(Tiểu luận) thực hành hóa sinh học bài 1 quy tắc làm việc trong phòng thí nghiệm hóa sinh

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG BỘ MÔN SINH HỌC ThS PHẠM THỊ MAI (Chủ biên) TS PHẠM THU THỦY TS NGUYỄN CÔNG MINH THỰC HÀNH HÓA SINH HỌC NHA TRANG - 2020 h MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT LỜI MỞ ĐẦU BÀI QUY TẮC LÀM VIỆC TRONG PHỊNG THÍ NGHIỆM HĨA SINH I NỘI QUY II KỸ THUẬT PHỊNG THÍ NGHIỆM HĨA SINH iii iv 1 1 Một số hình cảnh báo nguy hiểm Thao tác an toàn Sơ cứu phịng thí nghiệm Pha hóa chất BÀI SACCHARIDE I ĐỊNH TÍNH 4 Kiểm tra tính khử số saccharide dung dịch Fehling Phản ứng tinh bột v i iodine II ĐỊNH LƯỢNG Xác định hàm lượng đường khử theo phương pháp Bertrand (theo TCVN 4075 – 2009) Xác định hàm lượng đường khử theo phương pháp DNS (3,5-dinitrosalicylic acid) BÀI LIPID I ĐỊNH TÍNH LIPID 12 12 Tính tan tạo thành nhũ tương glyxerit 12 Phản ứng xà phịng hóa 12 Sự tạo thành acid béo tự 13 II ĐỊNH LƯỢNG LIPID 13 Xác định số acid chất béo (TCVN 6127: 2010) 13 Xác định số xà phịng hóa chất béo (TCVN 6126 : 2015) 14 Xác định số peroxide chất béo (theo TCVN 6121:2010) 15 Xác định số iodine chất béo (theo TCVN 6122:2015) 16 Định lượng lipid phương pháp Soxhlet 17 Xác định hàm lượng lipid tổng số theo phương pháp Folch 18 BÀI PROTEIN VÀ AMINO ACID I ĐỊNH TÍNH 20 20 Phản ứng kết tủa thuận nghịch protein muối trung tính 20 Sự biến tính protein 20 Phản ứng màu biuret 22 II ĐỊNH LƯỢNG 23 Xác định hàm lượng protein hoà tan theo phương pháp Bradford 23 Định lượng protein hoà tan theo phương pháp Lowry 25 Xác định hàm lượng nitrogen amino acid theo phương pháp chuẩn độ formol (theo TCVN 3707 – 1990) 27 i h III BÁO CÁO BÀI VITAMIN I ĐỊNH TÍNH 29 30 30 Phản ứng vitamin C (ascorbic acid ) v i iodine, v i methylene blue 30 Phản ứng tạo thành thiocrom vitamin B1 (Thiamine) 31 Phản ứng vitaminB6 (pyridoxine) v i FeCl3 31 Phản ứng vitamin A (Retinol) v i H2SO4 31 II ĐỊNH LƯỢNG 32 Xác định hàm lượng vitamin C theo phương pháp chuẩn độ iodine 32 Xác định hàm lượng vitamin C theo phương pháp 2,6 diclorophenolindophenol (DCPIP) (theo TCVN 6427-2:1998) 33 III BÁO CÁO BÀI 6: ENZYME I ĐỊNH TÍNH 36 37 37 Kiểm tra hoạt tính enzyme amylase 37 Ảnh hưởng nhiệt độ, pH t i hoạt tính amylase 37 II ĐỊNH LƯỢNG 38 Xác định hoạt độ protease theo phương pháp Anson cải tiến 41 III BÁO CÁO TÀI LIỆU THAM KHẢO 43 44 ii h DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT C%: nồng độ phần trăm CM: nồng độ mol/lit Vdd: thể tích dung dịch Vdc: thể tích dung chất mct: khối lượng chất tan mdd: khối lượng dung dịch ddd: khối lượng riêng dung dịch nct: số mol chất tan iii h LỜI MỞ ĐẦU Bài giảng “Thực hành hóa sinh” tài liệu thức dành cho sinh viên năm thứ ngành: công nghệ thực phẩm, công nghệ chế biến, công nghệ sau thu hoạch công nghệ sinh học V i thời lượng 30 tiết, nội dung thực hành gồm sau: Bài 1: Quy Tắc làm việc phịng thí nghiệm Hóa sinh Bài 2: Saccharide Bài 3: Lipid Bài 4: Protein amino acid Bài 5: Vitamin Bài 6: Enzyme Tùy vào điều kiện phịng thí nghiệm, tùy vào đặc trưng ngành, giảng viên định chọn nội dung định lượng cho phù hợp iv h BÀI QUY TẮC LÀM VIỆC TRONG PHỊNG THÍ NGHIỆM HĨA SINH I NỘI QUY Sinh viên phải tham gia đầy đủ buổi thực hành Trường hợp bất khả kháng, phải viết giấy phép bù vào nhóm Sinh viên phải xem trư c buổi thực hành Nếu khơng, buộc phải nghỉ buổi Mỗi nhóm giao dụng cụ tự bảo quản suốt trình thực hành Sau buổi thực hành, nhóm tự vệ sinh khu làm việc, dọn rửa dụng cụ nhóm Trang phục quy định: mặc áo blouse, quần dài, mang trang, dép quai hậu giày bệt, cột tóc gọn gàng Nghiêm cấm ăn, uống, nô đùa phịng thí nghiệm II KỸ THUẬT PHỊNG THÍ NGHIỆM HĨA SINH Một số hình cảnh báo nguy hiểm h Thao tác an toàn 2.1 Làm việc với hóa chất - Phải đọc kỹ thơng tin ghi nhãn chai lọ đựng hóa chất - Phải thao tác tủ hút v i hóa chất bay như: acid, kiềm nóng, dung mơi hữu (chloroform, hexan, ethe, …), … - Phải thêm từ từ acid kiềm vào nư c pha lỗng, khơng làm ngược lại - Tuyệt đối khơng hút hóa chất miệng - Khơng để hóa chất dễ cháy nổ gần nơi nguồn nhiệt 2.2 Làm việc với trang thiết bị phịng thí nghiệm - Đối v i thiết bị, máy móc: Chỉ sử dụng hư ng dẫn phải tuân thủ tuyệt đối hư ng dẫn cán PTN giảng viên Phải ghi nhật ký vệ sinh cách sau lần sử dụng - Đối v i dụng cụ thủy tinh: thao tác cẩn thận tránh để vỡ (khi vỡ phải bỏ vào nơi quy định phòng thí nghiệm, khơng bỏ thùng rác), đun pha kiềm pha loãng acid phải dùng dụng cụ thủy tinh chịu nhiệt thao tác tủ hút Sơ cứu phịng thí nghiệm - Bỏng (nhiệt, acid, kiềm): xả nhanh nhiều nư c nơi bị bỏng - Trầy xư c da, chảy máu: xả nhiều nư c trư c băng bó - Điện giật: ngắt cầu giao tổng phòng trư c sơ cứu - Hỏa hoạn phịng thí nghiệm: v i lửa nhỏ dùng khăn chuyên dụng để dập tắt, v i lửa l n dùng bình xịt cứu hỏa Trường hợp bị cháy lên người: lăn vài vịng xuống đất, bạn khác dùng khăn to, bình xịt để dập Pha hóa chất a Nồng độ phần trăm C%  ww: mct * 100 (%) mdd mdd  Vdd ( ml) * d ( g / ml) VD: dung dịch NaCl 10% (w/w): Trong 100g dung dịch có 10g NaCl tinh thể t tc wv: C%  mct * 100 (%) Vdd VD: dung dịch CuSO4 10% (w/v): 100ml dung dịch có 10g CuSO4 tinh thể t tc t tc vv: C%  Vdc * 100 (%) Vdd VD: dung dịch glixerol 10%: 100ml dung dịch có 10ml glixerol nguyên chất h b Nồng độ mol/l: số mol chất tan có lit dung dịch: C M  nct Vdd c Nồng độ đương lượng gam (CN): số đương lượng gam chất tan có lit dung dịch: C N  n' V n'  Trong đó: mct số đương lượng mol chất tan Đ Đương lượng gam: Đ  M v i Z số electron trao đổi mol, số H+ (OH-) hay ion tham gia phản ứng trung hòa d Mỗi liên hệ số công thức - mo t p ầ trăm: C M  C % * d 100 % * M mct * Z mct  M *V Đ *V Nồng độ đương lượng nồng độ mol/lit: C N  CM * Z  Nồng độ phần trăm thể tích tương ứng: C1%*V1=C2%*V2 h BÀI SACCHARIDE I ĐỊNH TÍNH Kiểm tra tính khử số saccharide dung dịch Fehling 1.1 Cơ sở lý thuyết Đường khử đường có chứa nhóm chức -OH bán acetal tự do, chuyển hố thành dạng aldehyde (-CHO) mở vịng, có khả cho điện tử (tính khử) mơi trường kiềm Các aldose có tính khử Các ketose có tính khử hỗ biến hố học thành aldose môi trường kiềm Một số disaccharide maltose, lactose, cellobiose có tính khử disaccharide khác saccharose, trehalose, oligosaccharide polysaccharide tính khử Khi phản ứng v i chất oxy hố, nhóm chức -CHO đường khử bị oxy hoá thành axit cacboxylic (hoặc muối cacboxylat tương ứng) Khi phản ứng v i đường có tính khử, Cu2+ thuốc thử Fehling bị khử thành Cu+ tồn hợp chất Cu2O có màu đỏ gạch 1.2 Tiến hành thí nghiệm u ệu, óa c ất - Các dung dịch saccharide: glucose, lactose, saccharose, maltose, tinh bột - Thuốc thử Fehling gồm thành phần Fehling A Fehling B Cách pha sau: + Fehling A: Hòa tan 69,28 g CuSO4 5H2O nư c, định mức đến 1000ml + Fehling B: (1) Hòa tan 346 g KNaC4H4O6.4H2O (kali natri tactrat) vào khoảng 400ml nư c; (2) hòa tan 120g NaOH khoảng 200ml nư c Trộn (1) (2), định mức lên 1000ml Dung dịch Fehling: trộn Fehling A v i Fehling B theo t lệ thể tích 1:1 T ết bị - dụ cụ - Bếp điện - ống nghiệm sạch, có đánh số - ống hút nhỏ giọt Tế - Cho vào ống nghiệm đánh số khoảng - 2ml dung dịch saccharide tương ứng khoảng – 2ml dung dịch Fehling - Đun ống nghiệm nồi cách thủy khoảng 5-10 phút - Ghi nhận màu ống nghiệm, giải thích kết luận Phản ứng tinh bột v i iodine 2.1 Cơ sở lý thuyết Tính chất hóa học đặc trưng tinh bột tạo phức màu xanh v i iodine Tính chất thành phần amylose tinh bột định Màu xanh bị đun nóng hồi phục lại sau làm lạnh Tuy nhiên đun nóng mạnh, liên kết h hydro phân tử glucose chuỗi amylose khơng hình thành lại nữa, màu khơng hồi phục 2.2 Tiến hành thí nghiệm u ệu, óa c ất: Thuốc thử Lugol, dung dịch tinh bột T ết bị, dụ cụ: Hai ống nghiệm sạch, đèn cồn Tề h - Cho vào ống nghiệm khoảng 2ml dung dịch tinh bột, thêm vài giọt thuốc thử Lugol, đun nóng hỗn hợp nồi cách thủy đến dung dịch vừa màu, lấy làm nguội - Cho vào ống nghiệm khoảng 2ml dung dịch tinh bột, thêm vài giọt thuốc thử Lugol, đun lửa đèn cồn, sau dung dịch mầu đun tiếp khoảng 3-5 phút (hoặc đun nồi cách thủy sôi khoảng 40 phút), lấy làm nguội - Ghi nhận kết giải thích khác thí nghiệm II ĐỊNH LƯỢNG Xác định hàm lượng đường khử theo phương pháp Bertrand (theo TCVN 4075 – 2009) 1.1 Cơ sở lý thuyết Phương pháp dựa khả khử Cu2+ môi trường kiềm để định lượng loại aldose, ketose hay disaccharides có tính khử Ion Cu 2+ có dung dịch Fehling bị khử thành Cu+ (trong hợp chất Cu2O màu đỏ) Cu+ tạo thành bị oxy hóa Fe3+ theo phương trình: Cu2O +Fe2(SO4)3 + H2SO4 = 2CuSO4 + 2FeSO4 + H2O Ion Fe2+ sinh bị oxy hóa KMnO4 (potassium permanganate) theo phương trình: 10FeSO4 + 2KMnO4 +8H2SO4 = Fe2(SO4)3 + K2SO4 + MnSO4 + 8H2O Từ lượng dung dịch KMnO4 tiêu tốn, tra bảng Bertrand tính lượng đường khử (reducing sugar) mẫu thí nghiệm 1.2 Thực hành 1.2.1 u ệu, óa c ất a Lấy mẫu - Mẫu rắn (kẹo, bánh, ): cân mẫu xác đến 0,1 mg, cho 100ml dịch mẫu có khơng q 0,5g đường khử Hịa tan phần mẫu thử 100 ml nư c cất - Mẫu mật ong: cân xác ±0,001 g vào cốc thủy tinh dung tích 50 ml - Mẫu nư c đóng chai: pha lỗng v i độ pha lỗng thích hợp, cho nồng độ đường dịch kiểm tra nằm gi i hạn xác phương pháp b Loại bỏ tạp chất - Chuyển tồn dung dịch thử vào bình định mức dung tích 250 ml tráng lại nư c (tồn lượng nư c bình khoảng 150 ml) h BÀI VITAMIN I ĐỊNH TÍNH Phản ứng vitamin C (ascorbic acid ) v i iodine, v i methylene blue 1.1 Cơ sở lý thuyết Vitamin C hợp chất không no, thể vitamin C tồn dư i hai dạng: dạng khử ascorbic acid , dạng oxi hóa dehydro ascobic Vitamin C có nhiều rau, quả, tham gia tích cực vào q trình oxi hóa – khử Có thể tiến hành định tính định lượng Vitamin C theo tính chất hóa học Khi tham gia phản ứng oxi hóa – khử Vitamin C khử số chất từ dạng có màu thành khơng màu từ dạng hóa trị cao xuống hóa trị thấp như: methylene blue, iodine,… 1.2 Thực hành a Phản ứng v i iodine uyê ệu, óa c ất: dung dịch vitamin C 0,1%, iodine 0,01N, NaOH 5% T ết bị, dụ cụ: ống nghiệm, pipiet, đũa thủy tinh Tế t ệm: lấy ống nghiệm, cho vào ống I: 2ml dung dịch vitamin C, ống II: 2ml nư c cất Sau thêm vào ống giọt dung dịch iodine 0,01N, lắc Quan sát, giải thích khác biệt ống b Phản ứng v i methylene blue uyê ệu óa c ất: dung dịch vitamin C 0,1%, dung dịch methylene blue 0,01%, NaOH 5% T ết bị, dụ cụ: ống nghiệm, pipiet, đũa thủy tinh Tế t ệm: Lấy ống nghiệm, cho vào ống I: 1ml dung dịch vitamin C, ống II: 1ml nư c cất Sau thêm vào ống – giọt methylene blue 2-3 giọt NaOH 5% Lắc quan sát màu hai ống Nếu khơng có thay đổi màu, đặt hai ống nghiệm vào nồi cách thủy 37 – 400C Quan sát màu dung dịch ống nghiệm sau vài phút, giải thích kết 30 h Phản ứng tạo thành thiocrom vitamin B1 (Thiamine) 2.1 Cơ sở lý thuyết Trong môi trường kiềm, dư i tác dụng ferixianua K3[Fe(N)6], thiamine bị oxi hóa thành thiocrom Hợp chất phát huỳnh quang có màu đặc trưng dư i ánh đèn tử ngoại Dư i ánh sáng tự nhiên, hợp chất có màu xanh đặc trưng Phản ứng xảy sau: 2.2 Tiến hành thí nghiệm uyê ệu, óa c ất - Dung dịch vitamin B1 1% - NaOH 10%, K3[Fe(N)6] 1% - Cồn izobutylic T ết bị, dụ cụ: ống nghiệm, pipiet, đũa thủy tinh Tế : Cho vào ống nghiệm khoảng ml dung dịch vitamin B1, thêm 10 giọt dung dịch NaOH 10% giọt, K3[Fe(N)6] 1%, để yên, hỗn hợp ống tạo thành hai l p ngăn cách Để ống nghiệm dư i ánh sáng mặt trời dư i ánh đèn tử ngoại Quan sát phân l p, màu đặc trưng l p chất lỏng, giải thích kết nhận Phản ứng vitaminB6 (pyridoxine) v i FeCl3 Dư i tác dụng FeCl3 pyridoxine tạo thành phức chất có màu đặc trưng uyê ệu óa c ất: dung dịch pyridoxine 1%, FeCl35% T ết bị, dụ cụ: ống nghiệm, pipiet, đũa thủy tinh Tế t ệm: cho vào ống nghiệm 1ml dung dịch pyridoxine 1%, thêm giọt FeCl3, lắc đều, quan sát xuất màu phức chất Giải thích Phản ứng vitamin A (Retinol) v i H2SO4 Khi tác dụng v i H2SO4 đặc, vitamin A bị nư c tạo thành sản phẩm có màu xanh tím khơng bền, sau chuyển thành sản phẩm có mầu nâu đỏ (mầu đặc trưng lipocrom) uyê ệu, óa c ất - Dầu cá 31 h - H2SO4 đặc - Clorofom benzen xăng T ết bị, dụ cụ: ống nghiệm, pipiet, đũa thủy tinh Tế t ệm Cho vào ống nghiệm khô giọt dầu cá, 2ml dung môi không phân cực benzene, clorofom, lắc tan, thêm vài giọt H2SO4 đặc, lắc, quan sát tượng giải thích II ĐỊNH LƯỢNG Xác định hàm lượng vitamin C theo phương pháp chuẩn độ iodine 1.1 Cơ sở lý thuyết Iodine oxy hóa vitamin C tạo thành acid dehydroascorbic theo phương trình   C6H8O6 + I + H2O > C6H6O6 + 3I + 2H+ Khi vitamin C bị oxy hóa hết, iodine triiođua diện dung dịch, phản ứng v i tinh bột tạo nên hỗn hợp màu xanh đen Màu xanh đen điểm dừng cho phản ứng chuẩn độ 1.2 Thực hành 1.2.1 uyê ệu, óa c ất Mẫu rau, - Dùng dao không rỉ cắt nhỏ 4g nguyên liệu cho vào cối sứ Cho thêm vào cối sứ 10ml HCl 2% Nghiền nhỏ chắt nư c chiết sang bình tam giác 50ml - Cho thêm vào 10ml HCl 2% vào cối sứ lại nghiền nhuyễn chắt dịch chiết sang bình tam giác Lập lại trình đến lần thứ tư - Dùng 10ml HCl 2% để rửa cối chày sứ - Chuyển toàn dịch chiết nư c rửa cối chày sứ sang bình định mức 100ml Cho nư c cất đến vạch định mức Mẫu viên thuốc vitamin C - Hòa tan viên thuốc 250mg nư c cất, định mức t i 250ml 1.2.2 T ết bị, dụ cụ - Cối chày sứ - Cân phân tích - Bình định mức 250ml, 500ml - Bình nón 250ml, bình nón 500ml - Pipet 1ml, 5ml, 10ml, 25ml 1.2.3 T ế t ệm - Lấy 20ml dịch chiết cho vào bình nón dung tích 250ml - Thêm vài giọt hồ tinh bột khoảng 1%, lắc nhẹ - Dùng Iodine chuẩn độ đến xuất màu xanh lam nhạt (màu tinh bột iodine) 1.2.4 T ết 32 h C%  Trong đó: VC * V * 0,000088 * 100 (%) Vl * m V: thể tích dung dịch Iodine chuẩn độ (ml) V1: thể tích mẫu đem chuẩn độ (ml) VC: thể tích mẫu ban đầu (ml) m: Khối lượng mẫu ban đầu (g) 0,000088: số g vitamin C phản ứng v i 1ml dung dịch I ôt 0,01N Xác định hàm lượng vitamin C theo phương pháp 2,6 diclorophenolindophenol (DCPIP) (theo TCVN 6427-2:1998) 2.1 Cơ sở lý thuyết Chiết ascorbic acid từ phần mẫu thử dung dịch acid oxalic dung dịch acid metaphotphoric/acid axetic băng Khử từ từ thuốc nhuộm mầu 2,6 diclorophenolindophenol ascorbic acid , chiết lượng thuốc nhuộm mầu dư xylen xác định lượng dư phương pháp đo phổ bư c sóng 500nm 2.2 Thực hành 2.2.1 uyê ệu, óa c ất a Chuẩn bị mẫu Bư c Lấy mẫu - Mẫu rắn (rau, tươi, ): dùng dao không rỉ, cắt khoảng 10g mẫu, xác đến 0,1mg - Đồ hộp: + Nếu sản phẩm dạng lỏng, mở phần nắp hộp chuyển tồn sản phẩm vào chai thủy tinh có nút nhám, lắc + Nếu sản phẩm có nư c riêng biệt: mở 1/3 nắp hộp, đổ nhẹ toàn phần nư c vào cốc thủy tinh Sau mở hết nắp hộp, cho phần vào máy xay nghiền nhỏ, chuyển tồn mẫu sang máy đồng hóa, đồng hóa -2 phút tốc độ trung bình Đổ phần nư c vào đồng hóa tiếp 30 giây Tiến hành lọc mẫu xác định v i dịch lọc + Sản phẩm dạng đơng đặc khó tách riêng nư c mứt: chuyển toàn mẫu vào máy đồng hóa - phút tốc độ trung bình - Viên vitamin C vitamin tổng hợp: hòa tan nư c cất định mức cho nồng độ vitamin C gi i hạn phương pháp Bư c Chiết mẫu Trộn mẫu chuẩn bị bư c v i dung dịch acid oxalic 2%, cho thể tích dịch chiết, tính mililit, gấp từ đến lần khối lượng mẫu thử tính gam Lọc dung dịch Nồng độ ascorbic acid dung dịch thử khoảng từ 0,05mg đến 0,5mg mililit dịch mẫu b Hóa chất 33 h - Dung dịch đệm, pH 4,0: Cho 300g natri axetat khan vào 700ml nư c 1000ml acid axetic băng - Thuốc nhuộm 2,6 diclorophenolindophenol - Dung dịch Ascorbic acid chuẩn 1g/l - Xylen (xylen có tác dụng gây mê nồng độ cao tất thao tác liên quan đến việc sử dụng xylen phải tiến hành tủ hút) Kiểm tra độ tinh khiết xylen sau: Cho ascorbic acid vào lượng nhỏ thuốc nhuộm dung dịch bị phai màu, lắc v i 10ml xylen Để 10 phút Nếu có vết màu l p xylen xylen phải chưng cất Xylen sử dụng việc xác định thu hồi cách lắc v i dung dịch natri hydroxit 20%( m/m) để trung hòa acid axetic, sau chưng cất lại 2.2.2 T ết bị, dụ cụ Sử dụng thiết bị dụng cụ thí nghiệm thơng thường, - Cân phân tích - Máy trộn - Microburet có dung tích 2ml, 5ml 10ml - Ống li tâm dung tích 25ml có nút thủy tinh - Máy li tâm - Máy đo phổ, thích hợp để đo bư c sóng 500nm 2.2.3 T ế t ệm Bư c Chuần hóa dung dịch thuốc nhuộm màu Pha loãng 5ml dung dịch ascorbic acid chuẩn v i 5ml dung dịch acid oxalic 2% chuẩn độ nhanh dung dịch thuốc nhuộm mầu có màu hồng bền giây Lặp lại trình thêm hai lần, ghi lại thể tích dung dịch thuốc nhuộm mầu sử dụng cho lần, xác đến 0,1ml Tiến hành đối v i mẫu trắng, thay 5ml dung dịch ascorbic acid chuẩn 5ml dung dịch acid oxalic 2% Bư c Xây dựng đường chuẩn (thể tương quan thể tích thuốc nhuộm giá trị OD đo được) Chuẩn bị ống ly tâm dung tích l n 25ml, có nắp đậy Ống ly tâm Acid oxalic 2% (ml) 5 5 Dung dịch đệm pH (ml) 4,8 4,6 4,4 4,2 Dung dịch thuốc nhuộm 2,6 0,2 0,4 0,6 0,8 DCIP (ml) Dung dịch xylem (ml) 10 10 10 10 10 Lắc mạnh đến 10 giây Ly tâm tách l p xylem 34 h Đo độ hấp phụ l p xylen bư c song 500nm: lấy cẩn thận l p xylen đổ đầy vào Cuvet đo phổ Thí nghiệm lặp lại lần, chênh lệch kết hai lần xác định, thực đồng thời liên tiếp nhanh người phân tích mẫu thử, khơng vượt 3% giá trị trung bình Bư c Xác định nồng độ vitamin C mẫu thí nghiệm Tiến hành tương tự bư c v i ống ly tâm Ống ly tâm Dung dịch mẫu thử (ml) Dung dịch đệm pH (ml) Dung dịch thuốc nhuộm 2,6 DCIP (ml) Dung dịch xylem (ml) 0 10 5 5 10 5 5 5 10 10 10 Lắc mạnh đến 10 giây Ly tâm tách l p xylem 5 10 2.2.3 Kết - Từ bư c chuẩn hóa dung dịch thuốc nhuộm màu, biểu thị nồng độ dung dịch thuốc nhuộm màu theo khối lượng, tính miligam ascorbic acid tương đương v i 1,0ml dung dịch - Xây dựng đồ thị chuẩn - Hàm lượng ascorbic acid , tính miligam 100g sản phẩm theo công thức: A (V0  V1 ) * m1 *100 m0 Trong đó: m0: khối lượng phần mẫu thử lấy để xác định, tính gam; m1: khối lượng ascorbic acid tương đương v i 1,0ml dung dịch thuốc thử, tính miligam; V0: thể tích dung dịch thuốc nhuộm cho vào, tính mililit; V1: thể tích thuốc nhuộm dư tương ứng v i độ hấp thụ đo trong, đọc từ đồ thị chuẩn, tính mililit A: hàm lượng vitamin C mẫu Những lưu ý trình tự thử - Nếu sản phẩm chứa sắc tố chiết xylen, hiệu chỉnh mẫu trắng hydroquynon sau: Sau đo độ hấp thụ l p xylen, thêm giọt dung dịch hydroquynon nửa bão hòa (được pha chế cách thêm hai lần thể tích axeton cần thiết để đạt dung dịch hydroquynon bão hòa), lắc trộn, để 30 giây đo lại độ hấp thụ lần Lấy độ hấp thụ ban đầu l p xylen trừ độ hấp thụ lần sau 35 h - Nếu sản phẩm bị nhiệt bảo quản lâu, hoặc, trường hợp, sản phẩm tự nhiên (ví dụ: nư c nho tím đen), xử lý formaldehyt để kiểm tra có mặt chất khử khơng liên quan đến ascorbic acid Để thực mục đích này, tiến hành mẫu đối chứng song song v i mẫu xác định, tiến hành đến thêm dung dịch thuốc nhuộm Trư c thêm thuốc nhuộm mầu, cho vào dung dịch thử 1ml nư c cho vào dung dịch kiểm tra 1ml dung dịch formadehyt 40% Để 10 phút tiến hành xác định Từ đồ thị chuẩn xác định thể tích dung dịch thuốc nhuộm bị màu chất gây nhiễu hiệu chỉnh kết cho phù hợp III BÁO CÁO Trình bày giải thích tượng thí nghiệm định tính Phân tích yếu tố dẫn đến sai số phương pháp định lượng mà nhóm thực Trình bày ngắn gọn bư c tiến hành thí nghiệm định lượng Trong bư c, yếu tố dẫn đến sai số cách khắc phục Tính kết bư c chuẩn hóa dung dịch thuốc nhuộm Xây dựng đường chuẩn, từ tính kết định lượng Nhận xét kết thu 36 h BÀI 6: ENZYME I ĐỊNH TÍNH Kiểm tra hoạt tính enzyme amylase 1.1 Cơ sở lý thuyết Amylase hệ enzyme xúc tác thủy phân liên kết glycozit phân tử tinh bột Amylase thủy phân tinh bột thành dextrin có độ dài khác nhau, maltose, glucose Các sản phẩm thủy phân khác khối lượng phân tử, khả phản ứng màu v i iodine, khả khử dung dịch Fehling 1.2 Tiến hành thí nghiệm 1.2.1 u ệu, óa c ất - Dung dịch tinh bột 1%, thuốc thử Lugol, thuốc thử Fehling - Enzyme amylase từ malt mua sẵn tự trích ly sau: Cân10g lúa nảy mầm vào cối v i 30ml nư c cất, nghiền nư c, để lắng Lấy 20ml dịch lọc thêm vào 80ml cồn tuyệt đối khuấy  để lắng, lọc bỏ phần dịch lọc  thêm 5ml cồn tuyệt đối, lắc để lắng lấy phần amylase protein kết tủa dư i đáy  thêm 5ml cồn tuyệt đối rửa rửa lại kết tủa 4-5 lần  thu lại phần kết tủa  thêm 20ml nư c cất hịa tan tồn kết tủa  lọc thu dung dịch amylase (và vài protein khác) để yên 15 phút 1.2.2 T ết bị – dụ cụ Cối chày sứ, ống nghiệm, pipet, ống hút nhỏ giọt 1.2.3 T ế t ệm Ống I: khoảng 2ml dung dịch enzyme + 2ml dung dịch tinh bột ống II: khoảng 2ml dung dịch nư c cất + 2ml dung dịch tinh bột Lắc hai ống  ủ 30 phút tủ ấm 37-400C Sau phút dùng ống nhỏ giọt lấy từ ống nghiệm 0,5ml vào ống nghệm khác, thêm khoảng 1-2 giọt thuốc thử Lugol Quan sát màu dãy thí nghiệm giải thích Ảnh hưởng nhiệt độ, pH t i hoạt tính amylase 2.1 Cơ sở lý thuyết Tốc độ phản ứng amylase phụ thuộc vào pH, nhiệt độ mức độ polime hóa chất Enzyme có chất protein, nhiệt độ cao thấp làm biến tính protein, phá vỡ liên kết phân tử enzyme, làm thay đổi cấu trúc không gian trung tâm hoạt động, làm ảnh hưởng t i hoạt tính enzyme pH làm thay đổi trạng thái ion hóa enzyme chất, pH cao thấp ảnh hưởng đến điện tích khả tích điện enzyme chất, làm giảm khả kết hợp enzyme chất, làm giảm hoặt hoạt tính enzyme 2.2 Thực hành 37 h uyê ệu, óa c ất: Dung dịch enzyme chuẩn bị trên, dung dịch tinh bột 1%, thuốc thử Lugol, HCl 0,05N; NaOH 0,05N Dụ cụ, t ết bị: - Máy đo pH cầm tay, nhiệt kế, - 10 ống nghiệm sạch, nồi-bếp điều chỉnh nhiệt; ống nhỏ giọt Tế t ệm a Ảnh hưởng nhiệt độ t i hoạt tính enzyme: Lấy ống nghiệm, cho vào ống 3ml dung dịch tinh bột 1% Đặt ống vào nồi cách thủy sôi, ống vào tủ ấm 370C, ống vào nư c đá Giữ 15 phút để dung dịch ống đạt nhiệt độ tương ứng Cho vào ống ml dung dịch enzyme nhiệt độ tương ứng tiếp tục ủ điều kiện nhiệt độ cũ Sau 5, 10 15 phút lấy ống 1ml dung dịch cho vào ống nghiệm khác (chú ý dùng pipet sạch) cho vào vài giọt thuốc thử Lugol quan sát So sánh giải thích b Ảnh hưởng pH t i hoạt tính enzyme Lấy ống nghiệm, cho vào ống 2ml dung dịch tinh bột 1%, 2ml enzyme  thêm HCl NaOH vào ống nghiệm, cho giải pH từ 2-10  thêm 2ml enzyme ống  ủ 15 phút nhiệt độ 37oC  kiểm tra hoạt tính enzyme v i cồn Iodine (tiến hành thí nghiệm trang 42) II ĐỊNH LƯỢNG Xác định hoạt độ amylase theo phương pháp Bernfeld cộng 1955 1.1 Cơ sở lý thuyết - Enzyme amylase xúc tác phản ứng thủy phân tinh bột thành maltose (đường khử) Tinh bột + H2O  maltose (đường khử) - Thuốc thử DNS có màu vàng tươi, dung dịch kiềm bị khử đường khử (maltose) tạo thành 3-amino 5-nitrosalixylat có màu cam hấp thụ ánh sáng cực đại bư c sóng 540 nm amylase - Một đơn vị hoạt độ enzyme (U/ml) lượng enzyme cần thiết xúc tác phản ứng giải phóng mg maltose từ tinh bột phút pH 6,9, nhiệt độ 37oC 1.2 Thực hành 38 h 1.2.1 ‐ uyê ệu, oá c ất Dung dịch đệm PBS 0.1 M pH 6,9 (53 mM Na2HPO4.7H2O, 47 mM NaH2PO4.H2O, pH 6,9): cân 14,306 g Na2HPO4.7H2O 6,435 g NaH2PO4.H2O hòa tan 800 ml nư c cất Điều chỉnh pH dung dịch đến 6,9 NaOH HCl, sau định mức đến 1L ‐ Dung dịch NaOH 2M: cân g NaOH hòa tan 100 ml nư c tinh khiết ‐ Dung dịch kali natri tactrat tetrahydrat 5,3 M: cân 1,496 g kali natri tactrat tetrahydrat (C4H4KNaO6 4H2O) hòa tan 100 ml dung dịch NaOH 2M Khuấy máy khuấy từ gia nhiệt cho tan Không để sôi ‐ Dung dịch 3,5-dinitrosalicylic acid 96 mM: cân 2,19 g DNS acid hòa tan 100 ml nư c tinh khiết Khuấy máy khuấy từ gia nhiệt tan Không để sôi ‐ Dung dịch thuốc thử màu: Lấy 12 ml nư c cất lần ủ ấm 50-70oC, bổ sung từ từ ml dung dịch kali natri tactrat tetrahydrat 5,3 M 20 ml dung dịch 3,5-dinitrosalicylic acid 96 mM để tổng thể tích 40 ml Bảo quản chai tối màu tránh ánh sáng vòng tối đa tháng ‐ Dung dịch maltose chuẩn 0,2% (w/v) nư c, định mức xác ‐ Dung dịch tinh bột 1%: hồ tan g tinh bột v i 50 ml đệm photphat bình định mức 100 ml, lắc Đun cách thu đến tan hồn tồn, khơng để sôi Làm nguội định mức đến 100 ml đệm phosphat ‐ Enzyme amylase từ malt mua sẵn trích ly từ malt, nấm mốc, chế phẩm vi sinh: + Amylase từ malt GRM638, Himedia (g): Cân g hoà tan vào đệm PBS pH 6,9 cho tổng thể tích 10 ml + Trích ly amylase từ malt: cân g malt nghiền nhỏ cho vào bình nón 100 ml, bổ sung 50 ml đệm PBS pH 6,9 Lắc ủ 30±2oC thời gian Lọc thu hồi dịch chiết enzyme sau định mức t i 100 ml Bảo quản -20oC 4oC ngày + Thu nhận enzyme amylase từ canh trường nuôi cấy nấm mốc: nuôi cấy chủng nấm mốc A niger môi trường Czapek-Dox có bổ sung chất tinh bột tan 1% thay cho glucose (hoặc sucrose) 200C Sau ngày nuôi cấy, thu dịch nuôi cấy đem ly tâm 12000 vòng 4oC 15 phút, thu dịch nổi, sau lọc qua giấy lọc Whatman số 1, thu dịch lọc Bảo quản dịch lọc chứa enzyme -20oC 4oC ngày + Tách chiết amylase từ chế phẩm enzyme: cân g chế phẩm, nghiền mịn đũa thu tinh, cho vào bình nón 100 ml, bổ sung 50 ml đệm PBS pH 6,9 Lắc ủ 30±2 oC thời gian Lọc giấy lọc Whatman số để thu hồi dịch chiết enzyme, định mức t i 100 ml Bảo quản dịch chiết chứa enzyme -20oC 4oC ngày 2.2.2 T ết bị, dụ cụ - Máy đo quang phổ UV-VIS 39 h - Cuvet thu tinh thạch anh cm - Ống falcon 15 ml có nắp - Pipet hút xác - Bếp đun cách thu 2.2.3 T ế a Xây dựng đường chuẩn maltose Chuẩn bị falcon 15 ml đánh số thứ tự từ 1-8 (ống ống đối chứng) Dùng pipet cho vào ống dung dịch theo thứ tự thể tích bảng dư i Ống nghiệm Dung dịch maltose chuẩn 0,2% (w/v) (ml) 0,05 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 2,0 Nư c tinh khiết (ml) 1,95 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 Thuốc thử màu (ml) 1 1 1 o Đậy nắp, đun sôi cách thu 100 C phút sau lấy để nguội nhiệt độ phòng Nư c tinh khiết (ml) 9 9 9 9 Lắc cách đảo ngược ống, đo A540nm Xác định ΔA540 ống chuẩn so v i ống đối chứng (ống số 1) Hóa chất - ΔA540 = A540(mỗi ống chuẩn) - A540(ống 1) Dựng đường chuẩn tương quan giá trị ΔA540 so v i hàm lượng maltose giải phóng (mg) b Xác định hoạt độ enzyme amylase mẫu thí nghiệm ‐ Chuẩn bị ống falcon 15 ml sạch, dùng pipet hút dung dịch vào ống thí nghiệm đối chứng dung dịch theo thứ tự thể tích bảng dư i Ống nghiệm TN1 TN2 TN3 Dung dịch tinh bột tan (1%) (ml) 1 o Lắc ủ nhiệt độ 37 C Dịch enzyme thô (đã làm ấm đến 37oC) (ml) 1 Dịch enzyme thô bất hoạt (ml) o Lắc đều, ủ 37 C xác phút Thuốc thử màu (ml) 1 o Đậy nắp đun cách thu 100 C phút Làm nguội nhiệt độ phịng, sau bổ sung Nư c tinh khiết (ml) 9 Lắc cách đảo ngược ống, đo A540nm 1.2.4 T ết - Xác định ΔA540 ống thí nghiệm so v i ống đối chứng (ĐC) ΔA540 = A540(mỗi ống thí nghiệm) - A540(ống đối chứng) - Dựa vào đường chuẩn xác định hàm lượng maltose (mg) giải phóng 40 h ĐC 1 Hoạt độ enzyme tính theo cơng thức - U/ml = lượng maltose giải phóng (mg)*df Trong đó: df độ pha lỗng dịch enzyme (lần) Xác định hoạt độ protease theo phương pháp Anson cải tiến 2.1 Cơ sở lý thuyết Enzyme protease xúc tác thủy phân chất casein, tạo thành sản phẩm amino acid vòng thơm, có tyrosine Bất hoạt enzyme kết tủa protein chưa bị thủy phân acid trichloaxetic (TCA) Định lượng sản phẩm tạo thành (tyrosine) phản ứng phản ứng màu v i thuốc thử Folin-Ciocalteu, từ xác định hoạt độ enzyme protease theo định ngh a: đơn vị hoạt độ enzyme (U) lượng enzyme xúc tác thủy phân casein tạo thành sản phẩm màu tương ứng v i µmole tyrosine giải phóng thời gian phút điều kiện thí nghiệm (nhiệt độ 37ºC, pH 7,5) protease  Amino acid Casein + H2O   2.2 Tiến hành 2.2.1 uyê ệu, óa c ất - Enzyme: enzyme protease thô thu nhận từ nấm mốc dịch dày lợn con, sử dụng enzyme thương mại Pha loãng mẫu enzyme tối thiểu lần - Dung dịch tyrosine chuẩn - Dung dịch Na2CO3 500 mM - Thuốc thử Folin-Ciocalteu 1N 2.2.2 T ết bị, dụ cụ - Máy đo quang phổ UV-VIS - Cuvet thu tinh thạch anh cm - Ống falcon 15 ml có nắp - Pipet hút xác - Bếp đun cách thu 2.2.3 Tế t ệm Bư c Dựng đường chuẩn tyrosine ‐ Từ dung dịch tyrosine chuẩn 1,1 mM xây dựng đường chuẩn v i dung dịch tyrosine có nồng độ từ 0,055 mM đến 0,55 mM Dung dịch tyrosine chuẩn 1,1 mM (ml) 0,05 Ống nghiệm 0,1 0,2 0,4 0,5 Nư c cất (ml) 1,95 1,9 Dung dịch 41 h 1,8 1,6 1,5 ĐC Dung dịch Na2CO3 500 mM (ml) 5 5 5 Thuốc thử Folin 1N (bổ sung sau cho Na2CO3) (ml) 1 1 1 ‐ Lắc ủ 37oC độ 30 phút, làm nguội nhiệt độ phòng ‐ Đo OD660nm ‐ Vẽ đồ thị biểu diễn biến thiên mật độ quang (∆OD660) theo hàm lượng tyrosine giải phóng (micromol) (∆OD660 = OD660 dd chuẩn – OD660 ĐC) Bư c Xác định hoạt độ enzyme mẫu thí nghiệm Lấy ống nghiệm cho chất vào ống theo thứ tự bảng sau: Thành phần Dung dịch casein 0,65% (ml) (đã làm ấm đến 37oC) Dịch enzyme thô (ml) TN1 TN2 TN3 ĐC 5 5 1 º Trộn ủ 37 C xác 10 phút Dung dịch TCA 110 mM (ml) 5 5 Dịch enzyme thô (ml) 0 Lọc giấy lọc Whatman số 1, thu dịch lọc Dịch lọc (ml) 2 2 Dung dịch Na2CO3 500 mM 5 5 Thuốc thử Folin-Ciocalteu 1N (bổ sung sau cho Na2CO3) 1 1 Lắc ủ 37oC 10 phút, đo OD660 nm - Xác định ΔOD ống thí nghiệm so v i ống đối chứng (ĐC) (∆OD = OD660 TBTN – OD660 ĐC) - Dựa vào đồ thị đường chuẩn suy hàm lượng tyrosine (µg) tương ứng 2.2.4 Kết X *11 Hoạt độ enzyme (U/ml) = 1*10 * Trong đó: X: số µg tyrosine giải phóng 11: tổng thể tích phản ứng (ml) 2: thể tích dịch sử dụng cho phản ứng màu (ml) 1: thể tích enzyme ban đầu (ml) 10: thời gian phản ứng (phút) 42 h III BÁO CÁO Nêu tượng thí nghiệm xác định hoạt tính enzyme Từ tượng kết luận enzyme amylase có thủy phân tinh bột Ngồi cách tiến hành thí nghiệm tài liệu này, em có đề xuất cách khác khơng? Nhiệt độ có ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme khơng? Từ kết thí nghiệm em kết luận? Trình bày ngắn gọn bư c tiến hành thí nghiệm định lượng Trong bư c, yếu tố dẫn đến sai số cách khắc phục Xây dựng đường chuẩn, từ tính kết định lượng Nhận xét kết thu 43 h TÀI LIỆU THAM KHẢO Hoàng Thị Huệ An Bài giảng Hóa phân tích Tài liệu lưu hành nội bộ, 2008 Phạm Thị Trân Châu, Trần Thị Áng Hóa sinh học Nhà xuất Giáo dục, 2006 Nguyễn Văn Mùi Hóa sinh học Nhà xuất Đại học Quốc gia Hà Nội, 2001 Lê Thanh Hải Thực hành Công nghệ protein enzyme Nhà xuất Đại học Kinh tế Cơng nghệ Thành phố Hồ Chí Minh, 2013 Nguyễn Hồi Hương Thực hành hóa sinh Trường Đại học Kỹ thuật Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh, 2009 Nguyễn Quang Vinh, Bùi Phương Thuận, Phan Tuấn Ngh a Thực hành Hóa sinh Nhà xuất Đại học Quốc gia Hà Nội, 2000 TCVN 3707-1990 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 3707:1990 thủy sản - Phương pháp xác định hàm lượng nitrogen amin ammoniac TCVN 4075-2009 Kẹo - xác định hàm lượng đường khử 10 TCVN 6121: 2010 Dầu mỡ động vật thực vật – Xác định trị số peroxide – phương pháp xác định điểm kết thúc chuẩn độ iốt (quan sát mắt thường) 11 TCVN 6122: 2015: Dầu mỡ động vật thực vật – xác định số iốt 12 TCVN 6126: 2015: Dầu mỡ động vật thực vật – xác định số xà phòng 13 TCVN 6127: 2010: Dầu mỡ động vật thực vật – xác định trị số acid độ acid 14 TCVN 6427-2:1998: Rau sản phẩm rau - xác định hàm lượng ascorbic acid - Phần 2: Phương pháp thông thường Anson, M.L., (1938) J Gen Physiol 22, 79-89 Folin, O., and Ciocalteu, V., (1929) J Biol Chem 73, 627 44 h