Nghiên cứu đánh giá khả năng ức chế hoạt tính enzyme tyrosinase của dịch chiết gỗ mít (artocarpus heterophyllus) (khóa luận tốt nghiệp)

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ HOẠT TÍNH ENZYME TYROSINASE CỦA DỊCH CHIẾT GỖ MÍT (ARTOCARPUS HETEROPHYLLUS) Sinh viên thực : Đào Thị Thiên Nga Mã sinh viên : 610744 Lớp : K61CNSHB Giảng viên hướng dẫn : ThS Phí Thị Cẩm Miện Hà Nội, 2021 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết quả, hình ảnh, số liệu nghiên cứu sử dụng luận văn trung thực, chưa sử dụng báo cáo Tất thơng tin trích dẫn khóa luận rõ nguồn gốc giúp đỡ cảm ơn Tôi xin chịu trách nhiệm lời cam đoan trước Học viện Hội đồng Hà Nội, ngày 20 tháng 02 năm 2021 Sinh viên Đào Thị Thiên Nga i LỜI CẢM ƠN Sau kết thúc quãng thời gian thực tập Bộ môn Sinh học, Khoa Công nghệ Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam nhận nhiều quan tâm, bảo tận tình Thầy, cán phịng thí nghiệm Cùng với cố gắng, nỗ lực thân, học kinh nghiệm tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban chủ nhiệm khoa Cơng nghệ sinh học tồn thể Thầy, Cơ truyền đạt cho kiến thức chuyên ngành, kỹ việc phịng thí nghiệm học quý báu suốt thời gian học tập, rèn luyện Học viện Nông nghiệp Việt Nam Đặc biệt, xin gửi lời cảm ơn biết ơn sâu sắc tới Th.S Phí Thị Cẩm Miện, người hướng dẫn tận tâm, giải đáp thắc mắc câu hỏi giúp đỡ tơi nhiệt tình q trình làm thí nghiệm thu kết tốt Cuối cùng, với tất lịng kính trọng biết ơn vô hạn, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình người thân,bạn bè Thầy Cô luôn động viên, giúp đỡ, tạo động lực cho tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu q trình làm khóa luận Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 20 tháng 02 năm 2021 Sinh viên Đào Thị Thiên Nga ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii PHẦN I: PHẦN MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu yêu cầu đề tài 2.1 Mục tiêu 2.2 Yêu cầu đề tài 2.3 Ý nghĩa đề tài 2.3.1 Ý nghĩa khoa học 2.3.2 Ý nghĩa thực tiễn PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Đặc điểm thực vật loài Artocarpus heterophyllus Các hợp chất sinh học có Artocarpus heterophyllus Tổng quan nhóm chất Flavonoid 3.1 Giới thiệu nhóm chất Flavonoid 3.2 Phân loại nhóm chất Flavonoid 3.3 Ứng dụng Flavonoid Một số phương pháp định tính, định lượng hợp chất flavonoid 4.1 Một số phương pháp định tính hợp chất flavonoid 4.2 Một số phương pháp định lượng hợp chất flavonoid 10 Tổng quan enzyme tyrosinase 12 4.1 Giới thiệu enzyme tyrosinase 12 4.2 Tình hình nghiên cứu ứng dụng enzyme tyrosinase 14 4.2.1 Tình hình nghiên cứu enzyme tyrosinase 14 iii 4.2.2 Ứng dụng enzyme tyrosinase 15 4.3 Cơ chế hoạt động enzyme tyrosinase 15 4.4 Các nguồn sản sinh enzyme tyrosinase 17 4.5 Các chất có hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase 17 4.5.1 Hydroquinone 18 4.5.2 Alpha Arbutin 19 4.5.3 Kojic acid 19 4.5.4 Glycolic acid 20 4.5.5 Dịch chiết thực vật 20 4.5.6 Vi khuẩn nấm 21 4.6 Cơ chế hoạt động trình ức chế enzyme tyrosinase 21 4.6.1 Ức chế cạnh tranh 21 4.6.2 Ức chế không cạnh tranh kiểu thứ I 24 4.6.3 Ức chế không cạnh tranh kiểu thứ II 24 4.7 Các phương pháp đánh giá hoạt tính enzyme tyrosinase 24 4.7.1 Phương pháp in vitro 24 4.7.2 Phương pháp thử hoạt tính tế bào 25 4.8 Ý nghĩa việc nghiên cứu chất ức chế enzyme tyrosinase 25 4.9 Các nghiên cứu mít Việt Nam 26 PHẦN III ĐỘI TƯỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 Đối tượng, vật liệu, địa điểm thời gian nghiên cứu 30 1.1 Đối tượng, vật liệu nghiên cứu 30 1.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 30 1.3 Thiết bị, dụng cụ 30 Hóa chất 30 Nội dung nghiên cứu 31 Phương pháp nghiên cứu 31 iv 3.1 Đánh giá hiệu suất thu từ mẫu tách chiết 31 3.2 Định tính định lượng nhóm chất Flavonoid 34 3.2.1 Định tính Flavoloid 34 3.2.2 Xác định hàm lượng flavonoid tổng 35 3.3 Đánh giá khả ức chế enzyme tyrosinase từ dịch chiết gỗ mít 35 3.3.1 Chuẩn bị hoá chất 35 3.3.2 Chuẩn bị mẫu 37 3.3.3 Đánh giá khả ức chế enzyme tyroinase từ dịch chiết gỗ mít 38 3.3.4 Khảo sát ảnh hưởng chất trình ức chế enzyme tyrosinase 39 Xử lý số liệu 40 PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41 Đánh giá hiệu suất tách chiết từ mẫu khác 41 Định tính, định lượng flavonoid dịch chiết 41 Đánh giá khả ức chế enzyme tyrosinase từ dịch chiết gỗ mít 43 Đánh giá ảnh hưởng chất với trình ức chế enzyme tyrosinase 45 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47 5.1 Kết luận 47 5.2 Kiến nghị 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 v DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Các phương pháp định tính flavonoid (Nguyễn Viết Thân, 2020) Bảng 3.3 Thành phần pha đệm kali phosphate 35 Bảng 3.4 Nồng độ L-DOPA 36 Bảng 3.5 Thể tích pha loãng L-DOPA 36 Bảng 3.4 Nồng độ Arbutin 36 Bảng 3.5 Thể tích pha lỗng Arbutin 37 Bảng 3.6 Thể tích pha loãng cao chiết 37 Bảng 4.1 Kết tách chiết mẫu 41 Bảng 4.3 Kết mật độ quang trung bình sau lần đo 43 Bảng 4.4 Phần trăm ức chế IC 50 loại dịch chiết 43 Bảng 4.5 phần trăm ức chế IC 50 arbutin 44 Bảng 4.6 Kết đo mật độ quang nồng độ chất thay đổi 45 vi DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Cấu trúc hợp chất phân lập từ lõi mít dai Hình 2.2 Con đường Raper Mason hình thành hắc tố melanin 13 Hình 2.3 Q trình oxi hố tyrosine thành dopaquinone 16 Hình 2.4 Cơ chế hoạt động enzyme 16 Hình 2.5 Hydroquinone (HQ) 18 Hình 2.6 Alpha Arbutin 19 Hình 2.7 Kojic acid 20 Hình 2.8 Glycolic acid 20 Hình 2.5 Đường biểu diễn phương trình Lineweaver-Burk Plot 22 Hình 2.6 Đồ thị đảo ngược kép mô tả kiểu ức chế phản ứng enzyme 23 Hình 3.1 Rễ cành mít dai (Aryocarpus heterophyllus) 30 Hình 3.2 Musroom tyrosinase 31 Hình 3.2 Bộ chiết soxhlet 32 Hình 3.3 Cấu tạo chiết soxlet 33 Hình 3.3 Cô đuổi dung môi 34 Hình 3.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm đĩa 96 giếng 39 Biểu đồ 4.1 Khả ức chế enzyme tyrosinase dịch chiết 44 Biểu đồ 4.3 Khả ức chế hoạt tính enzyme tyrosinase arbutin 45 Biểu đồ 4.4 Lineweaver-Burk Plot enzyme mushroom tyrosinase LDOPA với 46 vii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT L-DOPA 3,4-dihydroxyphenylalanine TYR Tyrosinase DHM Dihydromyricetin AGE Angelicae Gigantis Radix HQ Hydroquinone TYRP1 tyrosinase-related protein TYRP2 tyrosinase-related protein A.heterophyllus Aryocarpus heterophyllus viii PHẦN I: PHẦN MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Hắc tố (melanin) thuật ngữ chung dành cho nhóm sắc tố tự nhiên tìm thấy hầu hết sinh vật Melanin sản xuất qua q trình oxy hóa amino acid tyrosine, theo sau trùng hợp hóa học Sắc tố sản xuất nhóm chun mơn tế bào gọi tế bào biểu bì tạo hắc tố Trong da, hình thành hắc tố xảy sau tiếp xúc với xạ tia cực tím, khiến da chuyển màu rám nắng Melanin chất hấp thụ ánh sáng hiệu quả, sắc tố tiêu tan 99,9% tia UV hấp thụ Tyrosinase (monophenol, o-diphenol: oxy oxidoreductase, EC (1.14.18.1) enzym tạo đồng xúc tác trình o-hydroxyl hóa monophenol q trình oxy hóa o-diphenol thành quinon (Claudia POPA) Trong ánh sáng mặt trời có chứa tia UV Khi tia UV tiếp xúc với da, tế bào biểu bì tạo hắc tố da (melanocytes) nằm lớp tế bào đáy biểu bì bị kích thích tạo enzyme tyrosinase sản sinh melanin chống lại Melanin sắc tố bảo vệ da, sắc tố định màu da, mắt, tóc người Melanin bị tích luỹ nhiều da dễ gây nám da, sạm da làm ảnh hưởng tới thẩm mỹ Để giảm thiểu ảnh hưởng không mong muốn melanin, cần ức chế hoạt tính enzyme tyrosinase Trong sống đại ngày nay, người phụ nữ ngày quan tâm tới việc chăm sóc sắc đẹp thân Các sản phẩm làm đẹp liên tục tung thị trường để thoả mãn mong muốn người dùng, sản phẩm chăm sóc da Làn da sau ngày chịu tác động nắng, gió, bụi, mỹ phẩm dễ xuống sắc cách nhanh chóng Khn mặt nơi hứng chịu nhiều yếu tố khiến da mặt xuống cấp nhanh vùng khác nhiều Các chị em có nhu cầu tìm kiếm sản phẩm có hiệu bảo vệ tốt với da lại thân thiện với môi trường Hiện nay, Hydroquinone (HQ) hợp chất hữu sử dụng nhiều để làm sáng da Chất có cơng dụng hiệu việc làm trắng điều trị vấn đề tăng sắc tố da HQ hoạt động cách hạn chế làm giảm melanocytes (tế bào hắc tố sản sinh melanin) da Tuy nhiên, HQ lại có nhiều tác dụng phụ Nếu Bảo quản L-DOPA sau pha: L-DOPA bảo quản ống phancon, xung quanh giấy bạc kín, bảo quản phòng lạnh, tối Bảng 3.4 Nồng độ L-DOPA Thành phần Lượng cân (g) Thể tích pha (ml) Nồng độ stock (mM) L-DOPA 0.01 10 Pha loãng L-DOPA thành nồng độ 1, 2, 4, 5mM Bảng 3.5 Thể tích pha loãng L-DOPA Nồng độ (mM) Stock (ml) Nước cất (ml) Thể tích (ml) 0.2 1.8 2 0.4 1.6 0.8 1.2 1 Arbutin pha nước cất Arbutin dùng để làm chất đối chứng dương, nồng độ arbutin gốc pha 100 mM, nồng độ tham gia phản ứng 100, 200, 500 600µM Bảo quản Arbutin sau pha phòng lạnh Bảng 3.4 Nồng độ Arbutin Thành phần Lượng cân (g) Thể tích pha (ml) Nồng độ stock Arbutin 0,05 1,8 100 mM Để pha arbutin từ dung dịch gốc 100mM thành 1ml dung dịch Arbutin nồng độ 10mM sử dụng làm nồng độ gốc phụ cần thực qua hai bước Bước đầu tiên, từ dung dịch gốc có nồng độ 100mM, hút 0,1ml arbutin 100mM cho vào ống eppendoff, sau đẩy bổ sung thêm 0.9ml nước cất có 1ml dung dịch Arbutin có nồng độ gốc phụ 10mM Tiếp theo dung dịch gốc phụ 10mM pha nồng độ phản ứng 100, 200, 500, 600μM theo số liệu bảng 36 Bảng 3.5 Thể tích pha lỗng Arbutin Nồng độ(μM) Arbutin 10mM (μl) Nước cất (μl) Tổng thể tích 500 50 950 1000 200 20 980 1000 100 10 990 1000 50 15 995 1000 (μl) Pha loãng enzyme tyrosinase Trong q trình pha mushroom tyrosinase ln phải có khay đá bên cạnh enzyme tyrosinase sau pha xong cần bảo quản tức nhiệt độ lạnh để tránh xảy biến tính Mushroom tyrosinase có khối lượng 3,49mg tương đương với 25kU Mushroom tyrosinase pha đệm kali photphase 0,1 M pH=6.8 Hịa tan hồn toàn 3,49 mg enzyme mushroom tyrosinase ml đệm, sau chia vào ống eppendof 1,5 ml, ống đựng ml enzyme 5000 units/ml ( dung dịch gốc) Tiếp theo, hút 0,2 ml dung dịch enzyme gốc 5000 units/ml vào ống eppendoff thêm tiếp 0,8 ml dung dịch đệm, ml dung dịch enzyme 1000 units/ml (dung dịch tham gia phản ứng) 3.3.2 Chuẩn bị mẫu Lấy 100 mg cao chiết pha 100ml DMSO ta thu dung dịch gốc có nồng độ 1000µg/ml Dùng dung dịch gốc vừa thu pha dung dịch đệm thành nồng độ phản ứng 50, 100, 200, 500µg/ml theo bảng Bảng 3.6 Thể tích pha lỗng cao chiết Nồng độ Dung dịch gốc Đệm Thể tích thu (ml) (µg/ml) (ml) (ml) 50 19 20 100 18 20 200 16 20 500 10 10 20 37 3.3.3 Đánh giá khả ức chế enzyme tyroinase từ dịch chiết gỗ mít Để khảo sát khả ức chế, ta tiến hành nghiên cứu phản ứng enzyme tyrosinase, chất L-DOPA dịch chiết dược liệu nồng độ khác Từ kết đo độ hấp thụ huỳnh quang bước sóng 492nm, ta tính phần trăm ức chế enzyme tyrosinase loại dược liệu Sau xác định phần trăm ức chế enzyme tyrosinase, lấy sở để phân tích tìm giá trị IC50 ( khả ức chế 50% enzyme tyrosinase dung dịch chứa hợp chất) nồng độ tốt để hợp chất có dược liệu đạt ½ khả ức chế Sử dụng arbutin làm chất đối chứng dương để so sánh khả ức chế Giá trị phần trăm ức chế ( %Inbihition) tính tốn thơng qua biểu thức sau: %Inbihition= Ađối chứng(-)-A mẫuA đối chứng(-) x 100% Trong : A đối chứng (-) : giá trị mật độ quang dung dịch khơng có mẫu thử A mẫu: giá trị mật độ quang dung dịch có mẫu thử Bố trí thí nghiệm: Hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase đo phương pháp quang phổ sử dụng máy đo quang ELISA Thí nghiệm bố trí 15 giếng với bốn hàng dọc Hàng gồm giếng, giếng có đệm gọi giếng blank, giếng thứ hai chứa chất với đệm, giếng thứ ba bao gồm enzyme tyrosinase, chất đệm sử dụng làm đối chứng âm Hàng dọc thứ hai( giếng thứ tư đến giếng thứ bảy) , bao gồm chất, enzyme tyrosinase dung dịch rễ mít xếp theo dải nồng độ nhỏ từ xuống 50, 100, 200, 500µg/ml Hàng dọc thứ thứ ( giếng thứ tám đến giếng 15) tương tự hàng thứ thay dung dịch rễ mít dung dịch cành mít Hàng dọc cuối ( giếng 16-19 ) cuối gồm có chất, enzyme tyrosinase dung dịch arbutin chất đối chứng dương Sơ đồ thí nghiệm thể trơng bảng đây, số giếng ký hiệu G x 38 G0 G4 G8 G 12 G1 G5 G9 G 13 G G G 10 G 14 G G G 11 G 15 Hình 3.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm đĩa 96 giếng Dựa sơ đồ,thí nghiệm thực theo bước sau Đầu tiên, hút 100µl dung dịch chứa hợp chất cần xác định hoạt tính ức chế tyrosinase từ cành rễ mít với dải nồng độ từ 50 đến 500 μg/ml vào đĩa 96 giếng Thêm tiếp 100 μl dung dịch tyrosinase (1000U/ml), ủ phút 37°C Tiếp bổ sung 100 μl dung dịch L-DOPA 5mM trộn giếng, ủ máy ELISA nhiệt độ 37°C 30 phút đo bước sóng 492nm Mẫu đối chứng âm, thay 100μl dịch chiết thành đệm phosphate 0.1M Đối chứng dương, thay 100μl dịch chiết thành arbutin acid nồng độ tương ứng Mỗi phép đo lặp lại lần để lấy giá trị trung bình Phần trăm ức chế tyrosinase tính theo cơng thức: % Ức chế = (A-B)/A ×100 Trong đó: A: độ hấp thụ 492nm khơng có chất ức chế tyrosinase B: độ hấp thụ 492nm có chất ức chế tyrosinase Hồn thành thí nghiệm tìm giá trị phần trăm ức chế loại hợp chất nồng độ khác Từ xây dựng đồ thị đương chuẩn axit arbutin dung dịch chứa hợp chất ức chế Giá trị ức chế ½ hay IC 50 xác định dựa vào nồng độ ức chế đạt 50% Mức độ ức chế so sánh với axit arbutin 3.3.4 Khảo sát ảnh hưởng chất trình ức chế enzyme tyrosinase Ta tiến hành xác định sơ chế tác dụng hoạt chất tiềm dựa việc xây dựng đồ thị Lineweaver - Burk với nồng độ chất thay đổi Thí nghiệm 39 tiến hành phần phương pháp khảo sát đánh giá khả ức chế enzyme tyrosinase nồng độ chất thay đổi 1, 2, mM Nồng độ dịch chiết mít arbutin đựợc giữ ngun 200µg/ml Từ kết đo mật độ quang mẫu thử mẫu chứng nồng độ chất khác ta vẽ đồ thị thể quan hệ nồng độ chất tốc độ phản ứng (tốc độ phản ứng thể thông qua mật độ quang) Thông qua giá trị mật độ quang L-DOPAquinon đo ta xây dựng đồ thị Lineweaver - Burk biểu diễn giá trị 1/ΔOD (1/V0) theo 1/(S) (ΔOD = OD TT – OD TK) Dựa vào điểm giao đồ thị đường thẳng thể quan hệ nồng độ chất tốc độ phản ứng nồng độ chất thay đổi để kết luận chất thử ức chế tyrosinase theo chế Lehninger Michael xác định có bốn chế ức chế enzyme tyrosinase là: cạnh tranh, không cạnh tranh, chế hỗn hợp hỗn hợp không cạnh tranh Xử lý số liệu Số liệu xử lý Microft Exel 2013 phần mềm Tanle Curve 2D 20.0 40 PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Đánh giá hiệu suất tách chiết từ mẫu khác Sau tách chiết đuổi dung mơi, ta có bảng đánh giá khả tách chiết loại dung môi sau Bảng 4.1 Kết tách chiết mẫu Mẫu STT Dung môi Nước cất o Ethanol 96 Ethyl acetat Khối lượng mẫu Khối lượng (g) chiết (g) Bột rễ 10 0.186 Bột cành 10 0.173 Bột rễ 10 0.404 Bột cành 10 0.397 Bột rễ 10 0.375 Bột cành 10 0.359 cao Từ kết tách chiết, ta thấy tách chiết ethanol 96o tối ưu dung môi thử nghiệm nước cất, ethanol 96o ethyl acetat Khối lượng cao chiết chiết rễ cành ethanol 4.04g 3.97g, gấp khoảng 2.5 lần chiết dung môi nước nhiều chiết ethyl acetat 0,29g, 0.38g khối lượng mẫu Khối lượng cao chiết thu mẫu bột rễ cao bột cành khoảng 0.070.13g Khối lượng cao chiết thu cô đuổi dung môi ethanol cao nên e dịch chiết bột rễ bột cành dung mơi ethanol 96o để làm thí nghiệm Định tính, định lượng flavonoid dịch chiết 41 Sau cho 50 µL dd cao chiết phản ứng với 500 µL NH OH Ta thấy dung dịch chuyển sang màu màu vàng sậm Chứng tỏ dung dịch có chứa nhiều flavonoid Bảng 4.2 Định tính hàm lượng flavonoid có cao chiết Nước cất Ethanol 96% Ethyl acetat Bột rễ + +++ ++ Bột cành + +++ ++ Cao chiết từ gỗ mít dai có chứa flavonoid Cao chiết dung mơi ethanol thử với NH OH có màu vàng đậm so với cao chiết dung môi nước ethyl acetat Dựa theo kết lần đo OD, ta lập đồ thị đường chuẩn quercetin Biểu đồ 4.1 Đồ thị đường chuẩn quercetin Dựa vào phương trình đường chuẩn quercetin: y = 0,0134x + 0,017 để tính hàm lượng flavonoid tổng theo cơng thức: F = c x V/m 42 Trong đó: F: hàm lượng flavonoid tổng; c: giá trị x từ đường chuẩn với quercetin (mg/mL); V: thể tích dịch chiết (mL); m: khối lượng cao chiết có thể tích V (g) Bảng 4.3 Kết hàm lượng flavonoid tổng dịch chiết rễ, cành mít Khối lượn g Hàm Dung môi Ethanol 96o lượng cao chiết (g) flavonoid (mg) Bột rễ 4.04 44.55 Bột cành 3.97 45.84 Từ bảng 4.3 ta thấy, với dung mơi ethanol 96o hàm lượng flavonoids có bột cành lớn bột rễ Đánh giá khả ức chế enzyme tyrosinase từ dịch chiết rễ mít 3.1 Đánh giá khả ức chế enzyme tyrosinase từ dịch chiết rễ mít Sau q trình tiến hành thí nghiệm, kết thu xử lý phần mềm exel thể bảng 4.4 Kết cho thấy nồng độ dịch chiết tăng dần giá trị OD bước sóng 492nm giảm dần Bảng 4.4 Kết mật độ quang trung bình sau lần đo Nồng độ (µg/ml) OD (492nm) Rễ 50 100 200 500 1.6018 1.5589 1.4803 1.1449 cành 1.6351 1.5952 1.5128 1.1717 Từ bảng 4.4 ta thấy nồng độ dịch chiết cao khả ức chế enzyme tyrosinase mạnh Điều thể số OD đo 492nm giảm dần nồng độ dịch chiết tăng dần Dịch chiết từ rễ có khả ức chế tốt dịch chiết từ cành khơng có chênh lệch nhiều Dựa vào kết đo mật độ quang bảng 4.4, ta tìm phần trăm ức chế hai loại dịch chiết nồng độ tìm kết IC 50 43 Bảng 4.5 Phần trăm ức chế IC 50 loại dịch chiết Nồng độ (µg/ml) Phần trăm ức chế (%) 50 Rễ 100 200 500 15.04 17.31 21.48 39.27 cành 13.27 15.39 19.76 37.85 IC 50 5.98 Lấy sở từ bảng 4.5, phần trăm ức chế hai mẫu dịch chiết ứng với nồng độ thể biểu đồ Biểu đồ 4.2 Khả ức chế enzyme tyrosinase dịch chiết Qua kết bảng 4.5 biểu đồ 4.2, ta thấy nồng độ chất ức chế khơng thay đổi 500µg/ml, hai loại dịch chiết dịch chiết từ rễ đạt giá trị phần trăm ức chế cao 39,27% Kết khả ức chế hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase giá trị IC 50 chất đối chứng dương thể bảng Bảng 4.5 phần trăm ức chế IC 50 arbutin Nồng độ arbutin (%) 50 Phần trăm ức chế (%) 14.46 IC 50 100 200 17.58 20.86 24.17 372.21 44 500 Biểu đồ 4.3 Khả ức chế hoạt tính enzyme tyrosinase arbutin Từ kết bảng 4.5 biểu đồ 4.3 thấy nồng độ arbutin phần trăm ức chế enzyme tyrosinase tỷ lệ thuận với Nồng độ arbutin lớn phần trăm ức chế lớn ngược lại 3.2 Đánh giá ảnh hưởng chất với trình ức chế enzyme tyrosinase K m gọi số Michelis Menten, đặc trưng cho enzyme K m đặc trưng cho lực enzyme với chất, K m có trị số nhỏ lực enzyme với chất lớn, nghĩa vận tốc phản ứng enzyme xúc tác lớn Qua trình nghiên cứu thí nghiệm cách giữ nguyên nồng độ dung dịch chứa hợp chất ức chế 200µg/ml thay đổi nồng độ chất, kết đo quang sau lặp lại hai lần thí nghiệm thể bảng 4.6 Bảng 4.6 Kết đo mật độ quang nồng độ chất thay đổi Nồng độ (mM) Mật độ quang dịch chiết rễ Mật độ quang dịch chiết cành 0.7978 0.7015 0.7393 0.6984 0.8739 0.7984 0.8851 0.8261 1.1013 1.0563 1.0934 0.9487 1.1754 1.0561 1.1495 1.0245 45 Từ bảng 4.6, ta thấy nồng độ chất ức chế 200µg/ml, nồng độ chất lớn khả ức chế nhỏ, mật độ quang đo lớn Thông qua giá trị mật độ quang DOPAquinon đo ta xây dựng đồ thị Lineweaver - Burk biểu diễn giá trị 1/ΔOD (1/V0) theo 1/(S) Biểu đồ 4.4 Lineweaver-Burk Plot enzyme mushroom tyrosinase L-DOPA với chất ức chế dịch chiết mít nồng độ 200µg/ml Qua trình xử lý số liệu, giá trị K m dịch chiết gỗ mít thu K m = 1.301 Nhìn vào biểu đồ 4.4, ta xác định cố định chất ức chế nồng độ 200µg/ml q trình chuyển hóa chất L-DOPA diễn có chất ức chế trình ức chế cạnh tranh 46 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận 1.1 Đánh giá hiệu suất tách chiết từ mẫu khác Nghiên cứu khẳng định dịch chiết gỗ mít Artocarpus heterophyllus loại dược liệu tự nhiên có khả ức chế hoạt tính enzyme tyrosinase Dịch chiết gỗ mít chiết phương pháp soxhlet dung môi ethanol thu khối lượng cao chiết 4.04g 3.97g, tối ưu chiết dung môi nước cất ethyl acetat Dịch chiết từ bột rễ thu nhiều cao chiết sau cô đuổi dung môi dịch chiết thu từ tách chiết bột cành khoảng 0.07-0.13g 1.2 Định tính, định lượng flavonoid dịch chiết Hàm lượng flavonoid có dịch chiết dung môi ethanol 96o 44-46 mg/g 1.3 Đánh giá khả ức chế enzyme tyrosinase từ dịch chiết rễ mít Dịch chiết gỗ mít dung mơi ethanol có số IC 50 5.98 µM Khảo sát cho thấy hợp chất tách chiết từ dịch chiết gỗ mít Artocarpus heterophyllus hợp chất ức chế cạnh tranh với giá trị K m dịch chiết gỗ mít thu K m = 1.301 Qua nghiên cứu thử nghiệm khả ức chế enzyme tyrosinase từ dịch chiết gỗ mít Artocarpus heterophyllus ức chế tốt enzyme tyrosinase Kiến nghị Chúng tơi có số đề nghị sau: • Khảo sát với lượng mẫu lớn để có kết tốt • Nghiên cứu phương pháp dung mơi tách chiết khác • Xác định hàm lượng flavonoid tổng phương pháp khác để tăng thêm độ xác • Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm flavonoid vào lĩnh vực thực phẩm, y học… để tận dụng nguồn phế phẩm đạt tính kinh tế 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO Ali Nawaz, Taha Shafi, Abdul Khaliq, Hamid Mukhtar, Ikram ul Haq; Tyrosinase: Sources, Structure and Applications, Int J biotech & bioeng 3:5, 142-148, 2017 DOI: 10.25141/2475-3432-2017-5.0135 Antonio Rescigno, Francesca Sollai, Brunella Pisu, Augusto Rinaldi and Enrico Sanjust; Tyrosinase Inhibition: General and Applied Aspects, Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry, Vol 17 (4), pp 207–218, 2002 DOI: 10.1080/14756360210000010923 Chao Niu , Haji A Aisa; Upregulation of Melanogenesis and Tyrosinase Activity: Potential Agents for Vitiligo, 2017 Aug 4;22(8):1303 DOI: 10.3390/molecules22081303 Claudia POPA, Gabriela BAHRIM; Streptomyces tyrosinase: Production and practical Applications, Innovative Romanian Food Biotechnology Vol 8, Issue of March, 2011 Concepcion Olivares and Francisco Solano; New insights into the active site structure and catalytic mechanism of tyrosinase and its related proteins, Pigment Cell Melanoma Res 22; 750–760, September 2009 DOI: 10.1111/j.1755- 148X.2009.00636.x Gerardo M Casañola-Martin, Huong Le-Thi-Thu, Yovani Marrero-Ponce, Juan A Castillo-Garit, Francisco Torrens, Antonio Rescigno, Concepción Abad and Mahmud Tareq Hassan Khan; Tyrosinase Enzyme: An Overview on a Pharmacological Target, Current Topics in Medicinal Chemistry, 14, 1494-1501 2014 DOI: 10.2174/1568026614666140523121427 Jun Li, Zhenyu Lin, Xudong Tang, Guo Liu, Yunjiao Chen, Xiaoxiang Zhai, Qingrong Huang, Yong Cao; Oxyresveratrol extracted from Artocarpus heterophyllus Lam inhibits tyrosinase and age pigments in vitro and in vivo, 2020 DOI: 10.1039/d0fo01193b Nadia Salem Alrawaiq, Azman Abdullah; A Review of Flavonoid Quercetin: Metabolism, Bioactivity and Antioxidant Properties, 2014 48 Om Prakash, Rajesh Kumar, Anurag Mishra,Rajiv Gupta; Artocarpus heterophyllus (Jackfruit): An Overview, Phcog Rev Vol, 3, Issue 6, 353-358, 2009 10 R Kamakshi; Fairness via formulations: A review of cosmetic skin-lightening ingredients, J Cosmet Sci., 63, 43–54 2011 11 Samaneh Zolghadri, Asieh Bahrami, Mahmud Tareq Hassan Khan, J MunozMunoz, F Garcia-Molina, F Garcia-Canovas & Ali Akbar Saboury; A comprehensive review on tyrosinase inhibitors, Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry, vol 34, no 1, 279–309 03 Jan 2019 DOI: 10.1080/14756366.2018.1545767 12 Te-Sheng Chang; Natural Melanogenesis Inhibitors Acting Through the DownRegulation of Tyrosinase Activity, Materials 2012, 5, 1661-1685 DOI:10.3390/ma5091661 13 Toshiya Masuda,Y Daiki Yamashita, Yoshio Takeda, And Shigetomo Yonemori; Screening for Tyrosinase Inhibitors among Extracts of Seashore Plants and Identification of Potent Inhibitors from Garcinia subelliptica, 2004 DOI: 10.1271/bbb.69.197 14 Yi-Ming Tao, Le-Yi Yao, Qiu-Yan Qin, Wang Shen; Purification and characterization of polyphenol oxidase from jackfruit (Artocarpus heterophyllus) bulbs, 2013 DOI: 10.1021/jf403828e 15 Yoon-Soo Cindy Bae-Harboe and Hee-Young Park; Tyrosinase: A Central Regulatory Protein for Cutaneous Pigmentation, Journal of Investigative Dermatology (2012) 132, 2678–2680 DOI:10.1038/jid.2012.324 16 Sung-yum Seo,Vinay K Sharma, and Niti Sharma; Mushroom Tyrosinase: Recent Prospects, J Agric Food Chem 2003, 51, 2837−2853 17 Zong-Ping Zheng, Yang Xu, Chuan Qin, Shuang Zhang, Xiaohong Gu, Yingying Lin, Guobin Xie, Mingfu Wang, Jie Chen; Characterization of antiproliferative activity constituents from Artocarpus heterophyllus, 2014 DOI: 10.1021/jf500159z 18 Đoàn Văn Huyền; Bệnh rám má: tổng quan bệnh nguyên điều trị, 2019 49 19 Nguyễn Chí Bảo; Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học mít chay (Artocarpus gomezianus wall.) Tạp chí Khoa học Đại học Huế, Tập 97, Số 9, năm 2014 20 Nguyên Khoa Hạ Mai, Nguyễn Thị Thanh Mai; Hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase số thuốc Việt Nam hợp chất phân lập từ mít dai, 2018 21 Nguyễn Quốc Tuấn; Xây dựng phương pháp định tính, định lượng flavonoid nụ vối, 2012 22 Nguyễn Thanh Nhật Phương, Phạm Tấn Phương, Nguyễn Hồng Trí Tài, Trần Hồng Đức Nguyễn Đức Độ; Khảo sát hàm lượng flavonoid, alkaloid khả kháng khuẩn cao chiết cỏ mần trầu (Eleusine indica), Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Tập 53, Phần B, trsng 54-60, 2017 DOI:10.22144/ctu.jvn.2017.157 23 Nguyễn Viết Thân; Bộ sách thuốc việt nam thuốc thường dùng, Nhà xuất Y học, 2020 24 Phạm Thế Hải, Ninh Bảo Yến, Đỗ Thị Nguyệt Quế, Lê Thị Thu Hường, Nguyễn Thị Hương Giang, Vũ Đức Lợi, Bùi Thanh Tùng; Sàng lọc hợp chất có tác dụng ức chế enzym tyrosinase phương pháp in silico - in vitro, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 33, Số 1, trang 12-18, 2017 25 Võ Thị Kiều Ngân, Nguyễn Thị Ngọc Mai, Nguyễn Thanh Hoàng, Trần Hồng Đức Nguyễn Đức Độ, Khảo sát hàm lượng phenolic tổng, flavonoid tổng, hoạt tính chống oxy hóa hoạt tính kháng khuẩn cao chiết ethanol methanol thân rễ cỏ tranh (Imperata cylindrica), Tap chí Khoa hoc Trường Đại học Cần Thơ Tập 52, Phần B, trang 16-22, 2017 DOI:10.22144/ctu.jvn.2017.119 26 Vũ Thị Ái Xuân, Lê Minh Tấn, Hà Cẩm Anh; Tối ưu hóa trích ly cao chiết có hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase từ Persicaria pulchra (Bl.) Soják phương pháp bề mặt đáp ứng, Tạp chí Phát triển Khoa học Công nghệ – Kĩ thuật Công nghệ, 3(4):558-568, 2020 DOI :10.32508/stdjet.v3i4.692 50