thực hành hóa sinh học 2001

Cán bộ phụ trách thực hành ró thể lựa chọn các bài của các phần như: cách tính toán các loại nồng độ, xử lý mẫu thí nghiệm, phuđng pháp so màu, phưdng pháp quang phổ kế, định lưỢng gluxi

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HẢ NỘI

Mục lục • ■

Mục lục 3

Lời nói đ ầ u 7

Chưofng 1 Hoá c h ấ t và d u n g d ịc h 9

I Khái niệm về hoá ch ất 9

II Dung dịch 13

III Nồng độ dung dịch 14

IV Pha dung dịch tiêu chuẩn để chuẩn độ 22

V Cách tứứi hệ sô' điểu chỉnh 25

VI Bài tậ p 26

Chư</ng 2 Phương p h áp lấy m ẫu phân tíc h 29

I Lấy mẫu 29

II Chuẩn bị mẫu phân tích 31

III Cố định m ẫu 31

Chương 3 Phương pháp so m ầ u 34

I Phưđng pháp so màu 34

II Định luật Lambert-Beer 35

III Màu dung dịch và chọn bước sóng ánh sáng (hay chọn kùứi lọc m àu) 37

Chương 4 PhưcAig pháp quang phổ kế 43

I Hấp thụ tử ngoại của các loại cuvet khác nhau 44

II Quang phổ hấp thụ tử ngoại của NAD* và NADH 44

III ưốc tính khối lượng NADH 45

Chương 5 Đinh lưdng gluxit 46

I Định lượng đưòng khử theo phương pháp Bertrand 46

II Định lượng đường khử theo phưdng pháp vi lượng của Rodzevich 50

III Định lưỢng glucozđ trong máu bằng phương pháp Nelson 52

IV DỊnh lương fixictozđ trong đung dịch có lẫn đưòng khử khác 53

V Định lượng đưòng khử bằng phưdng pháp axit dinitro-salicyKc (DNS) 55

VI Định ỉưđng sacarozơ theo phương pháp thuỷ phân bằng axit 56

VII EHnh lượng tinh bột theo phưdng pháp thuỷ phần bằng axit 57

VIII Định lượng xenlulozơ 59

IX Định lưdng pectin bằng phưdng pháp canxi pectat 60

X Định lượng đextrin bằng phưdng pháp kết tủa với cồn 61

Chương 6 Định lượng lipỉt 63

I Định lượng lipit bằng máy Soxhlet 63

II Xác định các chỉ sô' của lipit 66

Chương 7 Định lưỢng axit amin và protein 72

I Đ ịn h lư d n g a x it a m in bằng phưdng p h áp c h u ẩ n độ formol (phướng pháp Sorensen) 1 .! * 72

II Đinh lượng axit amiĩi bằng ninhiđrin 74

III Định ỉượng axit amin nhờ tạo thành phức chất vối đồng (Phương pháp Popt? và Stevens) 76

IV Đinh lượng nitđ bằng phưđng pháp Kjeldahl 78

V Đ ịn h lư ợ n g p ro te in b ằn g phương p h áp Lovviry 83

VI Đ ịn h lư ợng p ro te in tổ n g số, alb u m in và globulữi tro n g h u y êt th a n h m áu bằng phưdng pháp Biiure 84

VII Đinỉi lượng protein bằng Coomasie Brilliant Blue G-250 86

VIII Đinh ỉướng protein bằng phương pháp quang phổ 89

Chương 8 Định lưctag axit nucleic 92

I Phưđng pháp Schimidit và Thannhauser 92

II Phương pháp Schneiidear 94

III Phương pháp Ogur và Rosen 95

IV Phương pháp quang pbổ 97

V Định lượng hợp chất photpho trong mô ruột theo phương pháp Schmidt và Thannhauser c6 sửa đổí 98

VI Định lượi^ photpho tlieo phương pháp Hor«:ker và các cộng sự 101

VII Đúnh ỉượng photpho vô cơ có nguồn gốc từ photpholipit theo phương pháp Delory .L „ ~ 1 1* 101

VIII Định ỉượng ARN biằag orxũiol 102

IX Định ỉượng ADN bằtig phưdng pháp điphenylamm 104

Chưcíng 9 Xác định ho^t độ của một số enxitn 106

I Định nghĩa đđn vị hoiạt độ của enzim 106

II Chú ý khi xác ^Bnh híoạt độ enzim 106

III Xác địnlì hoạt độ của ascorbat oxidaza 107

IV Xác định hoạt độ của a- amylaza theo Rukhliackva Geriacheva 108

V Xác d^nh h oạt độ cùa cataỉaza 112

VI Xác định hoạt độ cholinesteraza của huyết thanh (ChE) - phưđng pháp sửa đổi của Hestrm 113

VII Xác đỉnh hoạt độ của gkicoamylaza 114

V III Xác định hoạt độ lipiaaa 116

IX Xác cQnh hoạt độ papain 118

X Xác định hoạt độ pepsim bằng phương pháp Anson 121

XI Xác định hoạt độ peroxidaza 123

XII Xác định hoạt độ photphataza kiềm và photphataza axit theo phưdng pháp King -Armstrong 125

XIII Xác định hoạt độ proteữiaaa theo phưđng pháp Anson cải tiến 127

XIV Xác định hoạt độ ureaza theo phương pháp chuẩn độ 130

Chương 10 Đ ịnh ỉượng v ita m in 132

I Định lượng vitamữi c theo phưdng pháp chuẩn độ 132

II Định lượng vitamũi B2 bằng phưdng pháp huỳnh quang 135

III Định lưỢng vitamm Bi bằng phương pháp huỳnh quang 142

Chương 11 Định lượng một số nguyên t ố 144

I Định lượng photpho 144

II Định lương Kali tổng sô'của tìiỊte vật bằng Natri Cobantinitrit 150

III Định lượng Canxi và Magie tổng sô"của thực vật bằng trilon B 151

IV Định lượng Canxi trong mô cơ theo phương pháp Retinxki 152

V Định lượng sắt 154

Chương 12 P h ụ lụ c 155

I Các dung dịch đệm 155

II Dung dịch pH chuẩn 163

III Nồng độ axit và amoniac thưòng g ặp 163

IV Pha dung dịch phần trăm axit và amoniac 164

V Khối lượng mol phân tử và tỷ khốỉ của một sô' a x it 165

VI Kiểm tra nồng ^ các dung dịch chuẩn độ đâ pha bằng dung dịch chất gôic có nồi^ độ chính xác 165

VII Chỉ thị màu axit - bazơ 166

VIII Cách pha và sử dụng một sô"thuốc thử chỉ thị màu thống thưàng 167

IX Các dung dịch rửa dụng cụ bẩn trong phòng thí nghiệm 168

X Nguyên tử khối của một sô' nguyên tô' 169

XI Nồng độ đung địch amoni sun£at bão hoà ỏ nhiệt độ khác nhau 170

XII Cách tính lực li tâ m 170

XIII Các ký hiệu quy định kích thưốc và các phần thập phân 170

XIV Các chữ cái Hy L ạp 171

XV Các tính chất của một sô" đồng vị phóng xạ ứng dụng trong y súih học 171

XVI Sự phụ thuộc của tỷ khối và chỉ sô' khúc xạ vào nồr^ độ dung dịch 172

Tài liêu tham khảo 173

5

Ngoài ra, quyển sách còn được dùhg chó thực tập chuyêh đề của sinh viên nám thủ tư và phục vụ cho học viên cao học làm luận án thạc sĩ thuộc chuyên ngành Hoá sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.

Sách đã đượo sửa chữa và bổ sung một sô' phướng pháp ở các chường định ỉượng

|)rotein, xác định hoạt độ một số enzỉm, định lượng một số nguyên tô' kim loại so với

lẩn xuất bản đầu

Tác giả

Maximum Limits o f Impuiities

VVater Non-volatile matter Acidity (CH3COOH)

Ethanol Heavy metals (as Pb)

M.w.88.11 g/ml 0.90 99%

Tính chất nguy hiểm của hoá chất được cảnh báo bằng các ký hiệu in trèn nhãn hoá chất (Hình 1.2).

Hình 1.2 • Các ký hiệu cảnh báo hoá chất nguy hiểm

Trong các cơ quan nghiên cứu và nhà máy sản xuất hoá chất có những vùng nguy hiểm được cảnh báo bằng các ký hiệu (Hình 1.3), các biểii hiệu cấm (Hình 1.4) và các biển hiệu điều kiện an toàn (Hình 1.5)

Độc với ganNguy hiểm nhiễm trùng Nguy hiểm nhiễm trùng Mẩu bệnh lý, chú ý dễ hỏng Tiệt trùng

Cảnh báo nguyên liệu phóng xạ

Cấm lửa

Nưốc không uốhg được

Cấm vào

Cấm dừng găng tay bằng cao su

Hình 14 -Các ký hiệu cấm

Mũ bảo hiểm Chống ồn Phải rửa tay trước

Mù, kính bảo hiểm, chốhg ồn Mũ che đầu và mặt Phải đi ủng cao su

í

Chỉ đưỢc đi bộ Găng tay bảo hiểm có cổ tay Phải có khẩu trang

Phải có gãng tay cao su

Dội nước khẩn cấp Hộp trợ cứu đầu tiên Rửa mắt TrỢ cứu đầu tiên

Hình 1.5 - Các kỷ hiệu về điều kiện an toàn

2 Cách sử dụng hoá chất

a) Cần g iữ hoá chất sạch

■ Chai lọ hoá chất phải có nắp

- Trưốc khi lấy hoá chất phải lau sạch nắp và cố lọ

- Không dùng lẫn nắp đậy và dụng cụ lấy hoá chất

- Không dùng hoá chất đã rđi vãi

h) Hoá ch ấ t đ ã p h a

- Lọ h o á c h ấ t p h ả i có n h ã n g h i tê n h o ặc công th ứ c hoá học.

- Ghi nồng độ dung dịch

- Ghi ngày pha

- Chai lọ đựng hoá chất pha phải có nắp

- Không đế hoá chát rơi vào nhãn

- Trước khi mở nắp lọ phải lau sạch nắp và cổ lọ

- Đe n ắ p và d ụ n g cụ lấy hoá châ't ở nơi sạch, không để p h ầ n tiế p xúc v ối h o á c h ấ t

xuông bàn

c) Bàn th i nghiêm

- Chỉ đê hoá chất đang dùng lúc đó

- Các hoá châ't để bốc hơi, có mùi phải lấy nhanh hoặc lấy trong tủ hút, phải

đậy kín.

- Khi làm việc với kiềm, axit và các chất độc phải theo đúng quy định

- Không được ngửi hay nếm thử hoá chất

- Các hoá chất dễ cháy, dễ nổ không đưỢc để gần lửa

II DUNG DỊCH

Dung dịch là hỗn hdp nhiều loại của hai hay nhiều chất tác động tương hỗ với nhau về lý, hoá học - thành phần đơn giản nhất của dung dịch có thể tách ra đưỢc ỏ

dạng tiiih khiết, ngUdc lại có th ể điều chê dung dịch ấy theo một th à n h p h ần b ấ t kỳ

ctưcic gọi là thành phần dư trong dung dịch so vổi thành phần kia là dung môi Thành phần còn lại là chất hoà tan

Vi dụ:

- Dung dịch NaOH 10% trong nưốc:

NaOH là chất tan, nưỏc là dung môi

- Butanol bão hoà nưốic:

Nưốc là chất tan, butamol là dung môi

III NỔNG ĐÔ DUNG DIC H

Trong phép tính nồng: tĩộ dung dịch, các chât tan được biểu thị bằng đơn vị khôi lượng, khối lượng mol, đưcing luđng gam (thường được sử dụng), còn sô' lượng dung môi hoặc dung dịch đưỢc biêu thị bằng đơn vị khôi lưỢng mol hoặc đơn vị thể tích Trong nghiên cứu thường dùng 3 nồng độ cơ bản

- Nồng độ phần trám ('“í))

- Nồng độ mol/1 (mol - M)

- Nồng độ đương lượng gam (N)

Ngoài ra còn có:

- Nồng độ gam trên lít : sỏ gam chất tan có trong một lít

- Nồng độ dung dịch b'ão hoà: là ở nhiệt độ nhất định, chất hoà tan không thê hoà tan thêm được nữa Thườnig biêu thị bằng sô" gam chất tan trong lOOml nưác

- Phần trăm khối lưdnig - khối lượng (% w/w) là sô' gam cúa một chất hoà tan trong

+ Microgam phần trárm <ng%) là sô' microgam (|4.g) của chất hoà tan trong 100 gam hoặc lOOml dung dịch (|ig/ lOOml)

và hai loại nồng độ thưòng: dưỢc sử dụng là:

+ Dung dịch phần nghiìn (Whi) là sô'gam chất hoà tan trong lOOOml dung dịch

+ Dung dịch phần triiệu (ppm) là sô' gam chất tan trong l.OOO.OOOml dung dịch hay miligam trong lOOOml! dung dịch hoặc microgam trong Iml

a) N ồng đô p h ầ n triăm khối lượng - khối lương (% w/w)

- Chất rắn tan trong clhă t lỏng

X - sô' gam chất tan lấy để pha

a - sô" phần trăm dung dịch muốn pha

b - khốỉ lượng dung dịch cần pha

Ví dụ 1: Cần bao nhiêu gam NaCl và bao nhiêu ml nưổc để nhận đưỢc 300 gam

w

Trong đó; X- số gam chất tan lấy pha

a- khổì lượng moi ngậm nước b- phần trăm dung dịch cần pha w- khối lượng phân tử không ngậm nưôc

Vi dụ 2: Pha dung dịch CuSÔ 10% từ CUSO4.5H2Ọ

CuSÔ = 159,6 (-160); CuSỘõH^O = 249,7 (-250)

Lắp vào công thức:

X = 25010 ^ ^

160

ta được dung dịch CUSO4 1 0% (w/w)

Trong thực tế, khi pha những (lung dịch có nồng độ một vài % thì người ta thường cân chất tan rồi cho vào bình định mức hay ông đong, sau đó thêm nước đến ngân muốn pha (vì trong trường hdp này thê tích mất đi không đáng kể) Công thức tính:

dTrong đó; V - thể tích riêng phần

p - khôi lượng riêng

Ví dụ 3: Pha dung dịch HCl 10% trong nưốc: ta cân dung dịch HCl rồi lấy 100 gam

trừ đi sô" gam HCl là lượng nuớc thêm vào

*Chú ý: Các chất lỏng có nồng độ hoà tan tôi đa được tính theo phần trăm Ví dụ:

H.^SO^ hoà tan tối đa là 96%, HCl là 37%, H ,PO,, là 65% v.v Vì vậy khi cân các chất

lỏng này phải tính số gam chất đó trong dung dịch theo công thức:

bTrong đó: X - khôi lượiig chất tan cổn có

100 - 27.03 = 72,97 (hay 72.97ml nưốc vì d|| ,o= 1)Đối với chất lỏng ta có thể chuyển thành thể tích để thuận lợi cho pha chê và được tính theo công thức sau:

(1

b) P hần trăm khối lượng - th ể tích (% w/v)

Cân sô' gam chất rắn bằng sô" nồng độ muôi pha cho vào bình định mức hay ốr^ đong lOOml và cho dvmg môi đến vạch lOOml Nếu chất rắn ngậm nước phải cộng

Ví dụ: Cần bao nhiêu gam NaCl để nhận đưỢc SOOml dung dịch NaCl 15% (w/v)?

ị: Lấy lOOml dung dịch 27% pha vổi 2900ml HgO (3000 - 100) hay dẫn nưóc đến 3000ml.

Vi dụ 2: Cách pha như t hế nào để nhận được 200tnl dung dịch HCl 25% (w/v) từ

HCl có tỷ khốỉ d = 1,19 và nồng độ 37%

Giải: Nồng độ của HCl đặc là phần trăm khổì lượng - khối lượng bằng cách chuyển

Nồng độ axit %(w/v) = 37%(w/w).l,19(d) = 44 thay vào công thức (1.7)

Giài: Áp d ụ i^ công thite <1.8) ta có:

+ Pha dung dịch từ hai dting dịch có nồng độ khác nhau:

Ví dụ 4: c ầ n c6 duti^ dịch 40% từ hai dung dịch 50% và 20%

Giải: theo quy tắc ta có

2 0< - 1 0g2 0%

Cách pha: Lấy 20g dlung dịch Õ0% và lOg dung dịch 20% được 30g dung dịch 40%

*Chú ý: Nếu chỉ từ một nồng độ dung dịch cao xuống nồng độ dung dịch thấp cũng tính theo quy tắc hình bình hành, nhiữig dung dịch thấp là nước 0%.

Vií dụ 5: Pha dimg dịch 10% từ dung dịch 50%.

Giải: Theo quy tắc hình bình hành ta có:

0 < - 40g H p

Trường hỢp không cần độ chính xác cao và 2 nồng độ gần nhau thì có thể tùih theothể tích

Ví dụ 6: cần bao nhiêu ml dung dịch NaCl 20% và 3% (w/v) để nhận đưỢc ỗOOml dung dịch NaCl 9%

Giải: Thay vào công thức (1.8) ta có:

2 0 < - ^ 6 m ì 2 0%

3 ^ - llm l 3%

Từ 6ml NaCl 20% có thể nhận được 17ml NaCl 9% (6+11)

Từ X ml NaCl 20% có thể nhận đưỢc õOOml NaCl 9%

Muốn pha dung dịch loại này là cân ehính xác khối lưỢTig châ't tan bằng khốilượng mol của chất đó, cho vào bình định mức và cho nước vào đến vạch ngấn lắc đều.

*Chú ý: Cho hoá chất qua phễu đặt trén bình định mức 1 lít, rửa cân thận cốc cản hoá chất và phễu bằng tia nước nhỏ Bình định mức phải đưdc đặt trên bàn phẳng Những chất toả nhiệt hay thu nhiệt phải để cho về nhiệt độ bình thường (20"C) rồi mổi thêm nưốc đến vạch ngấn

a) P ha chất rắn không ngậm nước

Ví dụ 1: Pha K2Cr2 0 7 có nồng độ IM

Giải: Khốỉ lưỢng mol của K2Cr2Ơ7 = 294 (g)

b) P h a chất rắn ngậm nước

- Chất tan là chất lỏng tinh khiết (100%)

Tiến hành cân và pha như chất rắn không ngậm nưốc

Ví dụ 2: Pha dung dịch Na2S20 3.5IỈ2 0 có nồng độ IM

Giải: Khối ỉượng mol của Na2S.2 0.,.5H2 0 = 248 (g)

Cách pha: Cân 248 gam Na2S2 0.ị.5H2 0 pha vào bình định mức 1 h't

- Chất ta n ỉà chất có phần trăm thấp (chưa được 100%)

M - khối lượng mol

('ách pha: Lây 83ml HCl 37% pha thành 1 lít đưỢc dung dịch HCl IM

+ Nếu cần pha nồng độ M lổn hơn hay nhỏ hơn IM Tính theo công thức sau:

cTrong đó: X - khôi lượng chất tan cần pha

M - khôi lượng mol

c - nồng độ thực của dung dịch C|^,] - nồng độ mol

Ví dụ 4: Pha HCl 2M từ HCl 37%, d = 1,19 ?

Gim: Thay vào công thức (1.10), ta có

X = 5 5 l í l H , 2 = 197.3(g)

37Thay vào công thức (1.3) ta có:

(1.10)

1,19

Ví dụ 5: Pha H.^so,, 0,2M từ HgSO^ 96%,d=l,84 ?

Giẩi: Thay vào công thức (1.1 0) ta có:

Thay vào công thức (1.3) ta có:

1,84Cách pha: Lấy ll,l m l IỈ2SO^ 96% pha thành llít

Cũng có thể lấy khối lượng hoặc thể tích chất tan nhân vói sô' lần lổn hdn hoặc nhỏhơn

Ví dụ ổ.-PhaHCl 0,1M

Giải: IM HCl - cần 83ml HCl 37%

O l M H C l - c ầ n X m l

X = ẼẼilW 8,3(m l)Cách pha: Lấy 8,3ml HCl 37% pha thành 1 lít

Cách pha: Lấy 8,3ml HCl 37% pha thành 1 lít.

3 Nồng dộ đương lượiig (N - thường đvíỢc sử dụng)

Nồng độ đương luợng là sô" đương lượỉng gam của một chất có trong một lít dung dịch hay số mili đương lượng gam một chất có trong Iml dung dịch

Đương lưỢng gam (E) cùa một chất là phần mol chất đó ứng VỚI một điện tích hoạtđộng Điện tích hoạt động trong phản ứng trao đối tính theo số electron đă thực hiệntham gia kết hợp vói ion khác, trong phản ứng oxi hoá khử thì tính theo sô electron (tã cho hoặc nhận

6FeS04 + K^Cr^O, + 7H^SƠ4 = SPêíSÔ)., + Cr./sô);, + K.^SO,, + 7 H^O

6Fế" + + 14 = 6Fê^ + 2Cr ^ + 7HỵO

294 2

Á

Nồng độ đương liiợng thường đưỢc dùng để biểu thị nồng độ các dung dịch chuẩn

vì rất tiện lợị Nếu dung dịch cùng một nồng độ đương lượng thì phản ứng đúng theo thể tích bằng nhaụ Nếu hai dung địch có nồng độ đương lượng khác nhau thì phản

dung dịch phản ứng dúng vâi ỉihau thì

Trong đó:

là sô’ rĩiil dung dịch thứ nhất có nồng độ đương lượng N]

Đây là biểu thức eđ bản đế tính toán trong quá trình chuẩn độ

1 Một số d u n g dịch tiêu chuẩn

0,1N; KMnƠ4 0,1N Từ các dung dịch có nồng độ 0,1N pha ra các dung dịch 0,05N;

0,02N; 0,01N Để pha những dimg dịch này trước hết pha gần đúng 0,1N (thưòng lấy cao hơn một ít) rồi sau đó mổi xác định lại nồng độ chính xác và điểu chỉnh chúng bằng pha loãng.

Báng 1.1- Pha dung dịch tiêu chuẩn thưdng dùng (gẩn đúng)

1 h't dung dịch

H2SO4 0,1N NaOH 0,1N KMnO^ O.IN Trilon B 0,05N

2,8ml H.^SO^ đặc (d=l,84)4,0 g

3,16 g9,305g (có thể pha clúnh xác)Phần lổn những chất đã pha trên không thể’ căn cứ khôi lượng đã lấy pha để túih

ra nồng độ chính xác vì chúng chứa tỉ lệ nước ngậm không ổn định hoặc trong thành

J ) h ầ n chúng có lẫn thành phần khác như NaOH có chứa NaỵCO.^, ỈÍMn0 4 có lẫn MnOg.Người ta thường dùng những châ't có thành phần ổn định, có lượng nưốc trong

t mh thể ổn định hoặc d | dàng, sấy khô, không bị hút ẩm hay bị oxi hoá trong quá trình

pha chế, những chất này gọi là hoá chất gốc dùng để kiểm tra các dung dịch tiêu

t.huấn đã pha trên Nồng độ hoá chất gổc được tính từ khối lượng đã lấy pha, sau đó

Cách kiểm tra: Pha lOOml hoá chất gôc có nồng độ chính xác 0,1N Lấy 3 bình nón

cỡ 250ml, cho vào mỗi binh chúứi xác 20ml dung dịch 0,1N của hoá chất gốc và chất

chi thị Dùng dung dịch tiêu chuẩn đã pha rót vào buret Chuẩn độ cho đến điểm tưđng đương (đổi màu chất chỉ thị)

Báng 1.2- Các chất gốc dùng đề kiểm tra nong độ các dung dịch tiiu chuẩn

Bình nón có 20m l dung dịch gốc và chất

chi thị

Màu chuẩn độ

Mấ’t màu xanh

xanh nưỏe biển

Bình định mức

Hình 1.6 - C á c h p h a d u n g d ịch ch u ẩn

*Chú ý :

- Các fícxanal kiểm ăn da có thể bảo quản không quá sáu tháng vì giữ lâu dễ bị

ván đục do có chất bẩn và tạo thành cacbonat tương ứng

- Các íỉcxanal của muối hay axit có thể bảo quản được lâu dài

V CÁCH TÍNH HỆ SỐ ĐlỂU CHỈNH

Trong quá trình pha hoá chất có nhiều yếu tô' làm sai nồng độ như;

- Cân đo không chính xác

- Các chất chưa tinh khiết hay hút nước v.v

- Để lâu bị thăng hoa hay oxi hoá v.v

Do đó người ta phải kiểm tra nồng độ thực của dung dịch pha dựa vào các chất ổn địiih hay có nồng độ chính xác như các dung dịch tiêu chuẩn íicxanal Tính sự sai sô' của dung dịch để tìm nồng độ thực gọi là hệ sô" điều chỉnh, thường đưỢc ký hiệu là T

Hệ sô' điểu chỉnh theo dung dịch tiêu chuẩn íicxanal

H.,SO^ tự pha so với kiểm tự pha là:

/ NaOH - " V ’

Sau đó so H2SO4 tự pha với H.^SO ị 0,1N tiêu chuẩn theo công thưc sau:

T h , S O , , / I I , S ( ) , (O.IN) = T | | , , S ( ) , / N a 0 n ^ T n , , o h / m s o , (O.IN)Trong đó:

TH2SO4 /H2SO4 (0 IN): Hệ sô' H.jSO,| tự pha so với H2SO^ tiêu chuẩn

Th^so /NaOH • Hệ sô' H.,SO J tự pha so vổi NaOH tự pha

TNaOH/H.,SO (0 IN) • Hệ sỏ NaOH tự pha so vỏi H2S0 ,ị tiêu chuẩn

Thay sô ở 2 ví dụ trên vào ta có:

Th.so,/H.so, (IMN) =0,83x1,11=0,9213Vậy nồng độ thực của axit tự pha là;

0,1N X 0,9213 =0,09213N Ngược lại, nếu chỉ có NaOH tiêu chuẩn thì ta làm và tính hoàn toàn ngưỢc lại

VI BÀI TẬP

B ài tập 1: Cần bao nhiêu gam NH4NO-^ để nhận được 60g dung dịch NH4OH 40% ? Đáp sô': 24g NH4NO3 , 36g (ml) nưốc

B à i tậ p 2: Cần bao nhiêu gam cađimi clorua (CdCl^ 2,5H2 0) và bao nhiêu ml

Đáp số: 6,23g CdClg 2.5H20 , 93,77ml HỵO

B à i tậ p 3: Cần bao nhiêu ml IỈ2SO^ 96% (d = 1,84) và bao nhiêu ml nước để nliận

Đáp số: 2,72ml H2SO4 96%, 91 ml H p

B ài tập 4: Cần bao nhiêu ml HNO.:ị 70% (d = 1,42) và bao nhiêu ml nước để nhận

được dung dịch HNO.Ị 20% ?

Đáp số: 14,lml HNO.^ 70% và 50ml H^o.

B à i tậ p 5: Cần bao nhiêu ml CH.ịCOOH 95,5% (d = 1,05) và bao nhiêu ml nưóc để

nhận đưỢc dung dịch CH.^COOH 15% ?

Đáp s ố : 14,28ml CH.ịCOOH 95,5% và 80,5ml H^o

B à i tậ p 6: Cần cho nước đến vạch bao nhiêu ml khi pha 40ml dung dịch 25%

(w/w) để nhận đưỢc dung dịch có nồng độ 3% ?

Đáp sỏ': 333ml

B à i tậ p 7: Có bao nhiêu ml dung dịch 20% (w/v) khi pha 50ml HCl 37% (d =1,19)?

B à i tậ p 13: Cần pha loãng 150g dung dịch NaOH 40% để có dung dịch 15% Hỏi

phải thêm bao nhiêu nưốc ? ĐưỢc bao nhiêu gam dung dịch 15% mối pha ?

Đáp số: 250ml, 400g

Bài tập 14: Pha 90g dung dịch H2SO4 42% vào I35ml nước Hỏi nồng độ phần trăm của dung dịch pha đưỢc ?

Đáp sô': 16,8%

Bài tập 15: Có thể thu được bao nhiêu dung dịch KOH 22% từ 1 Kt dung dịch

KOH 47,8% có tỷ khốỉ 1,485 c ần thêm bao nhiêu nưổc vào dung dịch ?

B ài tập 18: Cần chuẩn bị 80ml dung dịch kiềm 40% từ dung dịch 50% và 20% Hỏi mỗi dung dịch cần bao nhiêu ?

Đáp sô': 26,7ml dung dịch 20% và 53,3ml dung dịch 50%

B ài tập 19: Cần thêm bao nhiêu nưàc vào 2 lít dung dịch NaOH 40%, tỷ khối 1,43

Đáp số: 32,6ml KOH 27,3% thêm nưóc vào đến 1 lít

B à i tậ p 23: Phải chuẩn bị 4 Ut dung dịch HNO3 0,1N thế nào từ dung dịch HNO Ị 42,9%, d = 1,265 ?

Đáp số: 46,4ml HNO.^ 42,9% pha thêm nước đến 4 Kt.

Chương 2

PHƯƠNG PHÁP LẤY MẪU PHẦN TÍCH

I LÂY MẪU

1 Lấy m ẩu h ạ t

Hinh 2.1 - Cách chia ô lấy mẫu hạt

Khi lấy mẫu hạt chỉ cần lấy 1/5 hay 1/10 hạt thu hoạch, nhưng không ít hđn 25g Hạt thu hoạch được trải trên giấy thành hình vuông (lấy 1/2 hay 1/3 số hạt của một cây), vạch hai đường chữ thập chia hình vTiông thành 4 phần đều nhau, vạch thêm các đưòng chéo chiạ thành các phần nhọ hơn bằng nhaụ, ỉấy một sô' hạt ỏ các hình tam giác đốĩ nhau (xem hình 2.1), nhưng lượng hạt lấy phải tuỳ thuộc loại hạt, hạt bé phải lấy hdn 25g, hạt lớn phải lấy từ 500-1000g

Mâu được nghiên hoặc xay thành bột, rây qua rầy có kích thưóc lỗ 0,15 - 0,50 mm

phần hoá học của chất định phân tích Đối với hạt có dầu phải giã từn« ít một, nên bảo quản nguyên hạt Nếu là h ạt lớn có vỏ cứng ngoài thi phải bóc vỏ tnlốc khi nghiền nhỏ Nếu muôn tính số liệu phân tích toàn bộ hạt, phải xác định % vỏ bằng cách cân

khối lượng 50 hay 100 hạt, tách vỏ và tính % khôi lượng vỏ hoặc tùih % khôi lưdng

nhíin hạt đã tách vỏ và so sánh vối khốỉ lượng hạt nguyên Lúc bóc vỏ cần chú ý không làm hỏng các phần nhân bên trong như mắt của các loại hạt đậu v.v Để dễ dàng tách

vỏ, có thể nghiền nhẹ trong cốỉ cho nứt vỏ và sau đó bóc hoặc có thể ngâm cho tnídng

Hạt nguyên hoặc hạt đã tách vỏ trưốc khi nghiền có thể sấy ở 70 - 80“c trong 15 -

18 giò hoặc sấy ỏ 80 - 85°c từ 4 - 5 giò cho đến trạng thái khô không khí Sau đó, nếu

2 Lây m ẫu ra u

Tuỳ từng loại rau mà phải chú ý đến đặc điểm của nó lúc lấy mẫu

- Các loai rau ăn quả như cà chua, ớt, dưa chuột, bầu, bí v.v cần chú ý đên số lượng quả, vị trí quả trên cáy độ chín của quả V V Những cây ra quả nhiều lứa, cần phân tích ít nhất là 10 cây và từ 3 - 5 quả mỗi cây.

- Các loại củ như khoai lang, khoai tây v.v , sau khi lấy 10 cây, phân các củ thành 3 loại to, vừa, nhỏ và lấy 20 - 30 củ ở cả 3 loại

- Những loại rau ăn lá phải chú ý đến giai đoạn sinh trưỏng và phân tích ít nhất 2lứa

Khối lượng của mỗi mẫu lấy đê phân tích tùy từng loại Rau ăn lá là Ikg Cà chua, bắp cải, dưa chuột, v.v là 2,5kg Những loại quả lốn như bầu, bí, dưa bở v.v là 5kg Quả, củ cần bổ dọc và lấy ở quả, củ một phần, lưỢng mẫu không ít hđn Ikg

Các loại rau nên lấy vào sáng sốm để kịp phân tích trong ngày Nếu lấy vào buổi chiều (17-18 giờ) phải giữ lạnh để hôm sau phân tích Nếu phân tích nhiều lần trên một đổỉ tượng thì phải thông nhất thời gian lấy

Quả và quả mọng như táo, lê, mận, cam, chanh v.v phải lấy trung bình của 10 cây mọc ồ các vùng khác nhau trong vườn rộng, trong sô" đó có ít nhấ^t là 5 cây mọc ở các vùng đại diện cho vườn Chọn các quả ỏ các tầng khác nhau trên cây, mỗi cây lấy

không đưỢc dừng để phân tích

Mẫu phải ghi đầy đủ:

- Tên mẫu

- Ngày, tháng thu hoạch

- Sô' quả hay khôi lượng (sô' dãy, cây), sô' lặp lại

3 Lẩy m ẫu h ế n hựp dại diệh cẳỹ irẩn g

Việc lấy mẫu hỗn hỢp đại diện là công việc đầu tiên của quá trình phân tích cây trồng, nó quyết định kết quả phân tích sau này Muốn cho mẫu đại diện điển hình cho toàn khối với mức độ cao có thể thực hiện theo các kiểu sau:

- Lấy nhiều điểm

Trên một diện tích cây trồng phải lấy nhiều mẫu ỏ nhiều điểm khác nhau, thường lấy từ 5-9 điểm rồi trộn đều lại và lấy ra một ỉượng cần thiết, các điểm này phân bố đểu trên toàn diện tích lấy mẫu (hình 2.2)

- Loại trừ cá biệt không diển hình

Khi lấy mẫu ỏ các điểm cần tránh những mẫu cá biệt không điển hình như các mẫu cây bị bệnh, bị sâu hoặc quá tôt Tránh lấy mẫu khi vừa mối phun thuổc trừ sâu hay phun hoá chất kích thích Nếu toàn diện tích kém đồng nhất, thì phải phân chia nhỏ ra Ví dụ toàn diện tích lấy mẫu có chỗ cao, chỗ trũng , cây trồng khác nhau, trong trường hỢp này phải phân nhỏ ra nhiều ô, mỗi ô lấy một mẫu đại diện đế về phân tích

Hình 2.2 - Các điểm iấy mẫu phân tỉch

II CHUẨN BỊ MẪU PHÂN TÍCH

Tất cả rau quả trưóc khi phân tích phải rửa sạch đất, gọt sạch vỏ Cà chua, diỉa chuột, Ốt, khoai tây, cà rốt, táo, lê, nho, mơ, mận nghiền toàn bộ quả Bắp cải trưốc khi nghiền phải bỏ các ỉá bẩn, ỉá xanh ỏ ngoài Hành củ ỉoại bỏ ỉổp vỏ ngoài Cam, quýt, bưỏi bóc lóp vỏ ngoài và cùi trắng bên trong Hạt quà một số trưòng hỢp lấy phân tích cừng thị^ quả (ót, cà chua, dưa chuột ), một sô' quả cần bỏ hạt (nho, cam, chanh, lê, mận) kể cả phần bao hạt vì phần này giầu hemixenlulozơ và pectin

Các quả đã lấy theo cách như trên đem bổ dọc, mỗi quả lấy một lát, nghiền nhỏ

riêng, bã nghiển sau Có thể dùng cối xay thịt, cốỉ xay hạt, cối sứ, máy xay sinh tố để nghiền Mẫu được nghiền thành dịch thể đồng thể

III CỔ ĐỊNH MẨU

Sau khi lấy mẫu, chiía phân tích ngay cần phải cố định mẫu để giữ nguyên các thành phần của mẫu

1 Sấy khô đến trạn g th ái khô không khí

Phương pháp này dùng nhiệt độ cao để diệt enzim và vi khuẩn, sau đó dừng nhiệt

để loại phần ỉổn nưác đến khi nguyên liệu khô giòn

Đầu tiên cho nguyên liệu vào tủ sấy, sấy ồ 110 - 120“c , nhiệt độ trong nguyên liệu sẽ đạt 100 - 105" trong khoảng 30 phút, enzim và vi khuẩn bị diệt Sau đó tiếp tục sấy ỏ 60 - 70“c cho đến khi khô giòn Thời gian sấy khác nhau tuỳ từng loại

nguyên liệu, nhitng không kéo dài quá 8 - 10 giờ Để sấy khô nhanh chóng cần thái nhỏ nguyên liệu, tủ sấy phải thông khí (có quạt gió và lỗ thông khí) Trong quá trình sấy không đưđc để nhiệt độ cao quá có thể làm cháy, làm biến đổi thành phần hoá học (đặc biệt vối nguyên liệu nhiều đường sẽ bị caramen hoá có mùi khét) Trong thời gian đầu nếu sâ'y khô chậm, các enzim sẽ hoạt động mạnh làm biến đổi thành phần trong nguyên liệu Vì vậy nâng nhiệt độ sấy cao lúc ban đầu rất quan trọng.

Nguyên liệu đầ đưỢc sấy khô, cho vào bình đậy chặt bằng nút cao su hay nút bấc

có paraíĩn gắn phía ngoài nắp, giữ đ nơi khô và lạnh.

2 Cố đ ịn h b ằn g hơi nước

Dùng hơi nưốc để làm ngừng hoạt động enzim Có thể dùng nồi xông hđi, nồi cách thuỷ hoặc xoong bình thường Đun một ít nước sôi, lúc đun đậy nắp, sau khi nưốc đã sôi, trải nguyên liệu thành lốp mỏng gói trong vải màn hoặc đặt trong chén sứ và đặt trên vỉ trong xoong, không để mẫu tiếp xúc vối nưốc, đậy nắp tiếp tục đun 15-20 phút hoặc lâu hdn tuỳ theo nguyên liệu Lấy mẫu ra và sấy trong tủ sấy thông khí ỏ 30 - 50”c hoặc tủ sấy bình thường ở 60 - 70"c đến khô

Phưdng pháp này có thể dùng để cố định các nguyên liệu như lá, thân, rễ, hạt chứa ít axit và hàm ỉưđng đường đã đưỢc xác định trong nguyên liệu tươi (cà rốt, bắp cải ) Còn các quả, quả mọng (cà chua) và các loại rau quả có chứa nhiều nưốc, đường, axit hữu cơ không thể dùng phương pháp này đưỢc vì có thể bị mất dịch, đường bị thuỷ phân cũng như làm biến đổi tỷ lệ giữa các dạng hiđratcacbon khi sấy tiếp tục Vì vậy

các loại mẫu này nên dừng phương pháp cổ định bằng cồn.

Nguyên liệu sau khi sấy khô cho vào lọ sạch, đậy nút chặt Phương pháp này có thể dùng khi đi khảo sát ngoài thiên nhiên để giữ mẫu về phân tích ỏ phòng thí nghiệm

3 Cố đ ịn h b ằn g Gồn

lắp ốhg làm lạnh, cho cồn 96" đã đun sôi vào bình làm ngập toàn bộ mẫu, phải tính toán trưốc để nồng độ cồn còn từ 78 - 82”, tiếp tục đun sôi 30 phút trên nồi cách thuỷ Sau đó để nguội (vẫn giữ nguyên ôVig làm lạnh), thay ốhg làm lạnh bằng nút đậy kín Cô' định mẫu bằng phướng pháp này có thể giữ đưỢc thành phần hoá học trong mẫu

Phưđng pháp này thường dùng để cố định các mẫu lá quả, rễ, củ, hạt Một số đối tượng khác như mảu có chất chát cần sấy khô trong bóng tối và ở nhiệt độ không cao lắm, vì ánh sáng mặt trcíi làm giảm hàm lượng chất chát, nhiệt độ cao làm tăng quá trình oxi hoá và tạo thành các chất không tan Ngoài ra, tấ t cả các chất chát đều tan trong nưóc lạnh và bị thuỷ phân dưối tác dụng của các enzim có trong nấm mổc

Vì vậy các mẫu phân tích chất chát phải giữ khô, tránh ẩm, mốc như:

- Đặt mẫu (lá, rễ) vào chỗ tôi

sấy khô không quá 60"c.

Sây khô mẫu đến trạng thái khô giòn

Tránh mưa, sưđng, đất ẩm

Phòng tránh mốc

Phưđng pháp so m,àu c:;hí là một phần cúa phương pháp quang phổ hấp thụ Phương pháp quang phổ hấ]p thụ cũng chỉ là một phần của phương pháp quang học Trong hoá sinh, các phưiơng ipháp đo quang phổ thường được đo trong dải bước sóng từ

220 đến 800nm Dải quang iphiô này lại được chia thành vùng tứ ngoại (dưối 380nm), vùng khả kiến (trên 380inm) và \rùng hồng ngoại (trên 800nm) Vùng hồng ngoại có rất

Để biết màu đưỢc đ(0 nhiư thế nào, trưóo hết phải hiểu được màu là gì? ỈQii dòng ánh sáng trắng xuyên qua miột diung dịch màu, các bước sóng nhất định (tuỳ thuộc vào bản chất của dung dịch)! sẽ Ibị hấp thụ, trong khi những bưốc sóng khác thì gần như không bị ảnh hưởng Máu cma dung dịch sẽ là màu của những bước sóng không hấp thụ Những điều đó đưỢc' ton^ kế* một cách đởn giản trong bảng 3.1

Cường độ màu của idiuig dịch có thê đưực xác định bằng cách đo cường độ ánh sáng hấp thụ bỏi hdp c h i ấ t ■miàu c ó T r o n g dung dịch Vì dùng ánh sáng trắng đo cưòng

độ màu, nên ánh sáng liiấp t:hụ cách càng xa càng tổt nhửng bước sóng mà không bị

hấp th ụ bỏi dung dịch màu Ví dụ: để đo độ hấp thụ ánh sáng của một dung dịch màu

đỏ thi dùng ánh sáng vàng - xanh da tròi (clúnh là ánh sáng xanh lá cây) là thích hợp

sá n g đdn sắc này có thể được tạo ra từ giấy lọc, lăng kừih hoặc là cách tử nhiễu xạ trong máy so màu và máy quang phổ

Nêu ánh sáng đơn sắc xuyên qua một dimg dịch màu thì cường độ ánh sáng hấpthụ s<ẽ phụ thuộc vào:

- Độ dài đường ánh sáng qua dung dịch

- Nồng độ của chất ta n hấp thụ ánh sáng

Mối liên hệ này được biểu hiện bằng định luật Lambert- Beer trong phưđng trìnhsau;

( 3 1 )

Ig - cường độ của tia đi raK- hệ sô" tắt hoặc chỉ sô" hấp thụ phân tử (cũng có thể được dừng e thay K)

c - nồng độ dung dịch

độ hâ'p thụ (A- absorbancy) Trong thực hành, giá trị này không phải tứứi mà thu đượctrực tiếp từ máy đo

OD

Hình 3.1 • Đó thỊ mẫu

Từ phưđng trình (3.1) dễ dàng thấy rằng khi 1 (độ dài) đưỢc giữ không đôi thì mặt

độ quang sẽ tỷ lệ thuận trực tiếp với nồng độ của chất màu Vì vậy, đường chuẩn (sẽ là một đường, thẳng) có thể được vẽ từ một dãy các dung dịch chuẩn vối những nồng (ĩộ khác nhau (hình 3.1)

Nồng độ của một dung dịch nghiên cứu sẽ được xác định dựa trên điíòng chuắn này Tụy nhiên, không phải lúc nào cũng cần phải vẽ một đường chuẩn Vì có thê tính được nhò sự liên quan giữa dung dịch nghiên cứu (u) và dung dịch chuẩn (S):

Mật độ quang của dung dịch thứ nhất là:

Mật độ quang của dung dịch thứ hai là:

Trong nhiều trường hợp độ hấp thụ và nồng độ không tỷ lệ thuận

Do đó, cần phải xác định giới hạn nồng độ, chỉ áp dụng định luật Lambert-Beer ở phần nồng độ tăng tuyến túih Khi quan hệ giữa hai yếu tô" này không phải là đường

dựng một đưòng chuẩn và giá trị dung dịch nghiên cứu được xác định trực tiếp từ

đuring chuẩn Để so màu, người ta chọn điều kiện sao cho mật độ quang (OD) nằm

t r o n g khoảng 0,1-1; tốt nhất là 0,2-0,5

III MÀU DUNG DỊCH VÀ CHỌN BƯỚC SÓNG ÁNH SÁNG (HAY CHỌN KÍNK LỌC MÀU)

Màu của dung dịch là do sự hấp thụ không đồng đều các vùng khả kiến Khi cho

á n h s á n g trắng đi qua dung dịch màu, không phải tấ t cả các tia của phô đểu bị hấp thụ với mức độ giông nhau, có phần tia bị hấp thụ mạnh, có phần tia hình như không

bị hấp thụ Mỗi dung dịch màu của các hỢp chất khác nhau có đưòng cong hấp thụ khiu: nhau hay có phô’ hấp thụ khác nhau Để có đường cong hấp thụ, người ta tiến hành đo một độ quang của dung dịch màu đó ỏ các bước sóng khác nhau Trên trục

h o à n h i-ủa đồ thị là độ dài của bưâc sóng ánh sáng từ 400nm (tím) đến 700nm (đỏ) Trên trục tung đồ thị ghi giá trị mật độ quang (OD) Điểm cực đại của đường cong là đặc t í n h quan trọng của hỢp chất màu Khi nói hệ số hấp thụ phân tử của một chất màu nào đó có nghĩa là trị sô' đó đã đưỢc đo ỏ vùng phổ mà ánh sáng bị hấp thụ cực dại (hình 3.2)

Hình 3.2- Đuờng cong hấp thụ của dung dịch axeton coban sunfoxianua(1)

và của sắt suntoxianua (2)

Những dung dịch có mầu trong các thí nghiệm sinh học ít khi chứa những màu đơn giản và cơ bản Do đó, việc lựa chọn bước sóng đúng để dùng sẽ không phải là một vấn đề dễ dàng mà phải được xác định bằng thực nghiệm Những ký hiệu của màu như đỏ, xanh, vàng thiếu chính xác so vâi bước sóng của ánh sáng (X) thường được dùng MỐì liên quan giữa bước sóng và màu được giới thiệu ỏ hình 3.3

37

ỉoIt;;-ữ

I

cs

CJ

ổ 600

gpt-óỉò

700 SOOnniHinft 3.3* Mối lièn quan giữa bi^c sóng vả màu

1 Thí nghiệm 1 — Liên hệ giữa các màu và các bưổc sóng

Đặt một mẩu giấy trắng nhỏ trên đưòng tia sáng truyền qua trong một máy

quang phổ (theo hướng dẫn) và ghi lại màu của tia sáng tại những bưốc sóng khác

Inm = ;.Ả (đỡn vỊ nấy không đượG d ù n i cho 1)

2 Thí nghiệm 2 - I>ồ thị độ hấp thụ của chất màu thực phẩm

đủứi hấp thụ sẽ là bao nhiêu dựa trên bảng màu - bưóc sông ở trên

Chất màu thực

phẩm

Màu của chất màu thực phẩm

Dự đoán đỉnh trong phạm vi màu

Dự đoán đỉnh tại /ị trí bước sóng (nir)A

B

tự kí

2 Đồ th ị hấp th ụ của 3 chất màu này sẽ đưỢc ghi lại bằng máy quang Ị>hổ

3 Đỉnh hấp thụ của mỗi chất màu là bao nhiêu ?

sử dụng máy so màu hoặc máy quang phổ để phân tích những dung dịch này theo phưdng pháp so màu thì đọc ỏ bưốc sóng nào là tốt nhất ?

Chất màu

thực phẩm

Màu của chất màu thực phẩm

Đỉnh (nm) quan sát được

Vùng màu của đỉnh quan sát được

Bước sống tốt

n hất cho phân tích (nm)A

B

c

4 Đỉnh hấp thụ của dung dịch xanh lá cây là bao nhiêunm ?

n h iê u ?

đó xác định độ hấp th ụ của cả chất màu ban đầu và chất màu đã bị pha ỉoãng bằng máy quang phổ ở đỉnh bưốc sóng

7 Có dung dịch xanh lá cây vổi nồng độ lốn gấp 5 lần Hãy dự đoán độ hấp thụ của dung dịch này là bao nhiêu ?

9 Độ hấp thụ của dung dịch này có Idn gấp 5 lần độ hấp thụ của dung dịch ban đầu không ? Giải thích tại sao ?

1 Sắp xếp các ông nghiệm theo bảng sau Thành phần của các ô'ng nghiệm

3 Sinh viên đưỢc cung cấp một chất màu không biết nồng độ Ghi lại độ hấp thụ của dung dịch nghiên cứu này

4 Báo cáo thí nghiệm:

- Vẽ đồ thị độ hấp thụ Aj, và nồng độ của chất màu (ng/ml trong mỗi ống nghịệm)

- Đồ thị có tuân theo định luật Lambert- Beer không ?