Báo cáo thực hành nhập môn công nghệ sinh học bài 1 quy trình hoạt hóa màng

Họ tên: Lê Đức Sơn Mã SV: 16000615 Lớp: K61 CNSH Ca thực hành: Thứ , 9h30-11h BÁO CÁO THỰC HÀNH NHẬP MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC Bài 1: Quy trình hoạt hóa màng Mục đích - Gắn đầu dò đặc hiệu lên màng Đây bước cho phép màng lai tạo cặp bổ sung với sản phẩm PCR đặc hiệu Cơ sở lý thuyết - Đầu dò oligonucleotide allele đặc hiệu đoạn oligonucleotide dài 15-21 nucleotides thiết kế bổ sung đặc hiệu với allele hệ gen Cấu trúc oligonucleotide amino-linker spacer arm - Cấu trúc đầu dò: ● Đầu 5’- NH2: Giúp đầu dị liên kết với gốc COO- màng lai ● Vùng Spacer Arm gồm 12 gốc Carbon: tăng tính linh hoạt đầu dị, giúp cho việc “tìm kiếm” đoạn DNA đặc hiệu dung dịch lai tốt ● Vùng oligo: vùng có trình tự nucleotides thiết kế để lai đặc hiệu với sản phẩm PCR Tính đặc hiệu cao đến mức sai khác nucleotide ảnh hưởng lớn tới khả bắt cặp Nhờ mà kỹ thuật lai điểm ngược phát allen đột biến dù nucleotide - Màng sử dụng cho kỹ thuật lai điểm ngược màng nylon Biodyne C tích điện âm (do gốc COO-) - Các nhóm carboxyl màng hoạt hóa EDC thành dạng O-acylurea Dạng chất trung gian phản ứng với nhóm amin đầu dị oligo thành liên kết amide bền vững 3 Hóa chất, dụng cụ chất cụ - Dụng dịch NaHCO3 0.5M pH8.4 - Panh kẹp, đĩa nhựa - Dung dịch HCl 0.1N - Đồng hồ bấm - Dung dịch hoạt hóa màng EDC 16% - Pipet 1000, pipet 10 - Đầu dò Cd 41/42 N 0.5µM - Đầu loại 1000µl, 10µl - Đầu dị Cd41/42M 7.5µM - Túi zip - Đối chứng dương P+ 0.5µM - Bút, kéo - Đối chứng âm P- 1µM - Đá - Nước cất Cách tiến hành - Đánh dấu chiều màng cách cắt chéo góc bên trái Lấy bút chấm điểm màng lai để chia khu vực cho đầu dị (xem ảnh bên) Chú ý: khơng chạm trực tiếp vào màng lai làm “bẩn” màng, khiến cho q trình gắn đầu dị lên màng không tốt - Để màng vào đĩa nhựa, thêm khoảng 1.5ml HCl 0.1N Đậy nắp lắc nhẹ, ủ 3’ nhiệt độ phòng - Dùng pipet 1000 hút bỏ dung dịch HCl, sau thêm vào khoảng 2ml nước cất để rửa màng (để ngâm khoảng 30s) - Thêm vào đĩa nhựa 2ml dung dịch EDC, ủ 15’ nhiệt độ phịng Trong lúc ủ lắc nhẹ đĩa để dung dịch EDC phủ bề mặt màng - Rửa màng với nước để đến khơ nhiệt độ phịng Chú ý: màng cần khơ hồn tồn tiến hành nhỏ (dot) đầu dị lên Nếu màng chưa khơ, đầu dị nhỏ lên loang khơng đều, dẫn tới nốt bị xấu - Dot 1µl đầu dị đối chứng lên màng theo vị trí định sẵn Khi thao tác, ta cần đẩy dung dịch đầu dị ra, tạo thành giọt nhỏ hình trịn đầu pipet Sau chấm vng góc lên màng lai Nhờ vào lực mao dẫn mà dung dịch đầu dò thấm xuống tỏa xung quanh, tạo thành hình trịn - Để khơ màng 10 phút nhiệt độ phòng - Ủ màng với 1.5ml NaOH 0.1N 10 phút nhiệt độ phòng - Để màng khơ hồn tồn, sau cho vào túi zip bảo quản 4oC để tránh ẩm Giải thích - Dung dịch HCl tạo tính acid cho màng, giúp gốc COO- màng dễ dàng tương tác với EDC - Tác dụng EDC: Quá trình liên kết đồng hóa trị đầu dị amino gốc carboxyl Chúng có tác dụng chất xúc tác Ban đầu liên kết với gốc COO- màng làm thay đổi điện tích nhóm Nhờ mà gốc COO- dễ dàng liên kết với phân tử amin bậc có đầu dị - Dung dịch NaOH có tác dụng loại bỏ gốc COO- thừa hoạt hóa khơng gắn với đầu dị Nếu khơng loại bỏ những gốc hoạt hóa chúng dễ phản ứng với tác nhân có dung dịch, làm giảm độ nhạy kỹ thuật lai - Đối chứng dương P+: + Đây oligonucleotide ngắn, có gắn với biotin + Kiểm tra trình gắn mồi vào màng + Kiểm tra chất có hoạt động hay khơng + Nếu điều kiện tốt, lai màng P+ lên màu xanh - Đối chứng âm P-: + Đây đoạn oligonucleotide ngắn khơng có biotin có khả tương tác với vùng bảo thủ chỗ nối intron-exon sản phẩm PCR + Kiểm tra xem mồi có tương tác với sản phẩm PCR hay không + Nếu tương tác tốt, đối chứng âm cho màu xanh sau lai màng - Nồng độ đầu dị đưa lên màng (đơn vị: µM ; thể tích đưa lên màng: 1µl/đầu dị) + Cd41/42N: 0.5 + Cd41/42M: 7.5 + P+ : 0.5 + P-: Trả lời câu hỏi cuối Câu 1: Tại phải dùng mồi đột biến mồi thường biến Nêu lý mồi có nồng độ khác nhau? Sử dụng mồi đột biến mồi thường biến để xác định xem mẫu bệnh phẩm có chứa đồng thời allen đột biến allen gây bệnh hay không Điều giúp xác định kiểu gen người bình thường, đồng hợp đột biến hay di hợp - Nếu mồi N (normal) bắt màu người bình thường - Nếu mồi M (mutant) bắt màu người đồng hợp bệnh - Nếu mồi lên màu tức người dị hợp allen đột biến Lý mồi có nồng độ khác nhau: - Dù mồi bắt cặp đặc hiệu, dù khác nucleotide ảnh hưởng đến việc mồi sản phẩm PCR có bắt cặp hay không - Tuy nhiên, điều nghĩa khơng có bắt cặp nhầm Và để tối ưu trình bắt cặp này, nồng độ mồi phải điều chỉnh để tương tác đặc hiệu với sản phẩm PCR Câu 2: Tìm vị trí đột biến gene beta-globin hồng cầu người ? Vị trí đầu dị trình tự gene HBB người Tên đầu dị Trình tự 5’-3’ CD17 N NH2-C12-GTGGGGCAAGGTGAACGTG CD17 M (A=>T) NH2-C12-GTGGGGCTAGGTGAACGTG CD26 N NH2-C12-CAGGGCCTCACCACCA CD26 M NH2-C12-TTGGTGGTAAGGCCCT CD41/42 N NH2-C12-CCCAGAGGTTCTTTGAGTCC CD41/42 M (-TCTT) NH2-C12-CCCAGAGGTTGAGTCCTTTG Nhận xét: - Những vị trí khác biệt loại đầu dị bơi màu đỏ - Vị trí Cd17 xảy đột biến điểm thay nucleotide A thành T - Vị trí Cd41/42 xảy đột biến nucleotides TCTT - Theo tài liệu thực hành, vị trí Cd26 xảy đột biến điểm thay nucleotide Tuy nhiên trình tự đầu dị bình thường đầu dị đột biến khác nhiều Thậm chí cịn khơng tìm vị trí đầu dị Cd26 N gen HBB - Nghi ngờ cho sai trình tự đầu dị Cd26 N Bài 2: Quy trình đánh dấu biotin Mục đích - Đánh dấu đoạn DNA có chứa đột biến mà ta cần xác định - Việc đánh dấu nhờ vào phản ứng PCR với tham gia nucleotides dUTP có gắn chất phát huỳnh quang biotin Cơ sở lý thuyết - Về chất, phương pháp PCR thông thường Chỉ khác chỗ phản ứng PCR đánh dấu Biotin bổ sung thêm loại nucleotide tự khác có gắn biotin phân tử bazơnitơ - Cấu trúc nucleotide dUTP có gắn biotin: + Phần cấu trúc điển hình dUTP: gốc phosphate, đường ribose, bazơ nito uridine + Gốc biotin cuối + Phần “đuôi” gồm 11 gốc carbon, nối phân tử biton với gốc bazonito uridine Bởi lẽ phân tử biotin có cấu trúc cồng kềnh, để DNA polymerase bám với dUTP cần phải có cầu nối, đảm bảo tính linh hoạt Cấu trúc nucleotide dUTP-11-Biotin Cấu trúc bazơnitơ Cấu trúc phân tử biotin-11-dCTP (trái) biotin-11-dATP (phải) Hóa chất dụng cụ chất - cụ Hệ genome tách chiết từ hồng - Ống eppendrof 200µl cầu người mang bệnh thiếu máu - Pipet 10 - Mồi ASO-β-F 1µM - Máy PCR - Mồi ASO-β-R 1µM - dNTPs 2mM loại - Dream Taq polymerase (5U/µl) - Đệm Dream Taq polymerase 10X - Biotin-11-dUTP 1mM Cách tiến hành Bài thực hành sinh viên làm Tuy nhiên ta cần phải biết phản ứng PCR làm thành phần cho phản ứng Phản ứng đánh dấu Thành phần Phản ứng không đánh dấu Thể tích (µl) Buffer Dream 3.0 C,G)TP 1mM 2.0 1mM n-11-dUTP 1mM 1.2 0.8 Thành phần Buffer Dream s 2mM hể tích (µl) 1.5 0.5 β-F 1µM ASO-β-R 1µM m Taq (5U/µl) β-F 1µM β-R 1µM 0.2 tổng số 40-50 ng Tổng 30 m Taq (5U/µl) tổng số Tổng 0.1 40-50 ng 15 Giải thích Nồng độ dTTP lớn Biotin-11-dUTP để hạn chế việc biotin gắn nhiều, dẫn tới bắt cặp với lượng lớn enzyme alkaline-phosphatase Khi đưa chất vào lên màu xanh đậm Tỷ lệ dTTp/dUTP-biotin 3/2 Trả lời câu hỏi cuối Câu 1: Vai trò thành phần phản ứng PCR ? Thành phần Nước Buffer Dream Vai trị ỗng nồng độ dung dịch nồng độ cuối tối ưu cho phản ứng PCR ng dịch đệm thích hợp cho phản ứng, đặc biệt cho hoạt động taq polymerase Vai trị ổn định pH môi trường ucleotide tự do: - d(A,C,G)TP - dTTP Biotin-11-dUTP Mồi cấp nucleotide tự cho phản ứng tổng hợp sợi DNA cấp nucleotide tự có gắn phóng xạ Cần thiết cho việc đánh dấu biotin sản phẩm PCR mồi xuôi mồi ngược Chúng gắn vào vị trí đặc hiệu đoạn DNA - ASO-β-F khn làm vị trí khởi đầu cho taq polymerase gắn nucleotide tự - ASO-β-R vào Dream Taq DNA tổng số me bền nhiệt có khả gắn nucleotide tự vào đầu 3’OH mồi Nhờ tổng hợp đoạn DNA n cho phản ứng PCR Câu 2: Tại biotin lại gắn vào đoạn DNA tổng hợp lên ? - Biotin dùng để đánh dấu sản phẩm PCR Nhờ vậy, ta dễ dàng phát vị trí đoạn DNA - Ở này, sản phẩm PCR sau lai với màng Do vậy, nhờ việc đánh dấu biotin, ta biết đầu dị sản phẩm PCR có lai với hay khơng Câu 3: Tại phải có hai phản ứng, đánh dấu không đánh dấu biotin? - Khi làm thí nghiệm, phải ln có dối chứng để kiểm tra bước làm hay tồn thí nghiệm có xảy mong đợi hay không - Ở đây, mẫu khơng đánh dấu có vai trị mẫu đối chứng âm, giúp kiểm tra xem có thực nucleotide gắn biotin gắn vào sản phẩm PCR hay không Và việc điện di kiểm tra điều chắn phải làm Câu 4: Kết kỳ vọng ? - Những đoạn DNA có gắn biotin có khối lượng lớn đoạn DNA kích thước không gắn biotin Do vậy, điện di, mẫu có gắn biotin chạy chậm so với băng DNA mẫu không gắn biotin - Đồng thời, tỉ lệ gắn nucleotide-biotin vào sợi DNA khác Do điện di, sản phẩm PCR tạo thành nhiều băng khác Câu 5: Xác định độ dài đoạn PCR gene beta-globin nhân lên hai mồi Vị trí cặp mồi ASO gene HBB Mồi ASO-F: màu xanh ; mồi ASO-R: màu đỏ Mồi ASO-F, kích thước: 20 nucleotides Trình tự gene 5’-TCC TGA GGA GAA TCT GCC GT-3’ Trình tự mồi 5’-TCC TGA GGA GAA TCT GCC GT-3’ Mồi ASO-R, kích thước: 23 nucleotides Trình tự gene Trình tự mồi 3’-AAC GGG TAT TGT CGT AGT CCT CA-3’ 5’-TTG CCC ATA ACA GCA TCT GGA GT-3’ 5’-GTT GGC CTA AAC GCA TCA GGA GT-3’ Nhận xét: - Độ dài đoạn DNA khuếch đại: 159bp - Những vị trí khơng bắt cặp mồi khuôn bôi màu đỏ - Mồi ASO-R có đến nucleotides khơng bắt cặp Điều để điều chỉnh cho Tm mồi ASO-F ASO-R không bị chênh nhiều, giúp việc chuẩn điều kiện PCR tốt Năm nucleotides không bắt cặp nằm gần đầu 5’ mồi nên không ảnh hưởng nhiều tới khả khuếch đại taq polymerase Bài 3: Phản ứng ARMS-PCR Mục đích - Xác định đột biến điểm gene beta-globin người thông qua phương pháp ARMS-PCR - Nhờ vào mồi đặc hiệu cho allen bình thường allen đột biến, ta biết kiểu gen mẫu bệnh phẩm bình thường, đồng hợp đột biến hay dị hợp - So sánh kết PCR với kết lai màng để biết q trình thí nghiệm có bị sai, phương pháp tốt Cơ sở lý thuyết - Phương pháp dựa đặc tính DNA polymerase yêu cầu nucleotide đầu 3’của mồi bắt cặp bổ sung với nucleotide sợi khn Nếu khơng DNA polymerase khơng thể tổng hợp - Do đó, kỹ thuật địi hỏi nucleotide đầu 3’ mồi phải mang tính đặc hiệu - Khi bổ sung thêm vị trí bắt cặp sai nucleotide cuối mồi làm tăng tính đặc hiệu sản phảm Hóa chất dụng cụ chất - cụ DNA tổng số tách chiết từ hồng - Ống eppendrof 200µl cầu người mang bệnh thiếu máu - Pipet 10 - Mồi 95 NF 10µM - Máy PCR - Mồi Control R 10µM - Mồi 41/42 NF 10µM - Mồi 41/42 MR 10µM - dNTPs 2mM loại A,T,G,C - Gotaq Master Mix 2X Cách tiến hành Ta tiến hành thực phản ứng PCR, với mồi đột biến phản ứng với mồi bình thường Trong đó, phản ứng với mồi bình thường dùng để làm đối chứng âm Ta chọn đối chứng âm chứa mồi bình thường lo sợ bị nhiễm DNA mang allen lành từ môi trường xung quanh Do hầu hết người không bị bệnh β-Thalassemia nên thể có allen bình thường Vì vậy, dễ bị nhiễm DNA mang allen lành làm cho kết PCR khơng xác Phản ứng với mồi bình thường (2 phản ứng) Thành phần phản ứng (µl) Nồng độ cuối Master mix x2 q Master Mix 2X 7.5 1X 15 F 10µM 0.3 0.2µM 0.6 NF 10µM 0.4 0.26µM 0.8 ol R 10µM 0.8 0.53µM 1.6 30-40ng T108 0ng) Tổng 15 26 Sau đó, chia hỗn hợp master mix ống phản ứng thêm vào thành phần sau: Mẫu Đối chứng âm (-) Mẫu N Thể tích ban đầu 13 13 Nước Thêm vào phản ứng 2µl nước DNA Khơng thêm DNA Tổng 15 Khơng thêm nước Thêm vào phản ứng 2µl DNA T108 15 Đơn vị: µl Phản ứng với mồi đột biến (mẫu M) Thành phần Thể tích (µl) 3.5 ồng độ cuối q Master Mix 2X 7.5 1X F 10µM 1.0 0.66µM MR 10µM 0.4 0.26µM ol R 10µM 0.6 0.4µM 2.0 30-40ng T108 0ng) Tổng 15 Điều kiện cho phản ứng PCR: - Mồi bình thường: Nhiệt độ (oC) Thời gian s s 0s 40 chu kỳ - Mồi đột biến: Nhiệt độ (oC) Thời gian 4 s 7s 0s 30 chu kỳ Vấn đề gặp phải Sau pha xong mastermix, giữ ống phản ứng q chặt nên vơ tình bóp thủng ống, dẫn tới thất thể tích Vì vậy, chia phản ứng đủ 13µl, phản ứng bị thiếu khoảng 3µl Bọn em định để phản ứng N+ bị thiếu, cịn đối chứng âm có đầy đủ thể tích Phản ứng mồi đột biến đủ 15µl Giải thích Sự khác biệt nồng độ mồi phản ứng để tối ưu điều kiện cho PCR Cặp mồi 95NF/Control R thiết kế để khuếch đại vùng chứa đột biến nghiên cứu (Cd17, Cd26, Cd41/42) Và vậy, băng DNA lại sử dụng làm khuôn cho mồi bên Lưu ý, mồi bên lại sử dụng lượng khn IC khác cho q trình tổng hợp DNA Tùy vào nồng độ mồi mà băng IC tạo nhiều hay Nếu băng DNA nội kiểm nhiều không đủ nguyên liệu cho tổng hợp đoạn DNA bên Do cần tối ưu nồng độ mồi cho phản ứng PCR đạt hiệu cao Trả lời câu hỏi cuối Câu 1: Nêu vai trò thành phần phản ứng PCR Thành phần H2O Vai trị Pha lỗng nồng độ dung dịch nồng độ cuối tối ưu cho phản ứng PCR Hỗn hợp có đầy đủ thành phần cho phản ứng PCR enzyme taq aq Master Mix polymerase, dNTPs, MgCl2, buffer Các thành phần đưa nồng độ tối ưu cho phản ứng Đặc biệt, Gotaq Master Mix có chứa sẵn dye màu (vàng xanh), giúp cho việc điện di sản phẩm PCR dễ dàng Mồi: - 95 NF - 41/42 NF - 41/42 MR - Control R DNA T108 Đây mồi dùng để khuếch đại đoạn DNA đặc hiệu, cho phép xác định allen đột biến allen bình thường - Cặp mồi nội kiểm (IC) 95NF / Control R xác định có mặt gen beta-globin DNA tổng số - Cặp mồi 41/42NF / Control R xác định allen bình thường - Cặp mồi 95NF / 41/42MR xác định allen đột biến Mẫu DNA tổng số T108, đại diện cho mẫu bệnh phẩm người Câu 2: Kết kỳ vọng - Đối chứng âm (N-) không bị nhiễm - Vì lý thể tích mẫu N+ bị thiếu nên khả cao không lên băng DNA Tuy nhiên, em cho có đủ thành phần, dù thể tích bị thiếu phản ứng xảy ra, khác độ đậm nhạt băng DNA Do vậy, em mong sản phẩm PCR lên băng - Băng DNA cặp mồi nội kiểm lên đẹp mẫu N+ M+ - Một băng DNA, allen đột biến allen bình thường phải lên Khi đó, ta xác định kiểu gen người bệnh - Nếu băng IC băng DNA đột biến mẫu N+ M+ không lên tức phản ứng PCR có vấn đề - Vì tối ưu nồng độ mồi nên băng DNA lên phải có độ đậm Câu 3: Xác định độ dài đoạn PCR gene beta-globin nhân lên mồi - Cặp mồi nội kiểm 95NF/Control R: 700bp - Cặp mồi xác định allen bình thường vị trí Cd41/42: 41/42NF/Control R - 355bp - Cặp mồi xác định allen đột biến vị trí Cd41/42: 95NF/41/42MR - 405bp Vị trí mồi gen beta-globin kích thước sản phẩm PCR tương ứng chúng Bài 4: Điện di sản phẩm ARMS-PCR gel agarose Mục đích - Điện di kiểm tra sản phẩm PCR thực hành số (ARMS-PCR) - Dựa vào kết điện di, ta biết PCR tốt hay không, kiểu gen người bệnh bình thường, đồng hợp đột biến hay dị hơp Cơ sở lý thuyết - Các acid nucleic (DNA RNA) có chứa gốc phosphate phân tử nên tích điện âm pH trung tính kiềm - Do tích điện này, phân tử DNA RNA di chuyển phía cực dương điện trường dòng điện chiều - Tốc độ di chuyển phẩn tử phụ thuộc vào: ● Kích thước phân tử: phân tử nhỏ di chuyển nhanh phân tử lớn ● Cấu trúc phân tử: phân tử có cấu hình gọn di chuyển nhanh phân tử có cấu hình cồng kềnh ● Nồng độ gel: gel agarose đông lại tạo thành cấu trúc mạng lưới, giúp phân tách DNA có kích thước lớn, từ 100bp-vài chục kb Nồng độ gel lớn, khả phân tách tốt - Để quan sát băng DNA, ta sử dụng số thuốc nhuộm ethidium bromide, red safe, sybr safe…Đây chất có khẳ liên kết với mạch đôi phân tử DNA phát huỳnh quang kích thích ánh sáng tia tử ngoại (tia UV) Với EtBr, ta phải nhuộm gel sau điện di Còn với Red safe hay Sybr safe, ta trộn sẵn vào gel agarose pha Hóa chất dụng cụ chất cụ - Sản phẩm ARMS-PCR - Bể điện di - Thang chuẩn DNA 1kb fermentas - Bộ nguồn điện di agarose - Gel agarose 2% có chứa Sybr safe - Pipet 20, đầu côn 200 - Đệm TBE 1X - Máy UV Cách tiến hành - Đặt gel vào bể điện di có đệm TBE 1X - Dùng pipet hút mẫu 15µl sản phẩm PCR (tồn thể tích) tra vào giếng Chú ý: tra thứ tự giếng, tránh chọc đầu côn sâu gây thủng giếng để đầu côn nông gây tràn mẫu - Bật nguồn điện di 100V thấy dye màu (xanh) chạy đến cuối gel - Đưa gel lên máy UV quan sát, chụp ảnh Kết giải thích Kết điện di sản phẩm ARMS-PCR Chú thích: - Thể tích điện di mẫu: 15µl/lane - Marker: 1kb fermentas - Ký hiệu mẫu: + N: mẫu xác định allen bình thường + M: mẫu xác định allen đột biến + V/1: ca thực hành số (thứ 9h30-11h); tổ Nhận xét: - Kết điện di nhóm em (nhóm 4) khoanh vùng màu đỏ - Băng điện di xấu, nguyên nhân có lẽ lúc tra giếng đẫ để đầu côn chọc mạnh vào gel, làm cho bề mặt giếng khơng cịn thẳng mà lõm - Băng IC khơng lên, mẫu M lên băng DNA, mẫu N không lên băng Như phản ứng PCR bị hỏng - Về băng DNA mồi đột biến, mẫu M tổ tổ lên băng kích thước tương đồng Và tổ có băng IC nên ta chắn, băng DNA có kích thước 405bp - IC khơng lên mẫu M lại lên băng Nghi ngờ mồi bắt cặp khơng đặc hiệu, dẫn đến tượng dương tính giả - đặc điểm thường thấy ARMS-PCR Về nguyên nhân PCR bị hỏng: - Do DNA khuôn: lý bị loại bỏ tổ sử dụng mẫu DNA T108 cho kết PCR đẹp Băng IC chứng tỏ mẫu DNA T108 có diện gen beta-globin - Do hóa chất: Tổ dùng chung hóa chất với nhau, khác DNA khuôn đưa vào Mẫu M tổ lên đẹp, chứng tỏ Gotaq, mồi nội kiểm 41/42MR tốt Tuy nhiên, nhóm khơng lên băng mẫu N Có thể mồi 41/42NF bị hỏng, khả thấp - Do thao tác: Mẫu N bị thiếu thể tích q trình pha master mix bị lỗi nên phần hiểu lý khơng lên băng Cịn mẫu M thao tác nhả pipet khơng hết, cịn dính hóa chất đầu cơn, dẫn đến thành phần phản ứng bị thiếu Nghi ngờ mồi Control R bị thiếu, dẫn đến không lên băng IC Kết luận: - Tuy băng DNA mẫu M lên kích thước (405bp, qua so sánh với nhóm 4) khả cao bắt cặp không đặc hiệu - Nội kiểm mẫu M không lên thao tác lấy thiếu mồi Control R - Mẫu N không lên thành phần phản ứng thiếu trình pha master mix bị hỏng Trả lời câu hỏi cuối Câu 1: Nêu thành phần tác dụng chất có dye điện di Thành phần Tác dụng - Có tác dụng kéo sợi DNA xuống đáy giếng, giúp chúng tập trung lại, tạo thành băng điện di Chất nặng - Chất nặng thường Glycerol, ficoll - Làm thị giúp ta ước lượng tốc độ chạy mẫu DNA gel - Chất màu có tốc độ chạy tương đương với băng DNA kích thước định điều kiện định (tùy vào chất màu gì) Chất màu - Dựa vào tốc độ chạy chất màu, ta suy đốn băng DNA chạy đến phần gel định nên dừng hay tiếp tục điện di Liên kết với ion kim loại hóa trị 2, đặc biệt Mg2+ Bởi chúng EDTA cofactor cho nuclease Qua làm giảm thiểu khả DNA bị phân hủy trình điện di Câu 2: Thang chuẩn (Marker) sử dụng điện di gì, tác dụng? Thang chuẩn tập hợp đoạn DNA biết sẵn kích thước Dựa vào chúng, ta ước lượng kích thước băng DNA Việc giúp xác định băng DNA mà ta vừa khuếch đại có băng DNA đặc hiệu sản phẩm phụ Bài 5: Quy trình lai điểm ngược Mục đích - Thực lai màng nhằm xác định dạng đột biến gen beta-globin - Quá trình tiếp nối việc hoạt hóa màng sử dụng sản phẩm PCR có đánh dấu biotin 2 Cơ sở lý thuyết - Sản phẩm PCR có gắn biotin lai với đầu dò đặc hiệu màng - Dựa vào bắt cặp đặc hiệu q trình phát tín hiệu huỳnh quang biotin, ta xác định mẫu bình thường mẫu đột biến Hóa chất dụng cụ chất cụ - Dung dịch tiền lai (SSC 6X, SDS 0.1%, Denhartd 5X) - Panh kẹp - Đĩa nhựa - Đệm lai - Đồng hồ bấm - Dung dịch rửa W - Pipet 1000, đầu côn 1000 - Tủ sấy - Bể ổn nhiệt - Đá (SSC 6X, SDS 0,1%) - Dung dịch rửa U1 (Tris-HCl 0.1M pH7.6 ; NaCl 0.15%) - Dung dịch rửa U2 (Tris-HCl 0.1M pH9.5 ; NaCl 0.1M ; MgCl2 0.05M) - Dung dịch tween 20 - Dung dịch SA-AP - Cơ chất enzyme Alkaline Phosphatase Cách tiến hành ý nghĩa bước STT Bước làm Cho dung dịch tiền lai vào tủ sấy nhiệt độ Hòa tan SDS dung dịch tiền lai 60oC-15’ Đặt màng lai vào đĩa nhựa, thêm vào Ý nghĩa đĩa 1ml dung dịch tiền lai Sau đặt đĩa vào tủ sấy để ủ 60oC-15’ (trong trình ủ (SDS tủa 4oC trở xuống) Dung dịch tiền lai để kiểm soát bước rửa nghiêm ngặt Dung dịch cân bằng, bão hòa tối ưu điều kiện trước tiến hành lai có thể lắc đĩa vài lần để đảm bảo mang ủ dung dịch tiền lai) Trong ủ màng với dung dịch tiền lai, ta tiến hành biến tính đêm lai 95oC-10’ Kết Giai đoạn biến tính 95oC để tách thúc thời gian cắm đệm lai biến mạch sợi đơi DNA thành sợi đơn tính lên đá ủ 5’ Sau ủ đá để ức chế hồi tính Chú ý: dung dịch đệm lai có sẵn sản phần tử DNA phẩm PCR đánh dấu biotin Dùng pipet hút bỏ dung dịch tiền lai, sau Tạo điều kiện cho sản phẩm PCR mạch bổ xung dung dịch đệm lai vào đĩa đến ngập đơn lai với đầu dò đặc hiệu màng Ủ màng 60oC-60’ Dùng pipet hút bỏ dịch đệm lai Bổ sung vào đĩa 1ml dung dịch rửa W, ủ nhiệt độ phòng 5’ Ta rửa với dung dịch W lần Loại bỏ sản phẩm PCR sợi đơn thừa không bắt cặp với đầu dò Trong lúc đợi màng ủ với dung dịch W, ta tiến hành pha dung dịch U1 có chứa tween (0.05%) Cách pha: lấy 1µl tween (100%) bổ sung vào 2ml dung dịch U1, ta thu dung dịch U1 có chứa tween 0.05% Cách làm: lấy 0,3µl dung dịch SA-AP bổ sung vào với 1ml dung dịch U1 Ủ nhiệt độ phòng 30’ 10 gắn với enzyme Alkaline phosphatase (giống với bước tiền lai) tween 0.05%, ủ nhiệt độ phòng 15’ với tỉ lệ SA-AP : U1 = 3:10000 Blocking màng dung dịch U1 có chứa Ủ màng với dung dịch U1 có bổ sung SA-AP Blocking tất yếu tố có khả Rửa màng lần với U1, lần ủ nhiệt độ phòng 5’ Rửa màng với U2, ủ nhiệt độ phòng 5’ Gắn phức hệ streptavidin-alkaline phosphatase vào gốc biotin sản phẩm PCR (lúc gắn với màng thơng qua đầu dị) Loại bỏ SA-AP thừa Tạo mơi trường pH thích hợp cho enzyme Alkaline Phosphatase Cơ chất BCIP bị enzyme alkaline Thêm lên màng 500µl chất enzyme phosphatase loại bỏ nhóm phosphate 11 Alkaline Phosphatase, ủ tối khoảng Khi đó, dung dịch NBT-BCIP vàng nhạt 1h30’ chuyển sang dạng tủa xanh dương Kết màng lai có màu xanh đặc trưng 12 Rửa màng lai với nước Để loại bỏ chất thừa, giúp cho việc quan sát kết lai màng dễ dàng Giải thích Khi thêm chất BCIP lên màng, chúng bị enzyme alkaline phosphatase loại bỏ nhóm phosphate Kết dung dịch NBT-BCIP màu vàng nhạt bị chuyển sang màu tủa xanh dương Nếu tốt, phần tủa màu xanh dương bám màng vùng có biotin, vùng là: - P+: đoạn oligo có gắn với biotin - Những vùng có bắt cặp với sản phẩm PCR gắn biotin Đó vị trí P-, đầu dị với mẫu bình thường N mẫu đột biến M Cơ chế phát màu trình lai điểm ngược Tuy nhiên, lượng streptavidin-alkaline phosphatase đưa vào nhiều, việc rửa trôi phức hệ enzyme thừa không liên kết với biotin khó khăn Do vậy, ủ với chất, kể vị trí khơng gắn biotin màng lai có màu xanh Kết màng có màu xanh nhạt thay màu trắng vốn có Phân tích kết Kết phương pháp lai điểm ngược xác định đột biến điểm Cd41/42 Nhận xét: - Kết lai màng đẹp, dot tròn, màu xanh lên đẹp, phần màng lai màu trắng - Cả P+ P- lên màu đẹp, quy trình lai màng tốt, khơng xảy sai sót - P+ lên màu đậm thân oligo có sẵn biotin Cịn mẫu cịn lại phải phụ thuộc vào lượng biotin thơng qua số sản phẩm PCR bắt cặp với chúng Lượng DNA bắt cặp với đầu dị nhiều màu lên đậm - Đầu dị xác định allen bình thường lên màu, allen đột biến không lên - Sản phẩm PCR không lên băng IC, nên kết khơng đáng tin Cịn kết lai màng lại tốt, ta hồn tồn tin tưởng - Như mẫu DNA T108 có kiểu gen bình thường, khơng chứa đột biến vị trí Cd41/42 Các phương pháp xác định đột biến điểm - Lai oligonucleotide đặc hiệu allen Nguyên tắc lai DNA Các bazơnitơ hai sợi đơn DNA liên kết với theo nguyên tắc bổ sung + Southern blot + DNA microarray + Zinc finger, Cas9-nickase + Lai điểm (dot blot): trình tự DNA đích cố định màng nylon, sau lai với đầu dị đánh dấu + Lai điểm ngược (reverse dot blot): đầu dò cố định màng nylon, sau lai với DNA đánh dấu - Mồi đặc hiệu allen Nguyên tắc mồi PCR bắt cặp hồn tồn với khn có hiệu kéo dài so với mồi bắt cặp sai + ARMS-PCR + Multiples ARMS-PCR - Giải trình tự Nguyên tắc tổng hợp sợi DNA Trong trình tổng hợp, dừa vào tín hiệu đặc trưng phương pháp mà ta biết xác nucleotide vừa gắn vào + Sanger, illumina, pyrosequencing + Massarray