng hạ thảo 49 4.3.1 Nghiên cứu khả ức chế enzyme dịch chiết đông trùng hạ thảo dung môi ethyl acetate 49 4.3.2 Khả ức chế enzyme dịch chiết ethanol 51 4.3.3 Phân tích động học enzyme tyrosinase có chất ức chế tham gia 53 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55 5.1 Kết luận 55 5.2 Kiến nghị 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 v DANH MỤC BẢNG Bảng :Kết thử hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase mẫu thuốc thuộc họ Dâu tằm 22 Bảng 2.1 Thành phần acid béo Cordyceps militaris (Hur, 2008) 23 Bảng 3.1: Khối lượng hóa chất, thể tích, nồng độ cần pha đệm Potassium 35 Bảng 3.2: Khối lượng hóa chất, thể tích, nồng độ cần pha hóa chất L- DOPA (3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-L-alanine) 36 Bảng 3.3: Dãy nồng độ pha loãng acid arbutin 37 Bảng 3.4: Khối lượng, thể tích, nồng độ cần pha hóa chất acid arbutin 37 Bảng 3.5: Dãy nồng độ pha loãng từ dung dịch gốc 39 Bảng 3.6: Thể tích hút chất vào giếng ELISA 39 Bảng 4.1: Ảnh hưởng dung môi thời gian đến khối lượng cao chiết đông trùng hạ thảo 43 Bảng 4.5: Ảnh hưởng nồng độ enzyme khác đến vận tốc phản ứng 45 Bảng 4.6 Ảnh hưởng nồng độ chất L-DOPA đến phản ứng 47 Bảng 4.7: Bảng đo độ hấp thụ huỳnh quang đối chứng (+) 48 Bảng 4.8: Phần trăm ức chế enzyme tyrosinase arbutin 49 Bảng 4.9: Khả ức chế enzyme dịch chiết ethyl acetate 50 Bảng 4.10 : Phần trăm ức chế enzyme tyrosinase từ dịch chiết dung môi ethyl acetate 50 Bảng 4.11: Khả ức chế enzyme dịch chiết ethanol 51 Bảng 4.12: Phần trăm ức chế enzyme tyrosinase từ dịch chiết đông trùng hạ thảo dung môi ethanol 52 Bảng 4.13: Tổng hợp Ic50, mức độ ức chế, Km Vmax dịch chiết đông trùng hạ thảo dung môi 54 vi DANH MỤC HÌNH Hình 2.1: Cấu trúc enzyme tyrosinase Hình 2.2 Cơ chế tổng hợp melanin hình thành sắc tố da vai trò enzyme tyrosinase Hình 2.3 Sự hình thành mảng sắc tố da tác dụng tia UV Hình 2.4: Sơ đồ chất kìm hãm cạnh tranh: chất(S) chất kìm hãm (I) Hình 2.5: Lineweaver –Burk plot Hình 2.6: Đồ thị đảo ngược kép mô tả kiểu ức chế phản ứng enzyme 10 Hình 2.7: Sự phụ thuộc vận tốc phản ứng vào [E] 12 Hình 2.8: Biến thiên vận tốc phản ứng theo nồng độ chất 13 Hình 2.9: Tinh chất dưỡng trắng da Naris Nature Whitening Serum Nhật Bản 19 Hình2.10 :Nầ́ m Cordyceps militaris mặt cắt dọc thể chứa bào tử (Christian et al., 1837) 21 Hình 2.1 Cấu trúc hóa học Cordycepin Adenosine osine (Tuli et al., 2013) 24 Hình 2.13: Hình ảnh dụng cụ Soxhlets 25 Hình 2.14 Sơ đồ hoạt động chiết CO siêu tới hạn 27 Hình 2.15 Sơ đồ hoạt động chưng cất lôi nước 28 Hình 3.1 đơng trùng hạ thảo khô chiết Soxhlet 34 Hình 3.2: Máy đọc miễn dịch ELISA MR-96A Mindray Xuất xứ: Trung Quốc giếng ELISA (96 giếng ) 34 Hình 3.3: Hóa chất L-DOPA (3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-L-alanine) 36 Hình 3.4 : Hóa chất acid arbutin 37 Hình 3.4: Enzyme mushroom tyrosinase 38 Hình 4.1: Chiết đơng trùng hạ thảo máy Soxhlet 44 Hình 4.2: Dịch chiết đơng trùng hạ thảo sau chiết Soxhlet 44 Hình 4.3: Cao chiết ba loại tảo 45 Hình 4.4: Phản ứng đĩa microtiter 46 Hình 4.5 Phản ứng đĩa microtiter 47 vii DANH MỤC ĐỒ THỊ Biểu đồ 4.1: Ảnh hưởng nồng độ enzyme khác đến tốc phản ứng 46 Biểu đồ 4.2: Ảnh hưởng nồng độ chất đến tốc phản ứng 47 Biểu đồ 4.3: Ảnh hưởng nồng độ arbutin đến khả ức chế enzyme tyrosinase 49 Biểu đồ 4.4 Khả ức chế enzyme dịch chiết ethyl acetate 50 Biểu đồ 4.5 Mức độ ức chế enzyme dịch chiết ethyl acetate 51 Biểu đồ 4.6 Khả ức chế enzyme dịch chiết ethanol 52 Biểu đồ 4.7 Mức độ ức chế enzyme dịch chiết ethanol 52 Biểu đồ 4.8 LINWEAVER- Burk plots hoạt động tyrosinase với chất LDOPA nồng độ dịch chiết đông trùng hạ thảo 50,200,400 800µg/ml 53 viii Hình 4.1: Chiết đơng trùng hạ thảo máy Soxhlet Chú thích: Chiết rút hợp chất tự nhiên có đơng trùng hạ thảo Hình 4.2: Dịch chiết đơng trùng hạ thảo sau chiết Soxhlet Chú thích: Chiết rút hợp chất tự nhiên có đơng trùng hạ thảo Dịch chiết thu đem đuổi dung môi để thu cao chiết Khối lượng cao chiết xác định phương pháp cân đo Kết minh họa đuổi dung mơi dịch chiết đĩa Petri trình bày hình 4.3 44 Hình 4.3: Cao chiết ba loại tảo Chú thích:Cao chiết rút hợp chất tự nhiên từ đơng trùng có dung mơi khác 4.2 Xác định động học enzyme tyrosinase 4.2.1 Xác định nồng độ enzyme tối ưu cho phản ứng Nghiên cứu động học enzyme nghiên cứu ảnh hưởng yếu tố: nồng độ chất, enzyme, pH môi trường, nhiệt độ, chất kìm hãm đến tốc độ phản ứng enzyme xúc tác Việc nghiên cứu động học enzyme cho biết ảnh hưởng yếu tố tham gia vào phản ứng enzyme Trong nghiên cứu để xác định nồng độ enzyme phù hợp với nghiên cứu nồng độ khác enzyme tyrosinase khảo sát từ ngưỡng nồng độ từ 10 50 Units/phản ứng Nồng độ chất L-DOPA cố định nồng độ mM Thời gian phản ứng 15 phút nhiệt độ phòng Kết trình bày bảng 4.5 Bảng 4.5: Ảnh hưởng nồng độ enzyme khác đến vận tốc phản ứng Nồng độ enzyme (Units) OD492 nm 10 20 30 40 50 Lần 0,591 1,023 1,521 1,723 1,702 Lần 0,621 1,147 1,607 1,948 1,601 Lần 0,545 1,286 1,431 1,611 1,570 1,761±0,17 1,624±0,069 Trung bình 0,586±0,038 1,152±0,13 1,52±0,088 45 Biểu đồ 4.1: Ảnh hưởng nồng độ enzyme khác đến tốc phản ứng Hình 4.4: Phản ứng đĩa microtiter Chú thích: Hàng từ trái qua phải: Enzyme tyrosinase tăng dần từ 10 đến 50 unit Phản ứng lặp lại lần 4.2.2 Ảnh hưởng nồng độ chất L-DOPA đến phản ứng Trong nghiên cứu nồng độ enzyme cố định 40 Units, nồng độ chất L-DOPA thay đổi từ đến mM Kết thu trình bày bảng 4.6 46 Bảng 4.6 Ảnh hưởng nồng độ chất L-DOPA đến phản ứng Nồng độ chất L-DOPA (mM) OD492 nm Lần 0,695 1,082 1,331 1,6843 1,665 Lần 0,654 1,073 1,421 1,671 1,651 Lần 0,701 1,071 1,572 1,721 1,640 Trung bình 0,675±0,029 1,075±0,006 1,441±0,12 1,692±0,026 1,629±0,05 Biểu đồ 4.2: Ảnh hưởng nồng độ chất đến tốc phản ứng Hình 4.5 Phản ứng đĩa microtiter Chú thích: Hàng từ trái qua phải: Cơ chất L-DOPA tăng dần từ đến mM Phản ứng lặp lại lần 47 Kết thu cho thấy tăng nông độ chất L-DOPA tốc độ phản ứng enzyme tăng, nhiên nồng độ chất tăng đến mM phản ứng đạt cân Khi tăng nồng độ chất L-DOPA đến 5mM tốc độ phản ứng có xu hướng giảm (Biểu đồ 4.2) Trong phản ứng động học enzyme, giá trị V max xác định tốc độ phản ứng đạt cực đạt (tính theo giá trị cường độ huỳnh quang bước sóng 492 nm, đồng thời giá trị Km xác định nồng độ chất L-DOPA mà tốc độ phản ứng ½ V max Giá trị Km xác định dựa vào thực nghiệm phương trình tuyến tính (Biểu đồ 4.2) Giá trị Km xác định = 1,47 mM 4.2.3 Đánh giá khả ức chế enzyme tyrosinase arbutin Arbutin chất làm đối chứng (+) sử dụng cơng nghiệp mỹ phẩm, có khả ức chế enzyme tyrosinse cao Dựa vào nghiên cứu, lựa chọn arbutin để so sánh đánh giá khả ức chế enzyme tyrosinase ba loại dịch chiết đông trùng hạ thảo Phần trăm ức chế enzyme tyrosinase tính theo cơng thức (1) Dựa sở xác định nồng độ enzyme nồng độ L-DOPA thí nghiệm trên, thí nghiệm này, phản ứng enzyme (đối chứng âm) sử dụng enzyme tyrosinase nồng độ 30 U, L-DOPA mM Đối với phản ứng có mặt chất ức chế arbutin, nồng độ sử dụng từ 10 đến 1000 µM Kết trình bày bảng 4.7, biểu đồ 4.8: Bảng 4.7: Bảng đo độ hấp thụ huỳnh quang đối chứng (+) Đối chứng (+) 10µM 100µM 500µM 1000µM 1,673 1,2937 0,8663 0,6957 48 Bảng 4.8: Phần trăm ức chế enzyme tyrosinase arbutin Nồng độ (µM) 10 100 500 1000 10,3189 30,6513 53,562 62,707 % Ức chế (%) Ảnh hưởng nồng độ arbutin đến khả ức chế enzyme tyrosinase 70 60 50 40 30 20 10 0 200 400 600 800 1000 1200 Nồng độ arbutin (µM) Biểu đồ 4.3: Ảnh hưởng nồng độ arbutin đến khả ức chế enzyme tyrosinase Vậy dịch chiết đông trùng hạ thảo có khả ức chế enzyme tyrosinase đánh giá lựa chọn chất ức chế enzyme tyrosinase thay cho acid arbutin sử dụng công nghiệp mỹ phẩm 4.3 Xác định động học enzyme tyrosinase có mặt dịch chiết đơng trùng hạ thảo 4.3.1 Nghiên cứu khả ức chế enzyme dịch chiết đông trùng hạ thảo dung môi ethyl acetate Khả ức chế enzyme tyrosinase dịch chiết đông trùng dung môi ethyl acetate nồng độ khác xác định cường độ huỳnh quang bước sóng 492 nm Kết trình bày bảng 4.9 49 Bảng 4.9: Khả ức chế enzyme dịch chiết ethyl acetate Nồng độ µM Mẫu cao chiết Đông trùng hạ thảo Rutin 50 200 400 800 1,406±0.121 1,293±0,132 0,133±0,144 0,9972±0,127 1,673±0,14 1,293±0,12 0,886±0,1 0,695±0,1 khả ức chế enzyme dịch chiết ethyl acetate Mẫu cao chiết µg 1.5 1.673 1.406 1.293 1.293 0.886 0.9972 0.695 0.5 0.133 Nồng độ µM 50, 200, 400, 800 Đơng trùng hạ thảo Rutin Biểu đồ 4.4 Khả ức chế enzyme dịch chiết ethyl acetate Từ độ hấp huỳnh quang ba loại dịch chiết tảo dung môi ethyl acetate tính phần trăm ức chế enzyme tyrosinase cao chiết Thấy rằng, phần trăm ức chế enzyme tyrosinase ethanol cao Dưới tổng hợp bảng kết sau hồn thành thí nghiệm Bảng 4.10 : Phần trăm ức chế enzyme tyrosinase từ dịch chiết dung môi ethyl acetate Nồng % ức độ(µM) chế Đơng trùng hạ thảo 50 200 400 800 24,6261±1,1331 31,1391±2,17 39,266±1,25 46,5451±1,33 50 Mức độ ức chế enzyme dịch chiết ethyl acetate 46.5451 50 45 39.266 40 31.1391 % ức chế 35 30 24.6261 25 20 15 10 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 Nồng độ(µM) Biểu đồ 4.5 Mức độ ức chế enzyme dịch chiết ethyl acetate Kết bảng 4.9; 4.10 cho thấy dịch chiết biểu có hoạt tính ức chế enzyme tyrosinae mức độ ức chế tỉ lệ với nồng độ dịch chiết Trong dịch chiết đông trùng hạ thảo khả ức chế enzyme tyrosinase thể khả ức chế enzyme cao nồng độ 800 (µg/ml), 46,5451(%) Khi so sánh với arbutin (chất có khả ức chế enzyme/đối chứng dương) cho thấy, khả ức chế enzyme dịch chiết thấp đáng kể Trong điều kiện thí nghiệm, nồng độ dịch chiết sử dụng đến 800µg /ml khả ức chế với đạt ngưỡng 15-25% so với đối chứng (phản ứng không bổ sung chất ức chế) 4.3.2 Khả ức chế enzyme dịch chiết ethanol Khả ức chế enzyme tyrosinase dịch chiết ethanol nồng độ khác xác định cương độ huỳnh quang bước sóng 492 nm Kết trình bày bảng 4.11 Bảng 4.11: Khả ức chế enzyme dịch chiết ethanol Nồng % ức độ(µM) chế Đơng trùng hạ thảo 50 200 400 800 1,3995±0,123 1,2395±0,134 1,087±0,164 0,9779±0,126 51 Khả ức chế enzyme dịch chiết ethanol 1.6 1.3995 1.4 1.2395 1.087 % ức chế 1.2 0.9779 0.8 0.6 0.4 0.2 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 Nồng độ(µM) Biểu đồ 4.6 Khả ức chế enzyme dịch chiết ethanol Từ độ hấp huỳnh quang ba loại dịch chiết đông trùng hạ thảo dung môi ethanol tính phần trăm ức chế enzyme tyrosinase đông trùng hạ thảo Dưới tổng hợp bảng kết sau hồn thành thí nghiệm Bảng 4.12: Phần trăm ức chế enzyme tyrosinase từ dịch chiết đông trùng hạ thảo dung môi ethanol Nồng % ức độµM chế Đơng trùng hạ thảo 50 200 400 800 24,98±1,12 33,5566±0,134 41,7314±1,26 47,58±2,92 % ức chế Mức độ ức chế enzyme dịch chiết ethanol 50 45 40 35 30 25 20 15 10 47.58 41.7314 33.5566 24.98 100 200 300 400 500 600 700 800 900 Nồng độ(µM) Biểu đồ 4.7 Mức độ ức chế enzyme dịch chiết ethanol 52 Kết bảng 4.11 cho thấy cường độ huỳnh quang bước sóng 492 nm dịch chiết đơng trùng hạ thảo giảm dần tăng nồng độ dịch chiết Điều chứng tỏ dịch chiết đông trùng hạ thảo có khả ức chế enzyme tyrosinase Tuy nhiên, mức độ ức chế cao dịch chiết ethanol Dịch chiết thử nghiệm, dich chiết đông trùng cho khả ức chế enzyme cao nồng độ 800 (µg/ml) Kết bảng 4.11; 4.12 cho thấy dịch chiết biểu có hoạt tính ức chế enzyme tyrosinae mức độ ức chế tỉ lệ với nồng độ dịch chiết Trong dịch chiết khả ức chế enzyme tyrosinase đông trùng hạ thảo thể khả ức chế enzyme cao nồng độ 800 (µg/ml), Mức độ ức chế enzyme tyrosinase đông trùng hạ thảo 47,58; (%) Khi so sánh với arbutin (chất có khả ức chế enzyme/đối chứng dương) cho thấy, khả ức chế enzyme dịch chiết thấp đáng kể Trong điều kiện thí nghiệm, nồng độ dịch chiết sử dụng đến 800µg /ml khả ức chế với đạt ngưỡng 15-25% so với đối chứng (phản ứng không bổ sung chất ức chế) 4.3.3 Phân tích động học enzyme tyrosinase có chất ức chế tham gia Khi chất ức chế dịch chiết đông trùng hạ thảo bổ sung nồng độ định mà làm tốc độ phản ứng giảm ½ lần nồng độ đạt giá trị IC50 Việc tăng nồng độ chất ức chế dẫn đến cạnh trannh vị trí xúc tác enzyme Khi tăng nồng độ chất ức chế tốc độ phản ứng giảm Km nồng độ chất hoạt tính enzyme đạt ½ vận tốc tối đa Biểu đồ 4.8 LINWEAVER- Burk plots hoạt động tyrosinase với chất LDOPA nồng độ dịch chiết đông trùng hạ thảo 50,200,400 800µg/ml 53 Bảng 4.13: Tổng hợp Ic50, mức độ ức chế, Km Vmax dịch chiết đông trùng hạ thảo dung mơi Dịch chiết ethanol Ethyl acetate IC 50 328,98µg 273,02µg ức chế 56,966% 59,212% Km(Mm) 3,3 2,6 0,123 0,254 Vmax (µmol min-1) 54 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Đông trùng hạ thảo chiết dung mơi ethanol có khả ức chế enzyme tyrosinase cao chiết dung môi ethyl acetate Dịch chiết có giá trị IC50 dung mơi ethanol ethy acetate 328,98 273,02 (µg/ml) Phần trăm ức chế 56,966 59,212% Giá trị đặc trưng cho ức lực enzyme với chất Km 3,3 (mM) 2,6(mM) Tốc độ phản ứng Vmax 0,123 (µmol min-1) 0,254(µmol min-1) 5.2 Kiến nghị Nghiên cứu thử nghiệm chuyên sau mức độ in vivo (mô hình tế bào B16F10 mơ hình cá ngựa) để nghiên cứu khả ức chế enzyme tyrosinase tốt 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng anh: Abdillahi, H.S., Finnie, J.F., Van Staden, J., 2011 Anti-inflammatory, antioxidant, anti-tyrosinase and phenolic contents of four Podocarpus species used in traditional med-icine in South Africa Journal of Ethnopharmacology Abuzaid, A.A., Hammad, D.M and Sharaf, E.M., 2015 Antioxidant and anticancer activity of Spirulina platensis water extracts International Journal of Pharmacology Akhtar, M.N., Sakeh, N.M., Zareen, S., Gul, S., Lo, K.M., Ul-Haq, Z., Shah, S.A.A., Ahmad, S., 2015 Design and synthesis of chalcone derivatives as potent tyrosinase inhibitors and their structural activity relationship Alam, M.N., Bristi, N.J., Rafiquzzaman, M., 2013 Review on in vivo and in vitro methods evaluation of antioxidant activity Ali Nawaz, Taha Shafi, Abdul Khaliq, Hamid Mukhtar, Ikram ul Haq Institute of Industrial Biotechnology, GC University Lahore, Pakistan (2017) Tyrosinase: Sources, Structure and Applications by Asieh Bahrami, Mahmud Tareq Hassan Khan, J Munoz-Munoz, F GarciaMolina,F Garcia-Canovas, and Ali Akbar Saboury (2019) A comprehensive review on tyrosinase inhibitors by Bradford, M.M., 1976 A rapid and sensitive method for the quantization of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding Burnett C L Bergfeld W F MD FACP Belsito D V MD Hill R A Klaassen C D Liebler D C Marks J G Jr MD Shank R C Slaga T J Snyder P W DVM and Andersen F A (2010) Final Report of the Safety Assessment of Kojic Acid as Used in Cosmetic International Journal of Toxicology, 29 pp 244S-273S Cengiz Sahin, S (2018) The potential of Arthrospira platensis extract as a tyrosinase inhibitor for pharmaceutical or cosmetic applications South African Journal of Botany, 119, 236–243 56 Duh, P D., Yen, D B and Yen, G C., 1992 Extraction and identification of an antioxidative component from edible oils Food Chemistry Miyake, T and Shibamoto, T., 1997 Antioxidative activities of natural compounds found in plants Journal of Agricultural Food Chemistry Mukherjee, P.K., Biswas, R., Sharma, A., Banerjee, S., Biswas, S., Katiyar, C.K (2018) Validation of medicinal herbs for anti-tyrosinase potential Journal of Herbal Medicine, S Cengiz Sahin in Molecular Biology and Genetic Department, Science and Arts Faculty, Pamukkale University, Denizli, Turkey)( 2017)The potential of Arthrospira platensis extract as a tyrosinase inhibitor for pharmaceutical or cosmetic applications Samaneh Zolghadri, Asieh Bahrami, Mahmud Tareq Hassan Khan, J MunozMunoz, F Garcia-Molina, F Garcia-Canovas, and Ali Akbar Saboury (2019) A comprehensive review on tyrosinase inhibitors Sevilay Cengiz Sahin (2019) Scenedesmus obliquus: A Potential Natural Source for Cosmetic Industry Sevilay Cengiz Sahin in Department of Molecular Biology and Genetics, Faculty of Science and Art, Pamukkale University, Denizli, Turkey (2019) Scenedesmus obliquus: A Potential Natural Source for Cosmetic Industry Yen, G.C., Chen, H.W and Duh, P.D., 1998 Extraction and identificaion of an antioxidative component from Jue Ming Zi (Cassia tora L.) Journal of Agricultural Food Chemistry Zolghadri, S., Bahrami, A., Khan, M.T.H., Munoz-Munoz, J., Garcia-Molina, F., Garcia-Canovas, F., Saboury, A.A (2019) A comprehensive review on tyrosinase inhibitors Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry, 34, 279–309 Tài liệu tiếng việt: Nguyễn Lê Anh Đào , Nguyễn Thị Cẩm Tiên Trần Minh Phú (2018) Ảnh hưởng dung mơi chiết tách đến hoạt tính chống oxy hóa cao chiết từ bột tảo Spirulina (Anthrospira platensis) 57 Nguyễn Khoa Hạ Mai, Nguyễn Thị Thanh Mai 11/07/2018 Hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase số thuốc Việt Nam hợp chất phân lập từ mít dai GS.TS Mai Xuân Lương (2015) Giáo trình Enzyme Phạm Quang Thu,2009 Nghiên cứu thành phần lồi nấm Đơng trùng hạ thảo Vườn Quốc gia Hoàng Liên, huyện Sa Pa, tỉnh Lào Cai Trần Thị Oanh(2015),Tài liệu chiết xuất dược liệu 58