Thực hành hóa sinh học bài 1 quy tắc làm việc trong phòng thí nghiệm hóa sinh

Trang 1

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG BỘ MÔN SINH HỌC

ThS PHẠM THỊ MAI (Chủ biên) TS PHẠM THU THỦY

TS NGUYỄN CƠNG MINH

THỰC HÀNH HĨA SINH HỌC

Trang 2

MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iii

LỜI MỞ ĐẦU iv

BÀI 1 QUY TẮC LÀM VIỆC TRONG PHỊNG THÍ NGHIỆM HĨA SINH 1

I NỘI QUY 1

II KỸ THUẬT PHỊNG THÍ NGHIỆM HĨA SINH 1

1 Một số hình cảnh báo nguy hiểm 1

2 Thao tác an tồn 2

3 Sơ cứu trong phịng thí nghiệm 2

4 Pha hóa chất 2

BÀI 2 SACCHARIDE 4I ĐỊNH TÍNH 41 Kiểm tra tính khử của một số saccharide bằng dung dịch Fehling 4

2 Phản ứng của tinh bột v i iodine 4

II ĐỊNH LƯỢNG 51 Xác định hàm lượng đường khử theo phương pháp Bertrand (theo TCVN 4075 – 2009) 5

2 Xác định hàm lượng đường khử theo phương pháp DNS (3,5-dinitrosalicylic acid) 8BÀI 3 LIPID 12I ĐỊNH TÍNH LIPID 121 Tính tan và sự tạo thành nhũ tương của glyxerit 12

2 Phản ứng xà phịng hóa 12

3 Sự tạo thành acid béo tự do 13

II ĐỊNH LƯỢNG LIPID 131 Xác định chỉ số acid của chất béo (TCVN 6127: 2010) 13

2 Xác định chỉ số xà phịng hóa của chất béo (TCVN 6126 : 2015) 14

3 Xác định chỉ số peroxide của chất béo (theo TCVN 6121:2010) 15

4 Xác định chỉ số iodine của chất béo (theo TCVN 6122:2015) 16

5 Định lượng lipid bằng phương pháp Soxhlet 17

6 Xác định hàm lượng lipid tổng số theo phương pháp Folch 18

BÀI 4 PROTEIN VÀ AMINO ACID 20I ĐỊNH TÍNH 201 Phản ứng kết tủa thuận nghịch của protein bằng muối trung tính 20

2 Sự biến tính protein 20

3 Phản ứng màu biuret 22

II ĐỊNH LƯỢNG 231 Xác định hàm lượng protein hoà tan theo phương pháp Bradford 23

2 Định lượng protein hoà tan theo phương pháp Lowry 25

Trang 3

III BÁO CÁO 29

BÀI 5 VITAMIN 30

I ĐỊNH TÍNH 30

1 Phản ứng của vitamin C (ascorbic acid ) v i iodine, v i methylene blue 30

2 Phản ứng tạo thành thiocrom của vitamin B1 (Thiamine) 31

3 Phản ứng vitaminB6 (pyridoxine) v i FeCl3 31

4 Phản ứng của vitamin A (Retinol) v i H2SO4 31

II ĐỊNH LƯỢNG 321 Xác định hàm lượng vitamin C theo phương pháp chuẩn độ iodine 32

2 Xác định hàm lượng vitamin C theo phương pháp 2,6 diclorophenolindophenol (DCPIP) (theo TCVN 6427-2:1998) 33

III BÁO CÁO 36BÀI 6: ENZYME 37I ĐỊNH TÍNH 371 Kiểm tra hoạt tính của enzyme amylase 37

2 Ảnh hưởng của nhiệt độ, pH t i hoạt tính của amylase 37

II ĐỊNH LƯỢNG 382 Xác định hoạt độ protease theo phương pháp Anson cải tiến 41

III BÁO CÁO 43

Trang 4

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

C%: nồng độ phần trăm CM: nồng độ mol/lit Vdd: thể tích dung dịch Vdc: thể tích dung chất mct: khối lượng chất tan mdd: khối lượng dung dịch

ddd: khối lượng riêng của dung dịch

Trang 5

LỜI MỞ ĐẦU

Bài giảng “Thực hành hóa sinh” là tài liệu chính thức dành cho sinh viên năm thứ 2 các

ngành: công nghệ thực phẩm, công nghệ chế biến, công nghệ sau thu hoạch và công nghệ sinh học

V i thời lượng 30 tiết, nội dung thực hành gồm các bài sau: Bài 1: Quy Tắc làm việc trong phịng thí nghiệm Hóa sinh Bài 2: Saccharide

Bài 3: Lipid

Bài 4: Protein và amino acid Bài 5: Vitamin

Bài 6: Enzyme

Trang 6

BÀI 1 QUY TẮC LÀM VIỆC TRONG PHỊNG THÍ NGHIỆM HĨA SINH I NỘI QUY

1 Sinh viên phải tham gia đầy đủ các buổi thực hành Trường hợp bất khả kháng, phải viết giấy phép và bù bài vào nhóm tiếp theo

2 Sinh viên phải xem bài trư c buổi thực hành Nếu không, buộc phải nghỉ buổi đó

3 Mỗi nhóm được giao dụng cụ và tự bảo quản trong suốt quá trình thực hành

4 Sau mỗi buổi thực hành, các nhóm tự vệ sinh khu làm việc, dọn rửa dụng cụ của

nhóm mình

5 Trang phục đúng quy định: mặc áo blouse, quần dài, mang khẩu trang, dép quai hậu hoặc giày bệt, cột tóc gọn gàng

6 Nghiêm cấm ăn, uống, nô đùa trong phịng thí nghiệm

II KỸ THUẬT PHỊNG THÍ NGHIỆM HÓA SINH

Trang 7

2 Thao tác an tồn

2.1 Làm việc với hóa chất

- Phải đọc kỹ các thông tin ghi trên nhãn chai lọ đựng hóa chất

- Phải thao tác trong tủ hút v i các hóa chất bay hơi như: acid, kiềm nóng, các dung mơi hữu cơ (chloroform, hexan, ethe, …), …

- Phải thêm từ từ acid hoặc kiềm vào nư c khi pha lỗng, khơng làm ngược lại - Tuyệt đối khơng hút hóa chất bằng miệng

- Khơng để hóa chất dễ cháy nổ gần nơi nguồn nhiệt

2.2 Làm việc với trang thiết bị trong phịng thí nghiệm

- Đối v i thiết bị, máy móc: Chỉ sử dụng khi đã được hư ng dẫn và phải tuân thủ tuyệt đối sự hư ng dẫn của cán bộ PTN hoặc của giảng viên Phải ghi nhật ký và vệ sinh đúng cách sau mỗi lần sử dụng

- Đối v i dụng cụ thủy tinh: thao tác cẩn thận tránh để vỡ (khi vỡ phải bỏ vào đúng nơi quy định của phịng thí nghiệm, khơng bỏ thùng rác), khi đun và khi pha kiềm hoặc pha loãng acid phải dùng dụng cụ thủy tinh chịu nhiệt và thao tác trong tủ hút

3 Sơ cứu trong phịng thí nghiệm

- Bỏng (nhiệt, acid, kiềm): xả nhanh và nhiều nư c tại nơi bị bỏng - Trầy xư c da, chảy máu: xả nhiều nư c trư c khi băng bó

- Điện giật: ngắt cầu giao tổng của phòng trư c khi sơ cứu

- Hỏa hoạn tại phịng thí nghiệm: v i ngọn lửa nhỏ dùng khăn chuyên dụng để dập tắt, v i ngọn lửa l n dùng bình xịt cứu hỏa Trường hợp bị cháy lên người: lăn vài vòng xuống đất, các bạn khác dùng khăn to, bình xịt để dập

4 Pha hóa chất a Nồng độ phần trăm - w w : (%)100*%ddctmmC  mdd Vdd(m l)*d(g/m l)

VD: dung dịch NaCl 10% (w/w): Trong 100g dung dịch có 10g NaCl tinh thể

- t t c w v : (%)100*%ddctVmC 

VD: dung dịch CuSO4 10% (w/v): trong 100ml dung dịch có 10g CuSO4 tinh thể

- t t c t t c v v : (%)100*%dddcVVC 

Trang 8

b Nồng độ mol/l: là số mol chất tan có trong 1 lit dung dịch: ddctMVnC 

c Nồng độ đương lượng gam (CN): là số đương lượng gam chất tan có trong 1 lit dung

dịch: VnCN  ' Trong đó: Đm

n' ct là số đương lượng mol chất tan

Đương lượng gam:

ZM

Đ v i là số electron trao đổi trong 1 mol, số H+

(OH-) hay ion tham gia phản ứng trung hòa d Mỗi liên hệ giữa một số công thức

- mo t và p ầ trăm: MdCCM*%100*%

Nồng độ đương lượng và nồng độ mol/lit:

Trang 9

BÀI 2 SACCHARIDE I ĐỊNH TÍNH

1 Kiểm tra tính khử của một số saccharide bằng dung dịch Fehling

1.1 Cơ sở lý thuyết

Đường khử là các đường có chứa nhóm chức -OH bán acetal tự do, có thể chuyển hố thành dạng aldehyde (-CHO) mở vịng, do vậy có khả năng cho điện tử (tính khử) trong mơi trường kiềm Các aldose đều có tính khử Các ketose cũng có tính khử do có thể hỗ biến hoá học thành aldose trong môi trường kiềm Một số disaccharide như maltose, lactose, cellobiose cũng có tính khử trong khi các disaccharide khác như saccharose, trehalose, các oligosaccharide và polysaccharide đều không có tính khử Khi phản ứng v i các chất oxy hố, nhóm chức -CHO trong đường khử bị oxy hoá thành axit cacboxylic (hoặc muối cacboxylat tương ứng)

Khi phản ứng v i đường có tính khử, Cu2+ trong thuốc thử Fehling bị khử thành Cu+ tồn tại trong hợp chất Cu2O có màu đỏ gạch

1.2 Tiến hành thí nghiệm

uyê ệu, óa c ất

- Các dung dịch saccharide: glucose, lactose, saccharose, maltose, tinh bột

- Thuốc thử Fehling gồm 2 thành phần Fehling A và Fehling B Cách pha như sau:

+ Fehling A: Hòa tan 69,28 g CuSO4 5H2O trong nư c, định mức đến 1000ml

+ Fehling B: (1) Hòa tan 346 g KNaC4H4O6.4H2O (kali natri tactrat) vào khoảng 400ml nư c; (2) hòa tan 120g NaOH trong khoảng 200ml nư c Trộn (1) và (2), định mức lên 1000ml

Dung dịch Fehling: trộn Fehling A v i Fehling B theo t lệ thể tích 1:1

T ết bị - dụ cụ

- Bếp điện

- 5 ống nghiệm sạch, có đánh số - 5 ống hút nhỏ giọt

T ế à

- Cho vào mỗi ống nghiệm đã đánh số khoảng 1 - 2ml dung dịch saccharide tương ứng và khoảng 1 – 2ml dung dịch Fehling

- Đun các ống nghiệm trên nồi cách thủy khoảng 5-10 phút - Ghi nhận màu các ống nghiệm, giải thích và kết luận

2 Phản ứng của tinh bột v i iodine

Trang 10

hydro giữa các phân tử glucose trong chuỗi amylose khơng hình thành lại được nữa, màu sẽ không hồi phục được

uyê ệu, óa c ất: Thuốc thử Lugol, dung dịch tinh bột T ết bị, dụ cụ: Hai ống nghiệm sạch, đèn cồn

T ề à h

- Cho vào ống nghiệm 1 khoảng 2ml dung dịch tinh bột, thêm vài giọt thuốc thử Lugol, đun nóng hỗn hợp trên nồi cách thủy đến khi dung dịch vừa mất màu, lấy ra làm nguội - Cho vào ống nghiệm 2 khoảng 2ml dung dịch tinh bột, thêm vài giọt thuốc thử Lugol, đun trên ngọn lửa đèn cồn, sau khi dung dịch mất mầu đun tiếp khoảng 3-5 phút (hoặc đun trên nồi cách thủy đang sôi khoảng 40 phút), lấy ra làm nguội

- Ghi nhận kết quả và giải thích sự khác nhau giữa 2 thí nghiệm trên

II ĐỊNH LƯỢNG

1 Xác định hàm lượng đường khử theo phương pháp Bertrand (theo TCVN 4075 – 2009)

Phương pháp này dựa trên khả năng khử Cu2+

trong môi trường kiềm để định lượng các loại aldose, ketose hay các disaccharides có tính khử Ion Cu 2+ có trong dung dịch

Fehling bị khử thành Cu+ (trong hợp chất Cu2O màu đỏ) Cu+

tạo thành bị oxy hóa bởi Fe3+ theo phương trình:

Cu2O +Fe2(SO4)3 + H2SO4 = 2CuSO4 + 2FeSO4 + H2O

Ion Fe2+ sinh ra bị oxy hóa bởi KMnO4 (potassium permanganate) theo phương trình: 10FeSO4 + 2KMnO4 +8H2SO4 = 5 Fe2(SO4)3 + K2SO4 + MnSO4 + 8H2O

Từ lượng dung dịch KMnO4 tiêu tốn, tra bảng Bertrand tính lượng đường khử (reducing

sugar) trong mẫu thí nghiệm

1.2 Thực hành

1.2.1 uyê ệu, óa c ất

a Lấy mẫu

- Mẫu rắn (kẹo, bánh, ): cân mẫu chính xác đến 0,1 mg, sao cho trong 100ml dịch mẫu có khơng q 0,5g đường khử Hịa tan phần mẫu thử bằng 100 ml nư c cất

- Mẫu mật ong: cân chính xác 5 ±0,001 g vào cốc thủy tinh dung tích 50 ml

- Mẫu nư c ngọt đóng chai: pha loãng v i độ pha lỗng thích hợp, sao cho nồng độ đường trong dịch kiểm tra nằm trong gi i hạn chính xác của phương pháp

b Loại bỏ tạp chất

Trang 11

- Thêm vào bình 10 ml dung dịch ZnSO4 1M lắc đều � thêm 20ml NaOH 1M, lắc đều - Thêm nư c đến vạch định mức, chuyển toàn bộ ra bình tam giác 500ml lắc đều và để yên 10 phút, lọc qua giấy lọc khô, sạch, thu được dung dịch mẫu thử

c Hóa chất

- Dung dịch Bertrand: hòa tan 50 g Fe2(SO4)3 trong 500ml nư c, thêm từ từ 100ml H2SO4 đậm đặc (d = 1,84), để nguội và định mức đến 1000ml

- Dung dịch nSO4 1M

- Dung dịch NaOH 1M

- Dung dịch KMnO4 0,02M: hòa tan 3,2 g KMnO4 vào 100ml nư c đựng trong bình định mức 1000 ml, khuấy cho tan hết rồi thêm nư c đến vạch, bảo quản trong bình thủy tinh tối màu

- dung dịch Phenolphtalein 1% trong cồn 600 - Dung dịch Fehling (xem trang 4)

1.2.2 T ết bị dụ cụ

- Cân phân tích v i độ chính xác 0,1mg

- Dụng cụ thủy tinh: bình định mức 250ml; bình nón 250 ml; đũa thủy tinh; pipet 25ml; phễu lọc

- Bộ Buret, dung tích 25ml - Giấy lọc

- Bộ hút lọc chân khơng

- Bộ nồi-bếp có điều chỉnh nhiệt độ

1.2.3 T ế à t ệm

Bư c 1: Đun mẫu v i dung dịch Fehling dư

Lấy chính xác 25ml mẫu thử vào bình tam giác 250ml, thêm 50ml dung dịch Fehling

đun sôi hỗn hợp 3 phút  để lắng kết tủa (Cu2O)

Bư c 2: Lọc rửa kết tủa t i pH trung tính

Lọc, rửa kết tủa v i nư c cất nóng, bằng bình hút lọc chân khơng t i pH trung tính (thử bằng giấy quỳ)

Chú ý: không để kết tủa tiếp xúc trực tiếp v i khơng khí

Bư c 3: Hịa tan kết tủa bằng dung dịch Bertrand Bư c 4: Chuẩn độ Fe2+

bằng dung dịch KMnO4 0,02N (hay 0,1N) đến khi xuất hiện màu

hồng nhạt bền 30 giây thì ngừng chuẩn độ

1.2.4 Kết quả

Từ lượng KMnO4 tiêu tốn, tra bảng Bertrand tính lượng đường tương ứng

Hàm lượng đường khử tính theo glucose, biểu thị bằng phần trăm khối lượng, được tính

Trang 12

Trong đó: m1 là khối lượng đường quy đổi theo Bảng A.1, tính bằng miligam (mg) V1 thể tích dung dịch mẫu thử, tính bằng mililit (ml);

V2 là thể tích dung dịch mẫu thử lấy để xác định, tính bằng mililit (ml); m là khối lượng mẫu, tính bằng gam (g);

1000 là hệ số quy đổi gam thành miligam;

Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, chênh lệch kết quả giữa hai lần xác định đồng thời là ± 0,01% Lấy kết quả chính xác đến 0,01%

Trang 13

Chú ý: lượng mẫu lấy tùy thuộc vào từng mẫu cụ thể, sao cho thể thích KMnO4 chuẩn độ nằm trong bảng A1

2 Xác định hàm lượng đường khử theo phương pháp DNS (3,5-dinitrosalicylic acid)

Thuốc thử DNS (3,5-dinitrosalicylic acid) có màu vàng tươi, trong môi trường kiềm sẽ bị khử bởi đường khử tạo thành 3-amino 5-nitrosalixylat có màu cam đỏ đến nâu đỏ, hấp thụ ánh sáng cực đại ở bư c sóng 540 nm Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng t lệ thuận v i hàm lượng đường khử trong một phạm vi nhất định Dựa vào đồ thị đường chuẩn của glucose tinh khiết v i thuốc thử DNS từ đó tính ra hàm lượng đường khử trong mẫu thí nghiệm

2.2.1 Mẫu vật, óa c ất

a Chuẩn bị mẫu

Tùy thuộc vào loại nguyên liệu mà có cách chuẩn bị dung dịch đường khác nhau

Trường hợp nguyên liệu không chứa quá nhiều tinh bột hoặc inulin, có thể chiết đường từ nguyên liệu bằng nư c cất: v i nguyên liệu khô như hạt, lá, quả khô, cân 1-2 g nguyên liệu (đã được nghiền nhỏ và sấy khô đến khối lượng không đổi); v i nguyên liệu tươi như rau quả, cân 5-10 g nguyên liệu Nghiền nguyên liệu v i bột thu tinh hay cát sạch sau đó

trích ly đường bằng 30 ml nư c cất nóng 70-80oC bằng cách đun sơi cách thủy 10 phút

Tiến hành trích ly 2-3 lần để chiết tách đường Chuyển toàn bộ hỗn hợp vào bình định mức 250 ml Để nguội đến nhiệt độ phịng Kết tủa protein bằng chì axetat hoặc chì nitrat

10% (khoảng 2-3 ml, tránh dùng dư) Loại chì dư ra khỏi hỗn hợp bằng Na2SO4 bão hoà

(khoảng 10 ml), lắc đều và để lắng 5-10 phút Định mức bằng nư c cất đến vạch định mức, lọc qua giấy lọc để thu dịch đường

Trường hợp nguyên liệu chứa nhiều tinh bột hoặc inulin như khoai lang, sắn, khoai tây,

cần chiết đường bằng rượu nóng 70-80oC Đun hỗn hợp trong bình cách thu có lắp ống

làm lạnh khơng khí Tiến hành trích ly 2-3 lần như trên sau đó lọc qua giấy lọc để thu dịch đường Làm bay hơi rượu bằng cách đun cách thu nhẹ Trường hợp này khơng cần kết tủa protein vì lượng protein chuyển vào dung dịch không nhiều

Trang 14

cần xác định riêng đường khử và riêng saccharose Trư c khi đun cách thu hỗn hợp phải được trung hoà acid bằng dung dịch Na2CO3 bão hoà t i pH 6,4 - 7,0

Đối v i các mẫu kẹo, phương pháp lấy mẫu được thực hiện theo TCVN 4067 – 1985: mẫu kẹo được đập nhỏ, sau đó cân chính xác 1-3g kẹo hồ tan trong 100 ml nư c cất ấm b Hoá chất

- Dung dịch glucose chuẩn 1 mg/ml

- Etanol 96%

- Dung dịch Pb(CH3COO)2 10%

- Dung dịch Na2SO4 bão hoà

- Thuốc thử DNS:

+ Cân 1g DNS hoà tan vào 20 ml NaOH 2M, khuấy từ cho tan hoàn toàn

+ Cân 30 g muối K-Na tactrat hòa tan vào 50 ml nư c cất

+ Trộn đều 2 dung dịch v i nhau và định mức đến 100 ml

2.2.2 Dụ cụ , t ết bị

- Máy đo quang phổ UV-VIS

- Cuvet thu tinh hoặc thạch anh 1 cm

- Ống nghiệm

- Pipet

- Bếp đun cách thu

2.2.3 T ế à t ệm

a Dựng đường chuẩn glucose

Pha dãy glucose chuẩn từ 0,2-1 mg/ml Lấy 1 ml dung dịch các dung dịch glucose chuẩn có nồng độ khác nhau này cho vào các ống nghiệm Thêm vào mỗi ống 3 ml thuốc thử

DNS Đun sôi cách thu 5 phút Làm lạnh đến nhiệt độ phòng Đo OD540nm v i đối chứng

là nư c cất Vẽ đường chuẩn glucose v i trục tung là mật độ quang, trục hoành là hàm lượng (mg/ml) glucose

Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5

Hàm ucose m m 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

Dung dịch glucose chuẩn (ml) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

Nư c cất (ml) 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0

Thuốc thử DNS 3 3 3 3 3 3

Đun sôi cách thu 5 phút Làm lạnh đến nhiệt độ phòng Đo OD540

b Xác định lượng đường khử trong mẫu thí nghiệm

Trang 15

Đo OD540nm V i những mẫu có lượng đường khử thấp, thêm 0,1 mg glucose vào mỗi mẫu Cứ 3 ml thuốc thử DNS này sẽ phản ứng hết v i khoảng l0 mg glucose Đối v i dịch đường đậm đặc, cần pha loãng mẫu sao cho mẫu đem phân tích chứa 4 mg đường khử hoặc ít hơn, sao cho khi đo mật độ quang nằm trong khoảng 0,2-0,8

2.2.4 T ết quả

Dựng đường chuẩn glucose

Nồng độ glucose (g/ml)

Từ đường chuẩn glucose y = ax + b và giá trị mật độ quang đo được tính ra hàm lượng

đường khử trong ống thí nghiệm Căn cứ vào hệ số pha lỗng và tổng thể tích dịch đường trong mẫu ban đầu để tính ra hàm lượng đường khử trong nguyên liệu

( ⁄ ) C: hàm lượng đường trong nguyên liệu (mg/g)

X: hàm lượng đường khử trong 1ml dung dịch mẫu pha lỗng (mg/ml)

Vđm: thể tích dịch mẫu ban đầu (ml)

n, m: lần lượt là độ pha loãng và khối lượng mẫu ban đầu

III BÁO CÁO

1 Trong các mẫu đường làm thí nghiệm 1, đường nào có tính khử? Giải thích dựa

vào hiện tượng thu được của thí nghiệm?

2 Màu đặc trưng của tinh bột v i iốt là màu gì? Nguyên lý của sự hình thành màu

đó? Giải thích hiện tượng thu được từ thí nghiệm định tính số 2? Những yếu tố nào dẫn đến sự mất màu của tinh bột và iốt sau khi đun?

3 Trong bài định lượng đường khử theo phương pháp Bertrand Trả lời các câu hỏi

sau:

- Vì sao sau bư c đun mẫu v i Fehling, dung dịch phải còn màu xanh?

Trang 16

- Vì sao phải rửa sạch kết tủa đến pH trung tính? Làm thế nào để kiểm tra kết bư c rửa kết tủa đã đạt yêu cầu?

- Dung dịch Bertrand dùng dư có được khơng? Vì sao?

- Tính kết quả

4 Trong bài định lượng đường khử theo phương pháp acid DNS, trả lời các câu hỏi

sau:

- Giải thích nguyên lý chung của phương pháp định lượng đường khử bằng thuốc thử

DNS

- Dựng đường chuẩn glucose

- Từ đồ thị đường chuẩn, tính lượng đường khử (mg/ml) trong dịch mẫu ban đầu

- Cho biết các nguyên nhân có thể dẫn t i sai số kỹ thuật và cách khắc phục ?

- Trường hợp giá trị OD đo được nằm ngồi đường chuẩn cần làm gì?

- Có thể chọn dung dịch chuẩn khác thay vì glucose hay không?

Trang 17

BÀI 3 LIPID I ĐỊNH TÍNH LIPID

1 Tính tan và sự tạo thành nhũ tương của glyxerit

Glyxerit là este của glyxerol và các acid béo, do vậy glyxerit hồ tan tốt trong các dung mơi khơng phân cực như chloroform, xăng, benzene, tan ít trong các dung môi phân cực như etanol, metanol và không tan trong nư c

Nhũ tương hoá là hiện tượng giọt chất béo dễ bị phân tán thành nhiều giọt nhỏ nhờ tác nhân gây nhũ hố Các chất gây nhũ tương hố có tác dụng làm giảm sức căng bề mặt của giọt chất béo, chất béo bị phân tán thành vô số hạt nhỏ nhờ đó nên dễ dàng phân tán trong mơi trường

uyê ệu, óa c ất: dầu thực vật, cồn 96o, xăng, dung dịch xà phòng

T ết bị, dụ cụ: ống nghiệm, pipet 5ml, ống hút nhỏ giọt T ế à t ệm:

- Chuẩn bị 4 ống nghiệm sạch và đánh số thứ tự 1 – 4 cho các ống nghiệm - Cho vào ông nghiệm 1 – 4 các hoá chất sau:

Ống nghiệm số 1: 2 ml nư c + 1 ml dầu thực vật

Ống nghiệm số 2: 2 ml cồn 96o

+ 1 ml dầu thực vật Ống nghiệm số 3: 2 ml xăng + 1 ml dầu thực vật Ống nghiệm số 4: 2 ml xà phòng + 1 ml dầu thực vật

- Lắc đều các ống nghiệm sau đó quan sát hiện tượng, so sánh và giải thích tính, sự tạo nhũ tương của dầu thực vật trong các loại dung mơi

- Giải thích kết quả

2 Phản ứng xà phịng hóa

Dư i tác dụng của kiềm, triglyxerit bị thủy phân tạo thành glixerol và acid béo Các acid béo sẽ phản ứng v i kiềm (NaOH/KOH) để tạo thành muối natri hoặc muối kali của acid béo (được gọi là xà phịng)

Phương trình phản ứng: CH2CHCH2 OOOCOR3COR2COR1 H2CCHCH2 OHOHOH3NaOH

++ R1COONa + R2COONa + R3COONa

Triglyceride Glycerol Xà phòng

to

Trang 18

T ết bị, dụ cụ: cốc 50 ml, đũa thu tinh, ống nghiệm T ế à t ệm:

Cho vào cốc mỏ 50 ml: 2ml dầu ăn + 10ml dung dịch NaOH đặc (≥10%) trong cồn Vừa đun vừa khuấy đến khi thấy váng màu vàng nhạt (khoảng 15 phút) Lấy đũa thủy tinh v t một ít váng cho vào ống nghiệm, thêm nư c cất, lắc mạnh thấy bọt xà phịng

- Giải thích và viết phản ứng xà phịng hóa lipid

3 Sự tạo thành acid béo tự do

Xà phòng là muối natri hoặc kali của acid béo Dư i tác dụng của acid vơ cơ đặc, acid béo được giải phóng, không tan trong nư c mà nổi trên mặt nư c

uyê ệu, óa c ất: Dung dịch xà phịng, H2SO4 đặc hoặc HCl đặc

T ết bị, dụ cụ: bình tam giác dung tích 100ml, đũa thủy tinh, ống nhỏ giọt T ế à t ệm

- Cho vào bình tam giác 20 ml dung dịch xà phòng, thêm H2SO4 đặc hoặc HCl đặc cho

t i khi mơi trường có pH acid (thử bằng giấy quỳ) � cách thủy 10 phút - Quan sát váng nổi trên mặt nư c

- Giải thích và viết phương trình phản ứng

II ĐỊNH LƯỢNG LIPID

1 Xác định chỉ số acid của chất béo (TCVN 6127: 2010)

Khái niệm: Chỉ số acid là số mg KOH dùng để trung hoà hết acid béo tự do có trong 1g chất béo

Nguyên lý của phương pháp: Mẫu phân tích được hịa tan trong hỗn hợp dung mơi thích hợp để các acid béo tự do hồ tan trong dung mơi sau đó các acid béo tự do được chuẩn độ bằng dung dịch KOH hoặc dung dịch NaOH v i chỉ thị phenolphthalein theo phương trình phản ứng:

R-COOH + KOH = R-COOK + H2O

1.2.1 Mẫu vật, óa c ất

- Dầu thực vật

- Hóa chất: Ethanol, dietyl ete, hỗn hợp dung môi ethanol:dietyl ete 1/1 (v/v), NaOH 0,1 M, phenolphthalein

1.2.2 T ệt bị, dụ cụ

- Thiết bị: Cân phân tích, máy khuấy từ

- Dụng cụ: 3 bình tam giác 250m, bộ buret 25ml, pipet 25ml, ống đong 100ml

Trang 19

Cân 20 – 25 g dầu thực vật cho vào bình nón 250 ml � thêm 50 ml đến 100 ml hỗn hợp dung môi ethanol: dietyl ete (1:1)  hịa tan phần mẫu phân tích bằng cách làm nóng nhẹ  thêm 5 giọt chỉ thị phenolphthalein  chuẩn độ bằng dung dịch chuẩn KOH 0,1M (vừa chuẩn độ vừa khuấy mẫu bằng máy khuấy từ) Việc chuẩn độ được coi là kết thúc khi thêm một giọt kiềm sẽ tạo ra màu hồng nhạt và bền trong ít nhất 30 giây

1.2.4 T ết quả

Chỉ số acid (WAV) được tính theo cơng thức sau:

Trong đó:

C (M)): nồng độ của dung dịch NaOH đã sử dụng V (ml): thể tích của dung dịch NaOH đã sử dụng m (g): khối lượng mẫu phân tích

2 Xác định chỉ số xà phịng hóa của chất béo (TCVN 6126 : 2015)

- Chỉ số xà phòng là số mg KOH dùng để trung hoà acid béo tự do và acid béo có trong liên kết glixerit của 1g chất béo

- Đun sơi mẫu phân tích v i dung dịch KOH trong hệ thống sinh hàn hồi lưu để lipid phản ứng v i KOH theo phương trình phản ứng:

CH2CHCH2 OOOCOR3COR2COR1 H2CCHCH2 OHOHOH3KOH++ 3R-COOKTriglyceride Glycerolto

− Chuẩn độ KOH dư bằng dung dịch chuẩn HCl

KOH + HCl = KCl + H2O (2)

− Từ lượng KOH ban đầu và lượng KOH tính tốn từ phương trình (2) để suy ra chỉ

số xà phịng hố của lipid

- Dầu thực vật

- KOH 0,5M; HCl 0,5 M; phenolphtalein

2.2.2 T ết bị, dụ cụ

Bình nón 250 ml, bộ sinh hàn, buret, pipet

Trang 20

Lấy 2 g mẫu + 25 ml KOH cho vào bình nón 250 ml Nối bộ sinh hàn v i bình nón chứa mẫu, đặt bình lên bếp đun nóng và đun sơi từ từ, thỉnh thoảng lắc nhẹ trong suốt thời gian đun (60 phút) Sau khi đun để cho nhiệt độ bình trở về nhiệt độ phịng sau đó thêm 0,5 ml dung dịch phenolphtalein và chuẩn độ v i HCl 0,5M cho đến khi màu hồng của chất chỉ thị biến mất Tiến hành phép thử mẫu đối chứng theo trình tự như trên nhưng thay bằng 2 g nư c

C ú ý: P e o p ta e bị mất màu tro aOH ặc ó 2.2.4 T ết quả

Chỉ số xà phịng hóa (l) được tính theo cơng thức sau đây:

mCVVl  ( 0  1)* *56,1trong đó:

Vo (ml): thể tích HCl đã sử dụng trên mẫu đối chứng V1 (ml): thể tích HCl đã sử dụng trên mẫu phân tích C (M): Nồng độ dung dịch HCl

m (g): khối lượng mẫu phân tích

3 Xác định chỉ số peroxide của chất béo (theo TCVN 6121:2010)

− Chỉ số peroxyt là số gam I2 giải phóng ra bởi peroxyt có trong 100 gam chất béo

− Chất béo bảo quản trong thời gian dài thì các acid béo khơng no dễ bị oxy hố tạo

thành peroxide CHCHHH + [O]HCHOCHHO(Peroxyt)− Peroxide phản ứng v i KI để giải phóng I2CHHOCHHO + 2 KI + H2OHHCOCHH + 2 KOH + I2− Dùng Na2S2O3 để chuẩn độ I2 bằng chỉ thị tinh bột I2 + 2 Na2S2O3 + NaI + Na2S4O63.2 Thực hành

Dung dịch acid axetic/isooctane 6/4 (v/v), Dung dịch KI bão hòa, dung dịch chuẩn Na2S2O3 0,01N (bảo quản trong chai tối màu, nhiệt độ phòng, sử dụng trong thời gian 30 ngày sau khi pha); dung dịch tinh bột

Trang 21

- Bộ buret

- Bình tam giác 250ml, đũa thủy tinh, pipet

3.2.3 T ế à t ệm

Cho 5 g mẫu + 50 ml dung dịch acid axetic/isooctan vào bình nón, sau đó cho thêm 0,5 ml dung dịch KI bão hịa Đậy bình nón và khuấy nhẹ trên máy khuấy từ trong 15 phút Thêm 100 ml nư c cất và chuẩn độ ngay lượng iodine giải phóng bằng dung dịch chuẩn Na2S2O3 0,01N đến màu vàng cam rồi vàng nhạt Thêm 0,5 ml dung dịch tinh bột thì chuyển từ màu tím đến khơng màu Ngừng chuẩn độ khi dung dịch trở nên không màu trong 15 hoặc 30 giây

Phép thử v i mẫu đối chứng được thực hiện đồng thời v i phép thử trên mẫu phân tích, thay 5 g mẫu bằng 5 g nư c cất

3.2.4 T ết quả

Chỉ số peroxide (PV) tính được bằng cơng thức sau:

mCVoV

PV  (  )* *1000

Trong đó: V (ml): thể tích dung dịch Na2S2O3 dùng trong mẫu phân tích Vo (ml): thể tích dung dịch Na2S2O3 dùng trong mẫu đối chứng

C (M): nồng độ dung dịch Na2S2O3 m (g): Khối lượng mẫu phân tích

4 Xác định chỉ số iodine của chất béo (theo TCVN 6122:2015)

4.1 Cơ sở ý t uyết

- Chỉ số Iodine là số gam I2 cộng vào các liên kết không no của 100 gam chất béo

- Hòa tan phần mẫu phân tích trong dung mơi và cho thêm thuốc thử Wijs Sau thời gian quy định, bổ sung dung dịch KI và nư c, chuẩn độ iôt được giải phóng bằng dung dịch chuẩn natri thiosulfat

Dung dịch KI; dung dịch tinh bột; dung dịch Na2S2O3 0,1M; hỗn hợp dung môi xyclohexan/acid acetic (1:1 (v/v)); Thuốc thử Wijs: Là dung dịch ICl 0,1M trong acid acetic Thuốc thử Wijs được bảo quản trong tối ở nhiệt độ < 30oC Có thể sử dụng thuốc thử Wijs bán trên thị trường nhưng chú ý thời gian sử dụng

- Máy khuấy từ - Bộ buret

- Bình tam giác 250ml, đũa thủy tinh, pipet

Trang 22

Trộn đều 5 g mẫu + 25 ml hỗn hợp dung mơi (xyclohexan/acid acetic) trong bình nón 250 ml sau đó thêm 25 ml thuốc thử Wijs vào hỗn hợp, lắc đều và để trong tối khoảng 1h Thêm 20 ml dung dịch KI + 150 ml nư c và lắc đều rồi chuẩn độ bằng dung dịch Na2S2O3 cho đến khi mất hết màu vàng của iôt Thêm một vài giọt dung dịch tinh bột và tiếp tục chuẩn độ cho đến mất màu xanh hoàn toàn Ghi lại thể tích dung dịch Na2S2O3cần dùng để đạt đến điểm kết thúc chuẩn độ là V2 ml

Phép thử mẫu đối chứng được tiến hành tương tự như trên nhưng khơng bổ sung 5 g mẫu Thể tích dung dịch Na2S2O3 cần dùng để đạt đến điểm kết thúc chuẩn độ là V1 ml

4.2.4 Tính kết quả

Chỉ số iơt (wl) được tính theo cơng thức sau:

mVVCwl 12,69* * 1 2

Trong đó: C (M): nồng độ của dung dịch Na2S2O3

V1 (ml): thể tích dung dịch Na2S2O3 đã dùng trong mẫu đối chứng V2 (ml): thể tích dung dịch Na2S2O3 đã dùng trong mẫu phân tích m (g): khối lượng mẫu phân tích

5 Định lượng lipid bằng phương pháp Soxhlet

Lipid hoà tan tốt trong các dung mơi khơng phân cực do đó phương pháp này sử dụng dung môi không phân cực như ete ethylic nhằm tách hết lipid có trong mẫu nguyên liệu Xác định khối lượng mẫu còn lại sau khi chiết lipid để có thể tính tốn được hàm lượng lipid

- Đậu phộng (lạc)

- Ete ethylic, giấy Whatman No1

Hệ thống Soxhlet, bình hút ẩm, cối sứ, cân phân tích, bình tam giác

5.2.3 T ế à t ệm

- Cân m (g) mẫu (5 – 5,5g) cho vào cối sứ sau đó giã nhỏ mẫu

- Chuyển mẫu đã giã nhỏ vào trong túi giấy và xác định khối lượng ban đầu (mo) - Sắp xếp các gói mẫu vào bộ phận chính của hệ thống Soxhlet

- Lắp ống sinh hàn, sau đó đặt thiết bị vào nồi cách thủy (34-360C) - Cho dung mơi (ete ethylic) vào bình cầu (khoảng 1/3 thể tích bình cầu)

- Tiến hành nâng nhiệt hệ thống nồi cách thu để chiết hết lipid ra khỏi mẫu (6-8h)

Trang 23

Chú ý: Quá trình chiết rút phải thực hiện trong tủ hút Sau khi thí nghiệm xong, ete dư sẽ

được chưng cất thu hồi để sử dụng lần sau

5.2.4 T Kết quả

Lượng lipid tổng số có trong ngun liệu được tính theo cơng thức:

100*)(% 0mmmX  t

Trong đó: X (%): Hàm lượng lipid tổng số

mo (g): Trọng lượng gói nguyên liệu trư c khi chiết rút lipid

mt (g): Trọng lượng gói nguyên liệu sau khi chiết rút lipid và sấy ở 105oC m (g): Khối lượng mẫu ban đầu

6 Xác định hàm lượng lipid tổng số theo phương pháp Folch

Sử dụng hỗn hợp dung mơi Chloroform:Methanol (2:1(v/v)) để hồ tan tất cả lipid trong mẫu, tách l p và chiết qua phiễu lọc nhiều lần Sau khi làm bay hơi hết dung môi, cân chất khơ cịn lại và tính ra hàm lượng lipid tổng số trong 100g mẫu

- Đậu phộng (lạc)

- BHT (Butylated Hydroxy Toluen); chloroform; methanol; NaCl 0,9%

Phễu chiết 100ml, Bình cầu 100ml, Bình định mức 5ml, ống thu tinh có nắp 4 ml và 20ml, ống xilanh, giấy lọc sợi thu tinh GF/C, giá đỡ dụng cụ chiết; Tủ hút; máy đồng hố; máy cơ quay chân khơng; tủ sấy chân khơng

6.2.3 T ế à t ệm

a Tách lipid từ mẫu

Cân m (g) (m: 1 – 1,5 g) mẫu cho vào ống thủy tinh 20ml sau đó cho thêm 5*m

(ml) methanol, 10*m (ml) chloroform và 200 µg BHT Đồng hóa 1 phút, ngâm mẫu trong dung mơi khoảng 10 phút Sau khi ngâm, cho mẫu vào ống xilanh có lót giấy lọc GF/C ở dư i đáy cho dịch mẫu chảy xuống hết hoàn toàn Cho thêm 5 ml methanol, 10ml chloroform vào ống nghiệm 20 ml, đồng hóa trong 20 giây sau đó dung dịch này vào xilanh và dùng pitton để ép tống dung dịch còn lại trong xilanh xuống phễu chiết 100 ml Cho thêm 7,5ml NaCl 0,9% vào phễu chiết chứa dịch mẫu Đảo trộn ngược phễu chiết nhiều lần và giữ mẫu ở 5oC trong 4 giờ để dịch mẫu phân chia thành 2 l p

b Chiết rút dung dịch lipid

Tách l p dư i (chứa lipid hoà tan trong dung môi) cho chảy vào phễu chiết thể tích 100

ml để thu thể tích dịch chiết (Vdm) Loại bỏ l p dịch phía trên (chứa phần hóa hợp gồm

Trang 24

Tiến hành cô quay chân không dịch chiết (Vdm) ở 37oC đến khi thể tích cịn lại khoảng 1ml Cho vào bình cầu 2 – 3 ml chloroform sau đó chuyển mẫu qua bình định mức 5ml, tráng rửa bình cầu nhiều lần và định mức bằng chloroform vừa đủ 5ml

Lấy Vm (ml) dung dịch mẫu đã xử lý ở trên cho vào ống thu tinh 4ml và sấy chân không

đến khối lượng không đổi

6.2.4 T ết quả

Lipid tổng số (%) tính theo cơng thức: *100

***)(%10mdmVTmVmmX 

Trong đó: X (%): Hàm lượng lipid tổng số tính theo trọng lượng khô của mẫu

m1(g): Trọng lượng ống nghiệm 4 ml + mẫu sau sấy

mo(g): Trọng lượng ống nghiệm 4 ml

m (g): Trọng lượng mẫu

Vdm (ml): Thể tích định mức sau xử lý Vm (ml): Thể tích mẫu sau xử lý lấy để sấy T (%): Hàm lượng chất khô của mẫu

III BÁO CÁO

1 Chất béo tan, tạo nhũ tương, không tan trong những dung mơi nào? Giải thích tại

sao?

2 Phân tích vai trị của chỉ số acid, xà phòng, peroxide, iodine trong đánh giá chất

lượng lipid

3 Trình bày ngắn gọn nguyên tắc của các phương pháp định lượng lipid

4 So sánh sự khác nhau của hai phương pháp định lượng lipid (phương pháp soxhlet

Trang 25

BÀI 4 PROTEIN VÀ AMINO ACID I ĐỊNH TÍNH

1 Phản ứng kết tủa thuận nghịch của protein bằng muối trung tính

Khi hịa tan trong nư c hoặc đệm, protein tạo thành trạng thái dung dịch keo Muối trung tính vừa làm trung hịa điện tích, vừa loại bỏ l p vỏ hidrat của hạt keo protein, do vậy làm cho các phân tử protein có xu hư ng liên kết lại v i nhau và bị kết tủa Các protein khác nhau có thể bị kết tủa bởi muối trung tính có nồng độ từ 25-80%, vì vậy có thể dùng muối trung tính để tách riêng protein ra khỏi hỗn hợp

Lịng trắng trứng khơng pha lỗng, (NH4)2SO4 bão hòa, NaCl bão hòa, tinh thể (NH4)2SO4

- Dụng cụ thủy tinh: 4 ống nghiệm sạch, phễu - Giấy lọc

1.2.2.T ế à t ệm

Cho vào ống nghiệm khoảng 1-2cm lòng trắng trứng khơng pha lỗng, 1-2ml (NH4)2SO4

bão hịa  lắc đều xuất hiện kết tủa globulin  để 5 phút, lọc (thấm ư t giấy lọc bằng dịch (NH4)2SO4)  Cho vào dịch lọc 3g tinh thể (NH4)2SO4 (nếu dịch lọc là 4ml)  lắc  lọc albumin kết tủa

Cho riêng kết tủa của globulin và anbumin vào các ống nghiệm tương ứng, thêm vào mỗi ống khoảng 2 – 3 ml nư c cất, lắc, quan sát sự hịa tan kết tủa

2 Sự biến tính protein

Biến tính protein là sự phá vỡ cấu trúc bậc 2,3,4 của phân tử protein dẫn đến thay đổi tính chất và hoạt tính sinh học của protein (như tính tan giảm, khả năng giữ nư c giảm, mất hoạt tính sinh học, ) Biến tính protein có thể dẫn t i hiện tượng đông tụ và kết tủa protein Các yếu tố có thể gây biến tính protein là tia sóng ngắn, tác động cơ học, nhiệt độ cao; pH; muối hữu cơ như guanidine; acid hữu cơ mạnh như TCA (acid tricloaxetic); dung môi hữu cơ như chloroform, etanol ở nhiệt độ thấp, muối kim loại nặng, các chất khử như DTT; enzyme

Khi bị biến tính protein thường đơng tụ v i nhau thành đám không tan Điều này được

thấy rõ khi sự biến tính xảy ra ở pH đẳng điện Nếu sự biến tính xảy ra ở pH khác pHi

(trong môi trường kiềm mạnh hoặc acid mạnh), phân tử protein ở dạng tích điện nên không đông tụ lại mà vẫn ở dạng hòa tan trong dung dịch Tuy nhiên nếu dùng muối trung tính để trung hịa điện tích và phá vỡ l p vỏ nư c của protein thì protein sẽ kết tủa

Trang 26

Các ion kim loại nặng (Cu2+

, Fe3+, Pb2+, Ag+,…) gây phá hủy màng nư c bao quanh phân tử protein, trung hịa điện tích, tạo kết tủa protein Nhưng nếu dư thừa, trên bề mặt phân tử protein hấp phụ thừa các ion kim loại nặng, dẫn đến sự tích điện trái dấu, các phân tử protein đẩy nhau trong dung dịch, protein trở lại trạng thái hịa tan dù bị biến tính hồn tồn

uyê ệu và óa c ất: dung dịch lịng trắng trứng pha lỗng, FeCl3 5%, (CH3COO)2Pb

5%, CuSO4 5%

T ết bị, dụ cụ: ống nghiệm, pipet, đũa thủy tinh T ế à t ệm

- Lấy 3 ống nghiệm, cho vào mỗi ống khoảng 2ml dung dịch lịng trắng trứng đã pha lỗng

- Lần lượt thêm vào từ thành ống nghiệm 1, 2, 3: 1 giọt dung dịch FeCl3 5%, 1 giọt chì

axetat 5%, 1 giọt CuSO4 5%

- Quan sát kết tủa xuất hiện

- Tiếp tục thêm từng giọt muối vào các ống nghiệm ban đầu cho t i khi kết tủa tan ra hoàn toàn So sánh và giải thích kết quả thu được trong 3 ống nghiệm

b) Tác dụng của nhiệt độ cao

uyê ệu và óa c ất: dung dịch lòng trắng trứng, acid axetic 1% và 10%, NaCl bão

hòa

T ết bị, dụ cụ: ống nghiệm, pipet, đũa thủy tinh T ế à t ệm

Cho vào 3 ống nghiệm, mỗi ống 2ml dung dịch lòng trắng trứng Đun ống 1 và theo dõi sự kết tủa dần dần của protein

Thêm vào ống 2: 1 giọt acid axetic 1% và đun, kết tủa protein khơng hình thành trong khi đun và ngay cả khi sôi

Thêm vào ống 3: 0,5 ml acid axetic 10% và 3-4 giọt NaCl bão hòa Đun, protein kết tủa nhanh và nhiều

So sánh và giải thích sự khác biệt về mức độ kết tủa trong các ống c) Tủa protein bằng acid vô cơ đặc

Các acid vô cơ đặc như HNO3, HCl hay H2SO4, … có tác dụng lấy nư c và thay đổi trạng thái tích điện của phân tử keo, do đó gây kết tủa protein

uyê ệu và óa c ất: Dung dịch lịng trắng trứng, HCl đặc T ết bị, dụ cụ: ống nghiệm, pipet, đũa thủy tinh

T ế à t ệm: Cho vào ống nghiệm 1ml HCl đặc, sau đó cầm nghiêng ống, nhỏ

cẩn thận theo thành ống 2ml dung dịch lòng trắng trứng Ở mặt tiếp xúc của hai chất lỏng tạo thành kết tủa protein

Trang 27

Khi cho TCA (acid tricloaxetic) hay acid sunfosalisilic vào dung dịch protein thì protein kết tủa Phản ứng này được dùng rộng rãi trong thực tế: người ta thường dùng acid tricloaxetic để phát hiện hoặc để loại bỏ protein ra khỏi dung dịch, dùng acid sunfosalisilic để phát hiện protein trong nư c giải (phản ứng có độ nhạy đến 0,0015%)

uyê ệu và óa c ất: dung dịch lòng trắng trứng 5%, acid sunfosalisilic, acid

tricloaxetic (TCA) 10%

T ết bị, dụ cụ: ống nghiệm, pipet, đũa thủy tinh

T ế à t ệm: Cho vào ống nghiệm khoảng 1ml dung dịch lòng trắng trứng, thêm

5-10 giọt dung dịch acid sunfosalisilic hay TCA 10% Quan sát sự xuất hiện kết tủa protein và giải thích

3 Phản ứng màu biuret

Đây là phản ứng đặc trưng của liên kết peptit Trong môi trường kiềm các hợp chất chứa

từ 2 liên kết peptit trở lên có thể phản ứng v i CuSO4 trong mơi trường kiềm tạo thành

phức tím xanh đặc trưng Cường độ màu của phức phụ thuộc vào lượng Cu2+ và số lượng

liên kết peptit trong phân tử chất tham gia phản ứng Đây là phản ứng được sử dụng rộng rãi để định lượng protein như phương pháp Lowry, phương pháp microbiuret…

uyê ệu – óa c ất

- Dung dịch lòng trắng trứng đã pha loãng - Ure tinh thể; NaOH 10%; CuSO4 1%

Trang 28

Ống 1: khoảng 1g tinh thể ure, đun nóng trên ngọn lửa đèn cồn Lúc đầu ure nóng chảy đến khi bắt đầu cứng thì ngừng đun Quá trình này tạo ra biuret, acid xianuric và amoniac Ống 2: khoảng 1 – 2ml dung dịch lòng trắng trứng

Thêm vào mỗi ống 2ml NaOH 10%, lắc mạnh, thêm vài giọt CuSO4, quan sát màu (chú ý

khơng cho q nhiều CuSO4 vì màu xanh của Cu(OH)2 được tạo thành có thể lấn át màu

của phản ứng)

1 Xác định hàm lượng protein hoà tan theo phương pháp Bradford

Thuốc thử Bradford có chứa thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 Trong môi trường axit của thuốc thử (pH >2), CBB G-250 tồn tại dư i dạng anion kết hợp protein tạo phức chất có màu xanh lơ hấp thu ánh sáng cực đại ở bư c sóng 595 nm Điều này là do tương tác t nh điện giữa nhóm sulfonic tích điện âm của thuốc nhuộm v i các axit amin kiềm trong phân tử protein và ngoài ra tương tác kị nư c giữa vùng không phân cực của thuốc nhuộm v i các axit amin vòng thơm Axit amin tự do, peptit và các protein có khối lượng phân tử nhỏ hơn 3 kDa không phản ứng v i thuốc thử Cường độ màu của phản ứng t lệ thuận v i hàm lượng protein trong dung dịch trong một gi i hạn xác định Khi sử dụng BSA làm protein chuẩn, phương pháp này tuyến tính trong khoảng hàm lượng protein từ 1-1500 µg/ml Đối v i thực phẩm, phương pháp này được sử dụng để định lượng protein tan trong sữa và các sản phẩm từ sữa, bột ngũ cốc, nư c tương, protein cá, tôm, nấm, …

Trang 29

- Dung dịch BSA chuẩn 2 mg/ml, bảo quản ở -20oC

- Thuốc thử Bradford mua sẵn hoặc tự pha theo cơng thức sau:

+ Hồ tan 50 mg CBB G-250 trong 50 ml methanol, sau đó pha lỗng trong nư c cất

2 lần để được 500 ml dung dịch (1), bảo quản trong chai tối màu, có nắp

+ Pha loãng 100 ml H3PO4 85% trong nư c cất để được 500 ml dung dịch (2)

+ Khi dùng, trộn dung dịch (1) v i (2) theo t lệ 1:1, lọc bỏ cặn bằng giấy lọc Whatman số 1, bảo quản ở 4°C, trong chai tối màu

- Sữa tươi tiệt trùng

- Cuvet thu tinh hoặc thạch anh 1 cm

- Ống nghiệm

- Pipet

1.2.3 T ế à t ệm

a Dựng đường chuẩn BSA

Tuỳ thuộc vào hàm lượng protein trong mẫu mà xây dựng dãy chuẩn BSA cho phù hợp Chuẩn bị 6 ống nghiệm sạch Pha loãng dung dịch BSA chuẩn 2 mg/ml thành các dãy nồng độ khác nhau từ 0,2-1 mg/ml Lấy 0,1 ml các dung dụng protein chuẩn này cho vào mỗi ống nghiệm Sau đó bổ sung thêm 3 ml thuốc thử Bradford Trộn đều bằng vortex, rồi để phản ứng trong 5 phút Đo OD595nm

Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6

BSA m m 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

Dung dịch BSA chuẩn 2 mg/ml (µl) 0 10 20 30 40 50

Nư c cất (µl) 1 90 80 70 60 50

Thuốc thử Bradford (ml) 3 3 3 3 3 3

Trộn đều bằng vortex, để phản ứng trong 5 phút Đo OD595nmb Xác định hàm lượng protein của mẫu thí nghiệm

V i mẫu thí nghiệm, lấy 0,1 ml dịch mẫu đã pha loãng + 3 ml thuốc thử Bradford Thực hiện phản ứng tương tự, đo OD595nm

1.2.4 Kết quả

Trang 30

- Từ đường chuẩn BSA y = ax + b và giá trị mật độ quang đo được tính ra hàm lượng

protein trong ống thí nghiệm (mg/ml)

Căn cứ vào hệ số pha lỗng và thể tích của mẫu ban đầu để tính ra hàm lượng protein trong mẫu thí nghiệm theo công thức

01**VVnXC 

C: hàm lượng protein trong mẫu thí nghiệm (mg/ml)

X: hàm lượng protein trong ống thí nghiệm tính tốn theo đường chuẩn (mg/ml) V1: thể tích dịch mẫu sau pha lỗng (ml)

V0: thể tích dịch mẫu ban đầu (ml) n: độ pha loãng

2 Định lượng protein hoà tan theo phương pháp Lowry

Phương pháp này kết hợp phản ứng biuret (oxy hóa liên kết peptit) và thuốc thử Folin – Ciocalteu (oxy hóa các axit amin Tyr, Trp, Cys, His, Asp) Trư c tiên, protein phản ứng v i Cu2+

trong môi trường kiềm tạo phức Cu1+- protein Tiếp theo, phức Cu1+- protein khử thuốc thử Folin – Ciocalteu (chứa hỗn hợp phosphotungstic axit (H3PW12O40) và phosphomolybdic axit (H3PMo12O40), có màu vàng sáng) thành hỗn hợp các oxit (tungsten oxit (W8O23) và molybdenum oxit (Mo8O23) có màu xanh dương hấp thụ ánh sáng ở bư c sóng 550-750 nm, cực đại ở 660nm hoặc 750nm Cường độ màu của phản ứng tỉ lệ thuận v i nồng độ protein trong một phạm vi nhất định (1-2000 µg/ml) Dựa vào mức độ hấp thụ quang học của dung dịch protein chuẩn, có thể xác định được hàm lượng protein trong mẫu nghiên cứu

Trang 31

- Dung dịch A: Na2CO3 2% trong NaOH 0,1N

- Dung dịch B: CuSO4.5H2O 0,5% trong kali natri tactrat (NaKC4H4O6• 4H2O) 1% - Dung dịch C: trộn 49 ml dung dịch A v i 1 ml dung dịch B (pha trư c khi dùng)

- Thuốc thử Folin-Ciocalteau 2N (Merck): pha loãng 1:1 (v/v) trong nư c cất 2 lần trư c khi sử dụng để được dung dịch 1N

- Dung dịch BSA chuẩn 2 mg/ml

- Cuvet thu tinh hoặc thạch anh 1 cm - Ống nghiệm

- Pipet hút chính xác

2.2.3.T ế à t ệm

Bư c 1 Dựng đường chuẩn BSA: chuẩn bị 6 ống falcon 15 ml sạch Pha loãng dung dịch

protein chuẩn thành dãy protein chuẩn có nồng độ từ 0,2-1 mg/ml, sau đó hút vào mỗi ống các hoá chất theo thứ tự như sau:

Ồng nghiệm 0 1 2 3 4 5

BSA m m 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

1 Dung dịch BSA chuẩn 2 mg/ml (ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 2 Nư c cất (ml) 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 3 Dung dịch C (ml) 4 4 4 4 4 4 Lắc đều, để yên 10 phút 4 Thuốc thử Folin 1N (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Lắc đều để yên 30 phút Đo OD750nm

Bư c 2 Đo nồng độ protein của mẫu thí nghiệm: Cho vào ống nghiệm 1 ml dung dịch

protein mẫu đã pha loãng, thêm 4 ml dung dịch C, lắc đều, để yên 10 phút ở nhiệt độ phòng Sau đó bổ sung thêm 0,5 ml thuốc thử Folin 1N, lắc đều, để yên 30 phút Đo

OD750nm Thực hiện tương tự v i ống đối chứng là nư c cất

2.2.4 Kết quả

- Dựng đường chuẩn BSA (tương tự Mục1.2.3.a trang 24)

- Từ đường chuẩn BSA y = ax + b và giá trị mật độ quang đo được, từ đó tính ra hàm lượng hàm lượng protein trong ống thí nghiệm (mg/ml)

- Căn cứ vào hệ số pha lỗng và tổng thể tích của mẫu ban đầu để tính ra hàm lượng protein trong mẫu thí nghiệm

Trang 32

Trong đó: C: hàm lượng protein trong mẫu ban đầu (mg/ml)

X: hàm lượng protein trong ống thí nghiệm tính tốn theo đường chuẩn (mg/ml)

V1: thể tích dịch mẫu sau pha lỗng (ml)

V0: thể tích dịch mẫu ban đầu (ml) n: độ pha loãng

3 Xác định hàm lượng nitrogen amino acid theo phương pháp chuẩn độ formol (theo TCVN 3707 – 1990)

Amino acid hồ tan trong nư c có tính chất muối nội phân tử, các nhóm amin và

cacboxyl trung hồ lẫn nhau Nhóm –COO

của amino acid bị cản trở bởi các nhóm amin nên khơng thể chuẩn độ trực tiếp được Khi phản ứng v i formol, nhóm amin của amino acid phản ứng v i nhóm aldehyde cho methylene, kết quả của phản ứng là nhóm amin mất tính chất cơ bản của nó, ngược lại nhóm cacboxyl trong amino acid tồn tại dạng methylene khơng bị cản trở và có thể chuẩn độ

Chuẩn độ nhóm –COO- bằng dung dịch NaOH 0,1N cho đến khi dung dịch đạt pH=9,2

Dựa vào lượng kiềm tiêu tốn khi chuẩn độ để tính hàm lượng nitrogen amin-amoniac

- Mẫu nư c mắm pha loãng 20 lần

- dung dịch chuẩn: HCl 0,1N; dung dịch NaOH 0,1N

- dung dịch thuốc thử: bromothimol xanh 0,05% trong etanol 60% (A); phenolphtalein 0,05% trong etanol 60% (B) ; thimolphtalein 1% trong etanol 60% (C)

Trang 33

- Dung dịch đệm pH=7: Pha lẫn 61,2 ml dung dịch Na2HPO4 M/15 v i 38,8 ml dung dịch KH2PO4M/15

- Dung dịch màu tiêu chuẩn pH = 7: trộn 20ml dung dịch đệm pH=7 và 0,1ml dung dịch chỉ thị hỗn hợp, dung dịch có màu xanh lá mạ

- Dung dịch đệm pH 9,2: Cân chính xác 1,9018 Na2B4O7.10H2O, hịa tan bằng nư c cất

và định mức t i 100ml

- Dung dịch màu tiêu chuẩn pH 9,2: trộn 20ml dung dịch đệm pH9,2 v i 1ml dung dịch chỉ thị hỗn hợp, dung dịch có màu tím

- formol trung tính 30%: (50 thể tích formol 30% hòa tan v i một thể tích dung dịch thimolphtalein 1%, nhỏ từ từ dung dịch NaOH 0,1N cho đến khi dung dịch vừa có màu xanh nhạt)

3.2.2 Dụ cụ, t ết bị

Bình định mức dung tích 100 ml, 250ml, 1000ml; bình nón, cốc thủy tinh dung tích 100ml, 250ml; pipet 1ml, 10ml, 25ml; buret 25ml; phễu thủy tinh; giấy lọc, đũa thủy tinh; cân phân tích độ chính xác 0,001g

3.2.3 T ế à t ệm

Dùng pipet lấy chính xác 20ml mẫu vào bình nón dung tích 250ml, thêm 1ml dung dịch chỉ thị hỗn hợp, trung hịa cho t i khi dung dịch có màu giống như dung dịch màu tiêu chuẩn pH = 7 Sau đó dùng pipet cho thêm 20ml dung dịch formol trung tính 30%, đậy bình lại, để n 5 phút

Chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N cho đến khi dung dịch có màu giống như màu của dung dịch màu tiêu chuẩn pH = 9,2

Thí nghiệm tương tự v i mẫu trắng, thay 20ml mẫu bằng 20ml nư c cất

3.2.4 T ết quả

Hàm lượng nitrogen amin – amoniac (X %) được tính theo cơng thức:

)(*4,1201000*20*0014,0*)((%)12 1 2VVVVX   Trong đó:

V1(ml): Thể tích dung dịch NaOH 0,1N tiêu tốn khi chuẩn độ mẫu thử, tính bằng ml;

V2: Thể tích dung dịch NaOH 0,1N tiêu tốn khi chuẩn độ mẫu trắng, tính bằng ml;

0,0014: Số g nitrogen tương ứng v i 1ml dung dịch NaOH 0,1N 20 (trên tử): Độ pha loãng nư c mắm

Trang 34

III BÁO CÁO

1 Trình bày và giải thích hiện tượng các thí nghiệm định tính

2 V i mỗi bài đinh lượng bằng phương pháp đo quang Báo cáo đầy đủ các nội dung sau:

- Trình bày thí nghiệm

- Bảng kết quả đo quang, dựng đường chuẩn BSA

- Từ đường chuẩn và kết quả đo quang của mẫu, tính hàm lượng protein trong mẫu

- Cho biết độ nhạy của phương pháp định lượng mà nhóm đã làm?

- Cho biết các ưu và nhược điểm của phương pháp định lượng đó?

- Cho biết các yếu tố ảnh hưởng đến sai số kỹ thuật của phương pháp?

Trang 35

BÀI 5 VITAMIN I ĐỊNH TÍNH

1 Phản ứng của vitamin C (ascorbic acid ) v i iodine, v i methylene blue

Vitamin C là hợp chất không no, trong cơ thể vitamin C tồn tại dư i hai dạng: dạng khử là ascorbic acid , dạng oxi hóa là dehydro ascobic

Vitamin C có nhiều trong rau, quả, nó tham gia tích cực vào q trình oxi hóa – khử Có thể tiến hành định tính và định lượng Vitamin C theo tính chất hóa học của nó

Khi tham gia phản ứng oxi hóa – khử Vitamin C có thể khử một số chất từ dạng có màu thành khơng màu hoặc từ dạng hóa trị cao xuống hóa trị thấp như: methylene blue, iodine,…

a Phản ứng v i iodine

uyê ệu, óa c ất: dung dịch vitamin C 0,1%, iodine 0,01N, NaOH 5%

T ết bị, dụ cụ: ống nghiệm, pipiet, đũa thủy tinh

T ế à t ệm: lấy 2 ống nghiệm, cho vào ống I: 2ml dung dịch vitamin C, ống II:

2ml nư c cất Sau đó thêm vào mỗi ống 5 giọt dung dịch iodine 0,01N, lắc đều Quan sát, giải thích sự khác biệt giữa 2 ống

b Phản ứng v i methylene blue

uyê ệu và óa c ất: dung dịch vitamin C 0,1%, dung dịch methylene blue 0,01%,

NaOH 5%

T ế à t ệm: Lấy 2 ống nghiệm, cho vào ống I: 1ml dung dịch vitamin C, ống

II: 1ml nư c cất Sau đó thêm vào mỗi ống 1 – 2 giọt methylene blue và 2-3 giọt NaOH 5% Lắc đều và quan sát màu trong hai ống Nếu khơng có sự thay đổi màu, đặt cả hai

ống nghiệm vào nồi cách thủy 37 – 400C Quan sát màu của dung dịch trong ống nghiệm

Trang 36

2 Phản ứng tạo thành thiocrom của vitamin B1 (Thiamine)

Trong môi trường kiềm, dư i tác dụng của ferixianua K3[Fe(N)6], thiamine bị oxi hóa thành thiocrom Hợp chất này sẽ phát huỳnh quang có màu đặc trưng dư i ánh đèn tử ngoại Dư i ánh sáng tự nhiên, hợp chất có màu xanh đặc trưng

Phản ứng xảy ra như sau:

- Dung dịch vitamin B1 1% - NaOH 10%, K3[Fe(N)6] 1% - Cồn izobutylic

T ết bị, dụ cụ: ống nghiệm, pipiet, đũa thủy tinh T ế à :

Cho vào ống nghiệm khoảng 2 ml dung dịch vitamin B1, thêm 10 giọt dung dịch NaOH

10% và 5 giọt, K3[Fe(N)6] 1%, để yên, hỗn hợp trong ống tạo thành hai l p ngăn cách Để ống nghiệm dư i ánh sáng mặt trời hoặc dư i ánh đèn tử ngoại Quan sát sự phân l p, màu đặc trưng giữa 2 l p chất lỏng, giải thích kết quả nhận được

3 Phản ứng vitaminB6 (pyridoxine) v i FeCl3

Dư i tác dụng của FeCl3 pyridoxine sẽ tạo thành phức chất có màu đặc trưng

uyê ệu và óa c ất: dung dịch pyridoxine 1%, FeCl35%

T ế à t ệm: cho vào ống nghiệm 1ml dung dịch pyridoxine 1%, thêm 5 giọt

FeCl3, lắc đều, quan sát sự xuất hiện màu của phức chất Giải thích

4 Phản ứng của vitamin A (Retinol) v i H2SO4

Khi tác dụng v i H2SO4 đặc, vitamin A bị mất nư c tạo thành sản phẩm có màu xanh tím

khơng bền, sau đó chuyển thành sản phẩm có mầu nâu đỏ (mầu đặc trưng của lipocrom)

Trang 37

- H2SO4 đặc

- Clorofom hoặc benzen hoặc xăng

T ết bị, dụ cụ: ống nghiệm, pipiet, đũa thủy tinh T ế à t ệm

Cho vào ống nghiệm khô 2 giọt dầu cá, 2ml dung môi không phân cực như benzene, hoặc clorofom, lắc tan, thêm một vài giọt H2SO4 đặc, lắc, quan sát hiện tượng và giải thích

1 Xác định hàm lượng vitamin C theo phương pháp chuẩn độ iodine

Iodine oxy hóa vitamin C tạo thành acid dehydroascorbic theo phương trình C6H8O6 + I



3 + H2O > C6H6O6 + 3I + 2H+

Khi vitamin C đã bị oxy hóa hết, iodine và triiođua sẽ hiện diện trong dung dịch, phản ứng v i tinh bột tạo nên một hỗn hợp màu xanh đen Màu xanh đen là điểm dừng cho phản ứng chuẩn độ

Mẫu rau, quả

- Dùng dao không rỉ cắt nhỏ 4g nguyên liệu cho vào cối sứ Cho thêm vào cối sứ 10ml HCl 2% Nghiền nhỏ và chắt nư c chiết sang bình tam giác 50ml

- Cho thêm vào 10ml HCl 2% vào cối sứ rồi lại nghiền nhuyễn và chắt dịch chiết sang bình tam giác trên Lập lại quá trình trên đến lần thứ tư

- Dùng 10ml HCl 2% để rửa cối chày sứ

- Chuyển toàn bộ dịch chiết và nư c rửa cối chày sứ sang bình định mức 100ml Cho nư c cất đến vạch định mức

Mẫu viên thuốc vitamin C

- Hòa tan viên thuốc 250mg bằng nư c cất, định mức t i 250ml

1.2.2 T ết bị, dụ cụ - Cối chày sứ - Cân phân tích - Bình định mức 250ml, 500ml - Bình nón 250ml, bình nón 500ml - Pipet 1ml, 5ml, 10ml, 25ml 1.2.3 T ế à t ệm

- Lấy 20ml dịch chiết cho vào bình nón dung tích 250ml - Thêm vài giọt hồ tinh bột khoảng 1%, lắc nhẹ

- Dùng Iodine chuẩn độ đến khi xuất hiện màu xanh lam nhạt (màu của tinh bột và iodine)

Trang 38

(%)*100*000088,0**%mVVVClC

Trong đó: V: thể tích dung dịch Iodine đã chuẩn độ (ml)

V1: thể tích mẫu đem chuẩn độ (ml)

VC: thể tích mẫu ban đầu (ml)

m: Khối lượng mẫu ban đầu (g)

0,000088: số g vitamin C phản ứng v i 1ml dung dịch I ôt 0,01N

2 Xác định hàm lượng vitamin C theo phương pháp 2,6 diclorophenolindophenol (DCPIP) (theo TCVN 6427-2:1998)

Chiết ascorbic acid từ phần mẫu thử bằng dung dịch acid oxalic hoặc dung dịch acid metaphotphoric/acid axetic băng Khử từ từ thuốc nhuộm mầu 2,6 diclorophenolindophenol bằng ascorbic acid , chiết lượng thuốc nhuộm mầu dư bằng xylen và xác định lượng dư này bằng phương pháp đo phổ ở bư c sóng 500nm

a Chuẩn bị mẫu

Bư c 1 Lấy mẫu

- Mẫu rắn (rau, quả tươi, ): dùng dao không rỉ, cắt khoảng 10g mẫu, chính xác đến 0,1mg - Đồ hộp:

+ Nếu sản phẩm dạng lỏng, mở một phần nắp hộp và chuyển toàn bộ sản phẩm vào chai thủy tinh có nút nhám, lắc đều

+ Nếu sản phẩm có cái nư c riêng biệt: mở 1/3 nắp hộp, đổ nhẹ toàn bộ phần nư c vào cốc thủy tinh Sau đó mở hết nắp hộp, cho phần cái vào máy xay nghiền nhỏ, chuyển toàn bộ mẫu sang máy đồng hóa, đồng hóa 1 -2 phút ở tốc độ trung bình Đổ phần nư c vào và đồng hóa tiếp 30 giây Tiến hành lọc mẫu và xác định v i dịch lọc

+ Sản phẩm dạng đơng đặc và khó tách riêng cái nư c như mứt: chuyển toàn bộ mẫu vào máy đồng hóa trong 2 - 3 phút ở tốc độ trung bình

- Viên vitamin C hoặc vitamin tổng hợp: hòa tan bằng nư c cất và định mức sao cho nồng độ vitamin C trong gi i hạn của phương pháp

Bư c 2 Chiết mẫu

Trộn mẫu đã chuẩn bị ở bư c 1 v i dung dịch acid oxalic 2%, sao cho thể tích dịch chiết, tính bằng mililit, gấp từ 1 đến 5 lần khối lượng mẫu thử tính bằng gam

Lọc dung dịch Nồng độ ascorbic acid trong dung dịch thử này khoảng từ 0,05mg đến 0,5mg trong mililit dịch mẫu

Trang 39

- Dung dịch đệm, pH 4,0: Cho 300g natri axetat khan vào 700ml nư c và 1000ml acid axetic băng

- Thuốc nhuộm 2,6 diclorophenolindophenol - Dung dịch Ascorbic acid chuẩn 1g/l

- Xylen (xylen có tác dụng gây mê ở nồng độ cao cho nên tất cả các thao tác liên quan đến việc sử dụng xylen phải tiến hành trong tủ hút)

Kiểm tra độ tinh khiết của xylen như sau:

Cho ascorbic acid vào một lượng nhỏ thuốc nhuộm cho đến khi dung dịch bị phai màu, lắc v i 10ml xylen Để trong 10 phút Nếu có bất kỳ vết màu nào trong l p xylen thì xylen đó phải được chưng cất

Xylen sử dụng trong việc xác định này có thể được thu hồi bằng cách lắc v i dung dịch natri hydroxit 20%( m/m) để trung hòa acid axetic, sau đó chưng cất lại

Sử dụng thiết bị dụng cụ thí nghiệm thơng thường, và - Cân phân tích

- Máy trộn

- Microburet có dung tích 2ml, 5ml và 10ml - Ống li tâm dung tích 25ml có nút thủy tinh - Máy li tâm

- Máy đo phổ, thích hợp để đo ở bư c sóng 500nm

2.2.3 T ế à t ệm

Bư c 1 Chuần hóa dung dịch thuốc nhuộm màu

Pha lỗng 5ml dung dịch ascorbic acid chuẩn v i 5ml dung dịch acid oxalic 2% và chuẩn độ nhanh bằng dung dịch thuốc nhuộm mầu cho đến khi có màu hồng bền ít nhất trong 5 giây

Lặp lại quá trình này thêm hai lần, và ghi lại thể tích dung dịch thuốc nhuộm mầu đã sử dụng cho mỗi lần, chính xác đến 0,1ml

Tiến hành như vậy đối v i mẫu trắng, thay 5ml dung dịch ascorbic acid chuẩn bằng 5ml dung dịch acid oxalic 2%

Bư c 2 Xây dựng đường chuẩn (thể hiện mỗi tương quan giữa thể tích thuốc nhuộm và

giá trị OD đo được)

Chuẩn bị 4 ống ly tâm dung tích l n hơn 25ml, có nắp đậy

Ống ly tâm 0 1 2 3 4

Acid oxalic 2% (ml) 5 5 5 5 5

Dung dịch đệm pH 4 (ml) 5 4,8 4,6 4,4 4,2

Dung dịch thuốc nhuộm 2,6 DCIP (ml)

0 0,2 0,4 0,6 0,8

Dung dịch xylem (ml) 10 10 10 10 10

Trang 40

Đo độ hấp phụ của l p xylen ở bư c song 500nm: lấy cẩn thận l p xylen ở trên và đổ đầy vào Cuvet đo phổ

Thí nghiệm lặp lại 3 lần, chênh lệch giữa các kết quả của hai lần xác định, được thực hiện đồng thời hoặc liên tiếp nhanh bởi cùng một người phân tích trên cùng một mẫu thử, khơng vượt q 3% giá trị trung bình

Bư c 3 Xác định nồng độ vitamin C của mẫu thí nghiệm

Tiến hành tương tự bư c 2 v i 4 ống ly tâm

Ống ly tâm 0 1 2 3 4

Dung dịch mẫu thử (ml) 0 5 5 5 5

Dung dịch đệm pH 4 (ml) 10 5 5 5 5

Dung dịch thuốc nhuộm 2,6 DCIP (ml) 5 5 5 5 5 Dung dịch xylem (ml) 10 10 10 10 10 Lắc mạnh trong 6 đến 10 giây Ly tâm tách l p xylem 2.2.3 Kết quả

- Từ bư c chuẩn hóa dung dịch thuốc nhuộm màu, biểu thị nồng độ dung dịch thuốc nhuộm màu theo khối lượng, tính bằng miligam của ascorbic acid tương đương v i 1,0ml dung dịch

- Xây dựng đồ thị chuẩn

- Hàm lượng ascorbic acid , tính bằng miligam trong 100g sản phẩm theo cơng thức:

100**)(0110mmVVA Trong đó:

m0: khối lượng của phần mẫu thử lấy để xác định, tính bằng gam;

m1: khối lượng ascorbic acid tương đương v i 1,0ml dung dịch thuốc thử, tính bằng miligam;

V0: thể tích dung dịch thuốc nhuộm cho vào, tính bằng mililit;

V1: thể tích thuốc nhuộm dư tương ứng v i độ hấp thụ đo được trong, đọc từ đồ thị chuẩn, tính bằng mililit

A: hàm lượng vitamin C trong mẫu

Những lưu ý trong trình tự thử

- Nếu sản phẩm chứa những sắc tố có thể chiết bằng xylen, hiệu chỉnh mẫu trắng hydroquynon như sau:

Định dạng
Số trang	49
Dung lượng	1,16 MB