Thực hành phương pháp định lượng trong hóa sinh học

LÂY MẪU

Trên một diện tích cây trồng phải lấy nhiều mẫu ỏ nhiều điểm khác nhau, thường lấy từ 5-9 điểm rồi trộn đều lại và lấy ra một ỉượng cần thiết, các điểm này phân bố đểu trên toàn diện tích lấy mẫu (hình 2.2). Ví dụ toàn diện tích lấy mẫu có chỗ cao, chỗ trũng , cây trồng khác nhau, trong trường hỢp này phải phân nhỏ ra nhiều ô, mỗi ô lấy một mẫu đại diện đế về phân tích.

CHUẨN BỊ MẪU PHÂN TÍCH

Các mẫu lấy phân tích phải đưỢc trộn đểu, càng đều sô' lượng càng chính xác.

CỔ ĐỊNH MẨU

Đun một ít nước sôi, lúc đun đậy nắp, sau khi nưốc đã sôi, trải nguyên liệu thành lốp mỏng gói trong vải màn hoặc đặt trong chén sứ và đặt trên vỉ trong xoong, không để mẫu tiếp xúc vối nưốc, đậy nắp tiếp tục đun 15-20 phút hoặc lâu hdn tuỳ theo nguyên liệu. Còn các quả, quả mọng (cà chua) và các loại rau quả có chứa nhiều nưốc, đường, axit hữu cơ không thể dùng phương pháp này đưỢc vì có thể bị mất dịch, đường bị thuỷ phân cũng như làm biến đổi tỷ lệ giữa các dạng hiđratcacbon khi sấy tiếp tục.

ĐỊNH LUẬT LAMBERT-BEER

Vì có thê tính được nhò sự liên quan giữa dung dịch nghiên cứu (u) và dung dịch chuẩn (S):. là đã biết hoặc có thể đo đưỢc nên c„ có thê đưỢc tính từ phưđng trình trên. Khi tăng chiều dài 0) cũng như tăng nồng độ thì mật độ quang (OD) sẽ tăng tỷ lệ thuận vói chúng chứ không phải độ hấp thụ ánh sáng. Đo cường độ tạo thành bằng máv quang phố ở 500nm , dùng ông nghiệm sô" 1 làm đốì chứng, ống nghiệm này là ổng thuốc thử trắng và dùng để hiệu chỉnh màu của thuốc thử.

ĐỊNH LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ THEO PHƯƠNG PHÁP BERTRAND

Từ lượng KMnƠ4 tiêu tôn trong chuẩn độ, có thể tính lượng đồng (I) oxit và từ đó tính hàm lượng đườr^ trong dimg dịch bằng cách tra bảng tỷ lệ giữa lượng đồng và đường khử của Bertrand. Hoà tan kết tủa đồng (I) oxit vào bình Buchner bằng cách cho những lượng nhỏ (5ml) dung dịch sắt (III) sunfat trong môi trường H2SO4 và dùng đũa thuỷ tinh khuấy thật cẩn thận để Ịioà tan hoàn toàn kết tủa đồng oxit trên phễu.

ĐỊNH LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ THEO PHƯƠNG PHÁP VI LƯỢNG CỦA RODZEVICH

Muôi trên là một hợp chất không bền, vì thế các đưòng khử có nhóm anđehit hoặc xeton dễ dàng khử đổng (II) oxit tạo thành kết tủa đồng (I) oxit có màu đỏ, bản thân đường bị oxi hoá khi tác dụng vối dung dịch fehling. Phưđng pháp định lượng xenlulozd dựa vào túih chất của nó trong một hớp chất bển đối vối tác dụng của axit mạnh và kiềm mạnh, không bị phân huỷ dưối tác dụng của axit yếu, còn c-c chất khác thường đi kèm theo vói xenỉuỉozơ như hemiỉuloza, lignin.

Dụng cụ

Đồng thời cũng cần nhổ rằng phưđng pháp này không cho kết quả hoàn toàn chửih xác giá trị nitơ amin, vì nếu trong dimg dịch có prolin, nó sẽ liên kết không bền vối fomanđehit nên ỉàm giảm kết quả định lượng. Môi trưồng nưốc - etanol gây cản trỏ sự phân ly nhóm atnin, kết quả là nó trơ trong môi trường nước, axit amm trồ thành axit, nhóm cacboxyl của axit amữi có thể được chuẩn độ lại bằng kiềm.

Máy móc và dụng cụ

*Chú ý: Đinh ỉượng chính xác axit amin bằng phương pháp dùng ninhiđrin phụ thuộc vào sự loại bỏ chất chứa NH.ị và các hoá chất sử dụng cũng phải không có NH3. Ịon r trong môi trường axit khử ion đồng của phức chất liên kết với axit amin và bị oxi hoá thành Ỉ2- Từ kết quả của phUdng trình trên ta thấy ỉ ion iôt khử 1 ion đồng tạo nên sự liên kết của phức chất vối 2 gốc axit amỉn.

Nguyên liệu

Phương pháp ninliiArm rất nhạy và chính xác, nó đưỢc sử dụng nhiều để định lượng axit amin tách ra bằng phưđng pháp sắc ký giấy hoặc sắc ký cột. Để định lượng axit amin của dung dịch nghiên cứu cần cho thêm vào môi trường bazđ yếu dung dịch đồng photphat dư trong dung dịch đệm borat.

Tính k ết quả

Gần kết thúc chuẩn độ cho thêm 2-4 giọt tinh bột 1% và tiếp tục chuẩn độ đến khi xuất hiện màu xanh.

ĐỊNH LƯỢNG NITƠ BẢNG PHƯƠNG PHẢP KJELDAHL ỉ. Nguyên tắc

Cho vài giọt xúc tác axit percloric (hoặc HClOg hoặc H2O2 30%, chỉ cho ồ giai đoạn cuối dung dịch đã có màu vàng sẫm) hoặc hỗn hợp K2SO4 và CuSO^ vối tỉ lệ 3:1, cho một lần ngay từ đầu (lưỢng hỗn hợp chất xúc tác bằng lượng mẫu tươi dùng để vô Ctí hoá), tiếp tục đốt trên bếp khoảng 30 phút nữa. Phương pháp này không dừng được cho các dung dịch có nồng độ protein thấp (dưối 0,05 -. 0,lmg/ml) hoặc khi c6 mặt nhiều chất khác mà hấp thụ cùng một vùng cực tím (ví dụ, đệm, axit nucỉeic và một sô' chất béo), hoặc khi protein ỏ trong dịch huyền phù chứ không phải trong diuig dịch (ví dụ trong màng hoặc các phức hdp có khối lượng phân tử lốn).

PHƯƠNG PHÁP SCHIMIDT VÀ THANNHAUSER

Các hợp chất hoà tan chứa axit photphoric được tính theo các phân tứ nhỏ mà nó liên kết, ví dụ; nucleotit, este của hexoza và triozophotphat, axetyl photphat. Xác định các loại axit nucleic theo hàm lưỢng photpho ở phần IV và VI theo phưdng pháp xác định photpho của Horecker và cộng sự (1940) có sửa đổi từ phương pháp Fiski và Subbarow (1925).

PHƯƠNG PHÁP SCHNEIDER

Xác định ARN và ADN theo phương pháp Schneider thuận lợi hđn phưđng pháp Schmidt và Thannhauser đối vối nhiều mô động vật khác nhau (ruột, lá lách, tuyến ức, bạch cầu và hồng cầu lưổi). Ngược lại, trong trường hỢp phân tích mô não và thận ỉại nhận được kết quả kbác Iihau, vì có thể xác định cả lượng photphoproteũi cũng như những phức châ^t protem từ mosũi photphat.

PHƯƠNG PHÁP OGUR VÀ ROSEN 1. Nguyên tắc

Trong những trường hỢp như thế, để có kết quả chính xác hđn cần sử dụng cả hai phương pháp và xác định bổ simg sự hấp thụ tia tử ngoại. Phương pháp của Tsanev và Markov sử dụng HCIO4 để phân chia ARN và ADN bởi sự thủy phân bằng kiềm ỏ phần III.

ĐỊNH LƯỢNG HỢP gỊỈẤT PHOTPHO TRONG MÔ RUỘT THEO PHƯƠNG

- Dung dịch KOH IN. Dụng cụ và máy móc. c ác h thuỷ, tủ ấm, máy so màu, máy nghiền đồng thể. Thí nghiệm được tiến hành sau sd đồ sau:. Dịch li tâm Gipit). Loại lipit của mô ruột (A): lấy 300g mô ruột nghiền cẩn thận với hỗn hợp axeton - cloroform (5:1) trong máv nghiền đồng thể.

ĐỊNH LƯỢNG PHOTPHO THEO PHƯƠNG PHÁP HORECKER VÀ CÁC

Lấy 15ml dving dịch chứa photpho vô cơ (từ photphoprotem) cho vào ốhg li tám. Cho thêm từng giọt dimg dịch amoniac đậc vói sự có mặt của phenolphtaỉein để tnm g hoà dung dịch.

ĐỊNH LƯỢNG ARN BẰNG ORXINOL 1. Nguyên tắc

Diu% (dịch HCIO4 nổng làm cho axit nucleic (ARN và ADN) tich khỏi proteũi, các hỢp chất axit hoà tan được thuỷ phân và chuyển vào dung dịch. Độ hấp thụ được xác định là hiệu giá trị OD của các ống thí nghiệm có d\mg dịch chuẩn và ông thí nghiệm kiểm tra đo ồ bưốc sóng 600nm (hấp thụ cực đại đốỉ vối. hợp chất màu tạo thành).

OH axit L-ascorbic

• XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ CỦA CATALAZA
• XẤC ĐPÍH HOẠT ĐỘ CỦA GLUCOAMYLAZA
• XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ PROTEINAZA THEO PHƯƠNG PÌỊÁP ANSON CẢI TIẾN 1. Nguyên tắ c

Dung dịch chuẩn phenol chứa Img phenol trong Im l (dung dịch phenol. Dụng cụ và máy móc. Sau vài phút ủ nóng trong nồi ủ ỏ nhiệt độ 37“c qua 15 phút đôiỉ vối xác định photphataza kiềm, 60 phút đối với photphataza axit. Tiếp tục cho thêm l,8*nl dung dịch Folin - Ciocalteu pha loãng, lắc kỹ và li tâm. Lấy 4ml dịch li tâm để so màu. Ống kiểm tra được tiến hành bằng cách lấy 2ml đệm và 2ml cơ chất, cho thêm 0,2ml huyết thanh và lập tức cho thêm l,8ml dung dịch Folin - Ciocalteu. Lắc, li tâm và lấy 4ml dịch li tâm. Ị)ựng đựòxỊg.clỊuẩn: ỉỉụng dịqh chulỉn phenpl có uồng độ từ Q,Q02 - 0,lm g trong Iml, cho 2ml từng dung địch pha loãng (ống kiểm tra thay dung dịch chuẩn bằng 2ml nưổc). - Proteinaza trung tứih (pH đệm 7,2) tiên hành như trên. Vì vậy phải thêm nhanh HCl cho tới pH = 3 và khuấy liên tục. Chuyển dung dịch vào bình định mức lOOml và dẫn đến vạch bằng đệm Brìtton pH = 2,5. Dùng đệm Britton định mức đến lOOml đệm pH = 5,5. Nêu pH dung dịch thấp hơn 7,2 thì dùng vài giọt NaOH IN để điều chỉnh. Định mức đến lOOml bằng đệm Britton pH = 7,2. c) Điều kiên thuỷ phân.

Phương pháp sử dụng 2,6 - diclophenol - inodophenol - DPIP

Cho thêm 25ml axit meta- photphoric 2% (hoặc chì axetat 5%) để loại bỏ protein. Lắc đều, tiếp tục cho thêm HCl. Khi thí nghiệm vói các mẫu động vật thì dùng axit tricloaxeticíCCl^COOH). Dùng pipet lấy 5ml dịch chiết lọc cho vào bình nón 50ml, thêm 5ml dimg dịch amoni oxalat bão hoà, lOml nưổc cất và chuẩn độ bằng dung dịch DPIP cho đến khi xuất hiện màu hồng bền (không mất màu trong 10 phút).

Phương pháp sử dụng*iot

Theo lý thuyết lượng tử thì mức nảng lượng của một phân tử có thể tồn tại chỉ trong một sô' trạng thái xác định, cho nên, chỉ có ánh sáng vói những tần sô* tưởng ứng vối năng lượng cần thiết để nâng phân tử từ trạng thái cơ bản lên trạng thái kích thích bị hấp thụ. Nồng độ càng cao thì lượng ánh sáng phát xạ bị hấp thụ càng ỉổn, cho đến một điểm nhất định khi mà sự tảng tiến tổi bão hoà và cường độ huỳnh quang cũng sẽ bắt đầu giảm dần (vì lý do Ịiày mà đựòng chụẩn .nhự vậy thựdng đuợc 4ùng trong các thí nghiệm đo huỳnh quang).

Tinh k ết quả

Đặt bình vào nồi cách thuỷ sôi trong 45 phút, lắc đểu, để nguội và thêm chế phẩm photphataza của khuẩn ti Penicilliurn vào (cứ Ig mẫu cần 0,03g khuẩn ti khô) bằng cách: cân khuẩn ti, đem nghiền trong cổì vói 2 - 3ml natri axetat 30% rồi chuyển vào bình định mức, thêm natri axetat đến pH = 5. Đo cường độ huỳnh quang của mẫu thí nghiệm so vối dây dung dịch thiamin chuẩn trên máy quang phổ dưổi ánh sáng tử ngoại của đèn thạch anh, thuỷ ngân TIK-4, kính lọc màu đen (kích thưốc là 432nm, sự phát xạ là 545nm).

ĐỊNH LƯỢNG PHOTPHO

Lây 3ml dịch lọc (tương đương 0,5ml huyết thanh) cho vào bình cầu cỡ lOml hoặc cho vào ốhg nghiêm lOml có chia độ, cho 4 giọt p-nitrophenol và trung hoà bằng dung dịch amoniac đến khi có màu vàng. Lọc lấy nưâc, cho vào nước lọc 208ml cồn, sau vài giò sẽ xuất hiện kết tủa natri cobantmitric, lọc lấy kết tủa, rửa vài lần bằng cồn, sau đó rửa lần cuối bằng một lần ete và để khô trong không khí, cho vào lọ mầu nâu kín.