Khóa luận tốt nghiệp đánh giá khả năng ức chế bệnh vàng lá gân xanh (candidatus liberibacter asiaticus) bằng kháng sinh trên một số giống cam tại quỳ hợp nghệ an

HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA NƠNG HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ BỆNH VÀNG LÁ GÂN XANH (Candidatus Liberibacter asiaticus) BẰNG KHÁNG SINH TRÊN MỘT SỐ GIỐNG CAM TẠI QUỲ HỢP - NGHỆ AN Giáo viên hướng dẫn : TS ĐOÀN THU THUỶ PGS.TS HÀ VIẾT CƯỜNG Sinh viên thực : NGUYỄN MẠNH HÙNG Mã sinh viên : 621736 Lớp : K62CGCT HÀ NỘI-2021 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu Các số liệu, kết nêu báo cáo hoàn toàn trung thực chưa sử dụng, công bố báo cáo, luận văn, luận án cơng trình nghiên cứu khoa học trước Tơi xin cam đoan thơng tin trích dẫn sử dụng luận văn ghi nguồn gốc rõ ràng, đảm bảo trích dẫn theo quy định Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm với lời cam đoan Hà Nội, ngày 15 tháng 11 năm 2021 Sinh viên Hùng Nguyễn Mạnh Hùng i LỜI CẢM ƠN Trong trình thực đề tài tốt nghiệp, nhận nhiều giúp đỡ động viên tận tình từ thầy cơ, gia đình bạn bè Trước hết, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy giáo PGS.TS Hà Viết Cường – Trưởng Bộ mơn Bệnh cây,TS Đồn Thu Thuỷ - Bộ môn Di truyền chọn giống, khoa Nông học – người trực tiếp hướng dẫn, dành nhiều cơng sức, thời gian, đóng góp ý kiến vô quan trọng tạo điều kiện để tơi thực hồn thành đề tài Trân trọng cám ơn tất thầy cô giáo Khoa Nông Học dạy dỗ, truyền đạt kiến thức để tơi hồn thành chương trình học tập đại học thực đề tài Tôi xin chân thành cám ơn cán nhân viên Trung tâm Nghiên cứu Bệnh nhiệt đới ln giúp đỡ động viên tơi hồn thành đề tài Cuối cùng, xin gửi lời cám ơn sâu sắc đến gia đình bạn bè người bên cạnh động viên, giúp đỡ tơi suốt q trình học tập thực khóa luận tốt nghiệp Một lần tơi xin chân thành cám ơn! Hà Nội, ngày 15 tháng 11 năm 2021 Sinh viên Hùng Nguyễn Mạnh Hùng ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii DANH MỤC VIẾT TẮT viii I, PHẦN MỞ ĐẦU 1.1, Đặt vấn đề 1.2 Mục đích yêu cầu 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Cây có múi 2.1.1 Lịch sử phân bố có múi 2.1.2 Giá trị sử dụng 2.1.3 Đặc điểm thực vật học 2.1.4 Các giống có múi Việt Nam 2.1.5 Tình hình sản xuất có múi Việt Nam vùng Phủ Quỳ 15 2.2 Bệnh vàng gân xanh có múi 17 2.2.1 Lịch sử phân bố bệnh 17 2.2.2 Vi khuẩn Candidatus Liberibacter 18 2.2.3 Triệu chứng 19 2.2.4 Truyền bệnh 21 2.2.5 Chẩn đoán bệnh vàng gân xanh 22 2.3 Phòng trừ bệnh HLB 24 iii 2.3.1 Kiểm dịch thực vật 24 2.3.2 Loại bỏ bệnh 25 2.3.3 Sử dụng trồng bệnh 25 2.4 Phòng chống vector 29 2.4.1 Biện pháp canh tác 29 2.4.2 Biện pháp sinh học 30 2.4.3 Biện pháp hoá học 30 2.5 Sử dụng kháng sinh kích kháng 30 PHẦN III: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38 3.1 Địa điểm thời gian 38 3.2 Vật liệu nghiên cứu 38 3.2.1 Hoá chất 38 3.2.2 Các thiết bị máy chủ yếu 38 3.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU: 38 3.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU: 39 3.4.1 Phương pháp xử lý thuốc 39 3.4.2 PHƯƠNG PHÁP ĐIỀU TRA TỶ LỆ BỆNH VÀNG LÁ GÂN XANH 40 3.4.3 PHƯƠNG PHÁP PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) 40 3.4.4 Phương pháp đánh giá tiêu sinh trưởng 42 3.4.5 Phương pháp xử lý số liệu 43 PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43 4.1 NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA XỬ LÝ THUỐC ĐẾN MỘT SỐ CHỈ TIÊU SINH TRƯỞNG VÀ CHẤT LƯỢNG QUẢ CỦA CAM TẠI PHỦ QUỲ - NGHỆ AN NĂM 2021 43 4.1.1 Ảnh hưởng xử lý thuốc đến số tiêu sinh trưởng đợt lộc giống Xã Đoài 43 iv 4.1.2 Ảnh hưởng xử lý thuốc đến số tiêu sinh trưởng đợt lộc giống Xã Đoài 46 4.1.3 Ảnh hưởng xử lý thuốc đến số tiêu sinh trưởng đợt lộc giống BH32 49 4.1.4 Ảnh hưởng xử lý thuốc đến số tiêu sinh trưởng đợt lộc giống BH32 51 4.1.5 Ảnh hưởng xử lý thuốc đến số tiêu sinh trưởng đợt lộc giống BH32 53 4.1.6 Ảnh hưởng xử lý thuốc đến số tiêu chất lượng giống Xã Đoài 56 4.2 Ảnh hưởng xử lý thuốc đến bệnh VLGX hai giống Xã Đoài BH 32 59 4.2.1 Xác định, kiểm tra, đánh giá vườn thí nghiệm Quỳ Hợp – Nghệ An 59 4.2.2 Kết đánh giá thí nghiệm phịng chống bệnh VLGX hai vườn cam Văn Lợi – Quỳ Hợp 62 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 69 5.1 Kết luận 69 5.2 Kiến nghị : 69 TÀI LIỆU THAM KHẢO 70 v DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1: Hiệu kháng sinh với vi khuẩn Las ( Nguồn : Effective Antibiotics against ‘Candidatus Liberibacter asiaticus’ 2014) 34 Bảng 3.2 Thành phần phản ứng PCR 41 Bảng 4.1 Ảnh hưởng xử lý thuốc đến tiêu sinh trưởng đợt lộc giống Xã Đoài 45 Bảng 4.2 Ảnh hưởng xử lý thuốc đến tiêu sinh trưởng đợt lộc giống Xã Đoài 48 Bảng 4.3 Ảnh hưởng xử lý thuốc đến tiêu sinh trưởng đợt lộc giống BH32 50 Bảng 4.4 Ảnh hưởng xử lý thuốc đến tiêu sinh trưởng đợt lộc giống BH32 52 Bảng 4.5 Ảnh hưởng xử lý thuốc đến tiêu sinh trưởng đợt lộc giống BH32 55 Bảng 4.6 Ảnh hưởng xử lý thuốc lên tiêu chất lượng giống Xã Đoài 58 Bảng 4.7: PCR mẫu hai vườn thí nghiệm Văn Lợi – Quỳ Hợp 60 Bảng 4.8: Ảnh hưởng xử lý thuốc đến biểu triệu chứng bệnh VLGX 68 vi DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 : Mẫu rễ bị nhiễm 20 Hình 2.2 : Mẫu nhiễm HLB 20 Hình 2.3: Rầy chổng cánh chụp vườn cam BH32 22 Hình 2.4: Cây có múi bị ảnh hưởng HLB xử lý công thức nano (A): Amp (trái) so với nước máy (CK) (phải); (B): Nano-1-Amp + Brij 35 (trái) so với nước máy (CK) (phải); (C): Nano-2-Amp + Brij 35 (trái) so với nước máy (CK) (phải) 37 Hình 4.1 Hình ảnh hai vườn thí nghiệm thí nghiệm hai giống Xã đoài (bên trái ) giống BH32 ( bên phải) 59 Hình 4.2 PCR (lần 1) phát Ca.Las cam cặp mồi OMPN5 OMP-N3m hai vườn thí nghiệm Văn Lợi -Quỳ Hợp M thang DNA kb Mũi tên băng sản phẩm PCR với kích thước 920 bp Số thứ tự giếng tương ứng số thứ tự trình bày Bảng 4.7 60 Hình 4.3: Triệu chứng hai vườn thí nghiệm Văn Lợi – Quỳ Hợp 61 Hình 4.4: Cây vườn thí nghiệm XĐ TN BH TN 61 Hình 4.5: Cây XĐ TN giống cam Xã Đoài trước xử lý thuốc ( bên trái ) sau xử lý thuốc lần ( bên phải ) 63 Hình 4.6 : Cây BH TN giống cam BH32 trước xử lý thuốc ( bên trái ) sau xử lý thuốc lần ( bên phải ) 63 Hình 4.7: Các cành lộc đối chứng không xử lý thuốc sau lần 64 Hình 4.8: Các cành lộc vườn cam Xã Đoài sau 15 tuần sau xử lý thuốc 64 Hình 4.8: Các cành lộc vườn cam BH 32 sau 15 tuần sau xử lý thuốc 65 Hình 4.9: Triệu chứng mẫu thu hai vườn thí nghiệm hai giống cam Xã Đồi BH 32 Văn Lợi – Quỳ Hợp 66 vii DANH MỤC VIẾT TẮT HLB Huanglongbinh VLGX Vàng gân xanh BVTV Bảo vệ thực vật Ca L Candidatus Liberibacter PCR Polymerase Chain Reaction Bộ NN-PTNT ATTP Nơng Nghiệp – Phát triển nơng thơn An tồn thực phẩm CTV Bệnh tàn lụi (Citrus tristeza closterovirus) RT - PCR Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction KDTV Kiểm dịch thực vật ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbant Assay OMP Outer membrain protein β-ME β - Mercaptoethanol l Microliter TAE Tris acetate EDTA Mg Miligram l Microliter Ml Mililiter Kb Kilo base TE Tris EDTA viii BẢN TĨM TẮT KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP Tên khoá luận : ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ BỆNH VÀNG LÁ GÂN XANH (Candidatus Liberibacter asiaticus) BẰNG KHÁNG SINH TRÊN MỘT SỐ GIỐNG CAM TẠI QUỲ HỢP - NGHỆ AN Giảng viên hướng dẫn : TS.ĐOÀN THU THUỶ PGS.TS HÀ VIẾT CƯỜNG Sinh viên thực : Nguyễn Mạnh Hùng Lớp : K62CGCT Khoá : 62 Mục đích đề tài : Đánh giá khả ức chế bệnh vàng gân xanh vi khuẩn biệt dưỡng Candidatus Liberibacter asiaticus (Ca.Las) số giống cam Quỳ Hợp – Nghệ An kháng sinh ampicillin phương pháp phun Phương pháp nghiên cứu : Phương pháp xử lý thuốc Phương pháp điều tra tỷ lệ bệnh Vàng gân xanh Phương pháp PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) Phương pháp đánh giá tiêu sinh trưởng Phương pháp xử lý số liệu Kết nghiên cứu : Xử lý thuốc không làm ảnh hưởng đến tiêu sinh lý trưởng gồm chiều dài cành lộc , số / cành lộc , độ dài đánh dấu , chiều dài đánh dấu ,đường kính lộc tiêu sinh trưởng gồm chiều cao , đường kính tiêu chất lượng , từ ta kết luận thuốc xử lý không gây độc cho Xử lý thuốc không làm ảnh hưởng đến tiêu sinh lý trưởng gồm chiều dài cành lộc , số / cành lộc , độ dài lá, chiều dài lá,đường kính ix 4.2 Ảnh hưởng xử lý thuốc đến bệnh VLGX hai giống Xã Đoài BH 32 4.2.1 Xác định, kiểm tra, đánh giá vườn thí nghiệm Quỳ Hợp – Nghệ An Mục tiêu thí nghiệm nhằm xác định mức độ nhiễm bệnh VLGX cam Quỳ Hợp xác định thí nghiệm phù hợp Giống cam sử dụng nghiên cứu giống cam Xã Đoài, độ tuổi năm giống cam BH32 độ tuổi năm , có biểu triệu chứng mạnh bệnh Vàng gân xanh Chúng tiến hành kiểm tra 20 vườn phát 20/20 vườn dương tính với VLGX ( 4.2) Sơ đồ bố trí thí nghiệm hai vườn thí nghiệm Văn Lợi – Quỳ Hợp bố trí tương tự Hình 4.1 Hình ảnh hai vườn thí nghiệm thí nghiệm hai giống Xã đồi (bên trái ) giống BH32 ( bên phải) 59 Hình 4.2 PCR (lần 1) phát Ca.Las cam cặp mồi OMPN5 OMP-N3m hai vườn thí nghiệm Văn Lợi -Quỳ Hợp M thang DNA kb Mũi tên băng sản phẩm PCR với kích thước 920 bp Số thứ tự giếng tương ứng số thứ tự trình bày Bảng 4.7 Bảng 4.7: PCR mẫu hai vườn thí nghiệm Văn Lợi – Quỳ Hợp STT Mẫu Triệu chứng 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 BHTN BHTN4 BHTN3 BHTN2 BHTN1 BHĐC BHĐC BHĐC BHĐC BHĐC XĐTN1 XĐTN2 XĐTN3 XĐTN4 XĐTN5 XĐĐC XĐĐC XĐĐC XĐĐC XĐĐC Có triệu chứng Có triệu chứng Có triệu chứng Có triệu chứng Có triệu chứng Có triệu chứng Có triệu chứng Có triệu chứng Có triệu chứng Có triệu chứng Có triệu chứng Có triệu chứng Có triệu chứng Có triệu chứng Có triệu chứng Có triệu chứng Có triệu chứng Có triệu chứng Có triệu chứng Có triệu chứng PCR DNA PCR CTAB + CTAB + CTAB + CTAB + CTAB + CTAB _ CTAB + CTAB + CTAB + CTAB + CTAB + CTAB + CTAB + CTAB + CTAB + CTAB + CTAB + CTAB + CTAB + CTAB + 60 PCR DNA PCR CTAB + CTAB + CTAB + CTAB + CTAB + CTAB + CTAB + CTAB + CTAB + CTAB + CTAB + CTAB + CTAB + CTAB + CTAB + CTAB + CTAB + CTAB + CTAB + CTAB + Các mẫu chiết CTAB , mẫu BH – ĐC có triệu chứng kiểm tra lần không phát vi khuẩn VLGX , kiểm tra lại lần phát , cịn mẫu khác cho kết dương tính với vi khuẩn VLGX từ lần đầu PCR Từ , cho thấy vi khuẩn VLGX xuất gây hại hai vườn thí nghiệm Văn Lợi – Quỳ Hợp Dựa kết kiểm tra PCR, kết luận bệnh VLGX Ca.Las phổ biến địa điểm thí nghiệm yếu tố quan trọng tác động đến sản xuất cam khu vực Hình 4.3: Triệu chứng hai vườn thí nghiệm Văn Lợi – Quỳ Hợp Hình 4.4: Cây vườn thí nghiệm XĐ TN BH TN 61 4.2.2 Kết đánh giá thí nghiệm phịng chống bệnh VLGX hai vườn cam Văn Lợi – Quỳ Hợp Thuốc kháng sinh sử dụng để chống lại bệnh vàng có múi đồng ruộng có hiệu chúng chống lại vi khuẩn Ca Las chứng minh qua số nghiên cứu trước Vì vi khuẩn Ca Las nằm mạch phloem , nên xử lý thuốc phun ướt đậm từ đến thân cành gốc Tôi tiến hành hai vườn thực địa hai giống Xã Đoài BH 32 để đánh giá khả ức chế vi khuẩn Ca Las kháng sinh ảnh hưởng với vi khuẩn VLGX Nồng độ kháng sinh phun vào 100 ppm , hồ lỗng 1000 lần => mL/L, kết hợp dung môi nồng độ 0.1 % , hịa lỗng 1000 lần => mL/L Tuy nhiên, kháng sinh dễ bị phân hủy tác động ánh nắng mặt trời rửa trôi mưa, ngày phun phù hợp để phun chiều muộn ngày không nắng nắng yếu tránh trường hợp kháng sinh bị phân hủy Các phun thuốc đánh dấu thời gian phun thuốc lần cách ngày liên tục phun tháng, phun tổng cộng lần Biểu triệu chứng sau phun : Sau tiến hành phun thuốc vườn, kiểm tra trước lần phun thuốc nhận thấy có thay đổi rõ rệt sau lần phun giống BH 32 lần phun giống Xã Đồi (hình 4.5 v Các cành lộc phát triển bình thường xanh , màu xanh đậm không thấy xuất triệu chứng bệnh VLGX Các đối chứng hai vườn thí nghiệm có khác , giống BH 32 triệu chứng bệnh VLGX giảm rõ rệt , vườn giống cam Xã Đoài , triệu chứng đối chứng có giảm khơng đáng kể (hình 4.7) Nhưng từ tuần thứ 15 sau phun , xử lý thuốc vườn cam Xã Đoài xuất trở lại triệu chứng , đặc biệt TN1 , biểu triệu chứng so với đối chứng khơng xử lý thuốc cịn thấp , khơng xử lý thuốc có biểu triệu chứng dội đợt lộc , xuất triệu chứng bệnh VLGX rụng Sau 15 tuần sau phun giống cam BH 32 , xử lý có lại xuất số xử lý thuốc cịn hai cịn lại khơng có triệu chứng , đối chứng khơng xử lý thuốc giống BH 32 có xuất triệu chứng tất không dội giống cam Xã Đồi 62 Hình 4.5: Cây XĐ TN giống cam Xã Đoài trước xử lý thuốc ( bên trái ) sau xử lý thuốc lần ( bên phải ) Hình 4.6 : Cây BH TN giống cam BH32 trước xử lý thuốc ( bên trái ) sau xử lý thuốc lần ( bên phải ) 63 BH ĐC XĐ ĐC XĐ ĐC Hình 4.7: Các cành lộc đối chứng không xử lý thuốc sau lần XĐ ĐC XĐ ĐC XĐ TN1 Hình 4.8: Các cành lộc vườn cam Xã Đoài sau 15 tuần sau xử lý thuốc 64 BH TN1 BH ĐC BH ĐC Hình 4.8: Các cành lộc vườn cam BH 32 sau 15 tuần sau xử lý thuốc Kết : 65 Hình 4.9: Triệu chứng mẫu thu hai vườn thí nghiệm hai giống cam Xã Đoài BH 32 Văn Lợi – Quỳ Hợp Kết thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng xử lý thuốc đến biểu bệnh VLGX Sau kết thúc thí nghiệm, mức độ biểu triệu chứng đánh giá dựa biểu triệu chứng vàng gân xanh cành lộc cành đánh dấu từ trước thí nghiệm Kết đánh giá trình bày Bảng Kết cho thấy thời điểm đánh giá (17 tuần sau phun lần cuối) tất thí nghiệm đối chứng biểu triệu chứng quan sát cành đánh dấu có 3/5 thí nghiệm biểu triệu chứng Khi đánh giá mức độ biểu triệu chứng dựa tỷ lệ cành lộc biểu triệu chứng kết thu cho thấy có khác biệt rõ rệt thí nghiệm đối chứng giống Trên giống BH32, tỷ lệ cành lộc 66 biểu triệu chứng 0.4 % thí nghiệm so với 1.8 % đối chứng Tương tự, giống cam Xã Đoài, tỷ lệ cành lộc biểu triệu chứng 2.9 % thí nghiệm 7.6 % đối chứng Kết phân tích thống kê Z-Test (bảng 4.8) cho thấy giá trị P (mức tin cậy 95%) giá trị trung bình tỷ lệ cành lộc biểu triệu chứng đánh giá công thức xử lý đối chứng không xử lý < 0.05, chứng tỏ xử lý thuốc ảnh hưởng tới tỷ lệ cành lộc biểu triệu chứng xử lý thuốc giống cam BH32 giống cam Xã Đoài Kiểm tra PCR với cặp mồi A2/J5 tất thí nghiệm đối chứng với DNA chiết nhanh phương pháp NaOH thấy đối chứng thí nghiệm có phản ứng dương tính với PCR chứng tỏ vi khuẩn cịn tồn thí nghiệm Dựa kết nghiên cứu kết luận xử lý cam bị bệnh VLGX kháng sinh ampicillin khơng tiêu diệt hồn tồn vi khuẩn đã làm giảm rõ rệt triệu chứng biểu Một kết luận quan trọng từ thí nghiệm silan hữu sử dụng hỗ trợ ampicillin xâm nhập vào cây, qua gợi ý biện pháp sử dụng kháng sinh phun lên có tiềm ứng dụng thực tiễn phòng trừ bệnh 67 Bảng 4.8: Ảnh hưởng xử lý thuốc đến biểu triệu chứng bệnh VLGX Số Tỷ lệ cành lộc biểu triệu chứng biểu Giống Công thức triệu chứng/số n (%) CI (9 5%) 3/5 2536 0.4 0.12 - 0.59 5/5 2436 1.8 1.24 - 2.29 5/5 2647 2.9 2.24 - 3.51 5/5 2382 7.6 6.57 - 8.71 P (α = 0.05) thí nghiệm Xử lý thuốc Đối chứng BH32 không xử lý Xử lý thuốc Xã Đối chứng Đồi khơng xử lý