Luận Văn Nghiên Cứu Một Số Đặc Điểm Thực Vật Học Và Gen Phân Loại Cây Bách Bộ (Stemona Tuberosa Lour.) Tại Việt Nam.pdf

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO UBND TỈNH THANH HÓA

TRƯỜNG ĐẠI HỌC HỒNG ĐỨC

NGUYỄN VĂN TUẤN

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC VÀ

GEN PHÂN LOẠI CÂY BÁCH BỘ (STEMONA TUBEROSA

LOUR.) TẠI VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO UBND TỈNH THANH HÓA

TRƯỜNG ĐẠI HỌC HỒNG ĐỨC

NGUYỄN VĂN TUẤN

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC VÀ GEN PHÂN

LOẠI CÂY BÁCH BỘ (STEMONA TUBEROSA LOUR.)

TẠI VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Chuyên ngành: Thực vật học Mã số: 8.42.01.11

Người hướng dẫn khoa học: TS Lê Đình Chắc

THANH HÓA, 202

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:

Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả là đồng tác giả với các cộng sự khác

Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực, đặc biệt là

trình tự vùng gen Matk và gen Rbcl loài Bách bộ (Stemona tuberosa Lour.) tại

Việt Nam là những kết quả đầu tiên được công bố tại Việt Nam, một phần cũng đã được công bố trên các tạp chí Khoa học Tự nhiên và Công nghệ trường Đại học Hồng Đức, Thanh Hóa với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả

Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ các công trình nghiên cứu nào khác

Thanh Hóa, ngày 12 tháng 05 năm 2023

Tác giả

HV Nguyễn Văn Tuấn

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và chân thành tới TS Lê Đình Chắc - Trưởng Bộ môn Sinh học, người thầy đã tận tình dạy bảo, hướng dẫn tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất, giúp đỡ và chia sẻ những khó khăn với tôi trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy, Cô Bộ môn Sinh học, Ban chủ nhiệm Khoa KHTN Trường Đại học Hồng Đức Thanh Hóa Tôi xin cảm ơn sự giúp đỡ của Phòng Quản lý Sau đại học và Ban lãnh đạo Trường Đại học Hồng Đức, Thanh Hóa đã tạo điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập và làm nghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn sự quan tâm giúp đỡ quý báu của tất cả các anh, chị em và các bạn lớp K14 cao học Thực vật học

Cuối cùng, tôi muốn tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến tất cả người thân trong gia đình đã luôn sát cánh bên tôi, quan tâm, động viên và tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành luận văn này!

Thanh Hóa, ngày tháng năm 2023

HV Nguyễn Văn Tuấn

1.1 Đặc điểm hình thái và trình tự gen phân loại của cây Bách bộ 3

1.1.2 Trình tự một số gen phân loại cây Bách bộ 3

1.3 Một số bài thuốc có nguồn gốc từ Bách bộ 10

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, ĐỊA ĐIỂM, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

12

2.1.1 Đối tượng, địa điểm và vật liệu nghiên cứu 12

2.2.2 Phương pháp lập tiêu bản giải phẫu lá, thân, rễ 13

3.2 Đặc điểm giải phẫu cuống lá, thân, rễ cây Bách bộ 21

3 2.2 Đặc điểm giải phẫu của thân Bách bộ 22

3.3 Kết quả phân tích đoạn gen matK và rbcL của cây Bách bộ 25 3 3.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số từ lá Bách bộ 25

3.3.2 Kết quả phân lập và phân tích trình tự nucleotide của đoạn gen matK 25 3.3.3 Kết quả phân lập và phân tích trình tự nucleotide của đoạn gen rbcL 34 3.4 Kết quả hàm lượng một số hoạt chất trong hạt của hai mẫu Bách bộ thu được tại Thanh Hóa và Hòa Bình

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Trình tự các cặp mồi sử dụng để nhân bản 2 trình tự tương ứng 12

Bảng 3.2 Trình tự matK của mẫu Bách bộ thu tại Thanh Hóa 27

Bảng 3.3 Trình tự matK của mẫu Bách bộ thu tại Hòa Bình 27

Bảng 3.4 Kết quả so sánh trình tự matK thu được so với các trình tự matK

đã công bố trên gen banks

32

Bảng 3.5 Trình tự rbcL của mẫu Bách bộ thu tại Thanh Hóa 35

Bảng 3.6 Trình tự rbcL của mẫu Bách bộ thu tại Hòa Bình 35

Bảng 3.7 Kết quả so sánh trình tự rbcL thu được so với các trình tự rbcL

đã công bố trên gen banks

39

Bảng 3.8 Hàm lượng alkaloid toàn phần và tuberostemonine trong hạt của 2 mẫu Bách bộ thu được tại Thanh Hóa và Hòa Bìn

41

DANH MỤC HÌNH

Hình 3.1 Ảnh chụp cây Bách bộ tại Thanh Hóa và Hòa Bình 17

Hình 3.11 Kết quả PCR gen matK của hai mẫu Bách bộ với cặp mồi F/matK-R

matK-26

Hình 3.12 Kết quả so sánh trình tự matK thu được với các trình tự matK

đã công bố trên gen banks

Hình 3.15 Kết quả so sánh trình tự rbcL thu được với các trình tự rbcL đã

công bố trên gen banks

38

Hình 3.16 Kết quả xác định quan hệ di truyền của các trình tự rbcL thu được với các trình tự rbcL đã công bố trên gen banks

40

MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề

Bách bộ có tên khoa học là Stemona tuberosa Lour., thuộc họ Stemonaceae,

được biết đến như là một loại cây thuốc có giá trị đông y cao, trong y học cổ truyền, Bách bộ có tên trong nhiều bài thuốc dân gian có khả năng kháng khuẩn, diệt vi trùng, trị ho, trị giun kim, hen suyễn, trị lao phổi, trị vàng da, phù nề cơ

thể… [36] Trên thế giới, Stemona tuberosa Lour có phạm vi phân bố rộng, gần

như loài cây này có khắp châu lục trên thế giới, chủ yếu là ở Ấn Độ, Úc, Bangladesh, Campuchia, Lào, Malaysia, Myanmar, Philippines, Thailand và Việt Nam [2] Tại Việt Nam, Bách bộ có phạm vi phân bố rộng rãi, bao gồm vùng đồng bằng, ven biển, trung du, các tỉnh miền núi (độ cao dưới 1000m) Những tỉnh có nhiều Bách bộ là Cao Bằng, Lạng Sơn, Thái Nguyên, Tuyên Quang, Hòa Bình, Phú Thọ, Bắc Giang và Thanh Hóa [2], [32] Tại Thanh Hóa, theo truyền thống, Bách bộ được dùng chữa ho, trị giun và diệt sâu bọ, ngoài ra, Bách bộ cũng có khả năng kháng khuẩn, được sử dụng chữa bệnh lao phổi, giảm ho, sát trùng, dùng ngoài làm thuốc sát trùng ngoài da, chữa các bệnh về phụ khoa Theo thông tư số 40/2013/TT – BYT ngày 01/01/2014 của Bộ Y tế, Bách bộ là vị thuốc thiết yếu thuộc danh mục thuốc thiết yếu thuốc đông y và thuốc từ dược liệu lần thứ 6 Tuy nhiên, trong thực tế, việc nghiên cứu về đặc điểm thực vật học và gen phân loại cũng như vai trò dược liệu về loài cây này còn nhiều hạn chế Các nghiên cứu chủ yếu là hình thái và các bài thuốc theo đông y Do vậy, việc nghiên cứu đặc điểm thực vật học và gen phân loại loài cây này có vai trò quan trọng trong việc cung cấp cơ sở dữ liệu khoa học nhằm bảo tồn, phát triển và khai thác hợp lý nguồn dược liệu quý này

Xuất phát từ giá trị dược học nhiều mặt của cây Bách bộ, đồng thời với mục đích cung cấp tư liệu hóa loài cây dược liệu này, phục vụ khai thác và phát triển nguồn gen cây dược liệu quý thuộc danh lục cây thuốc quý ở Việt Nam và

Thanh Hóa, chúng tôi chọn “Nghiên cứu một số đặc điểm thực vật học và gen

phân loại cây Bách bộ (Stemona tuberosa Lour.) tại Việt Nam” làm đề tài

nghiên cứu

2 Mục tiêu nghiên cứu

Phân tích được đặc điểm hình thái, giải phẫu, alcaloide toàn phần,

tuberostemonine và xác định được quan hệ chủng loài của một số trình tự gen

phân loại phân lập được từ cây Bách bộ tại khu vực nghiên cứu, góp phần cung

cấp cơ sở khoa học cho việc bảo tồn và phát triển nguồn gen dược liệu này tại Việt Nam

3 Phạm vi nghiên cứu

Trong phạm vi nghiên cứu, đề tài tập trung phân tích đặc điểm hình thái,

giải phẫu và gen rbcL, matK cây Bách bộ ở hai địa phương là Thanh Hóa và Hòa

Bình Bước đầu tạo dữ liệu phân loại học phân tử dựa trên cơ sở phân tích đặc

điểm của đoạn gen rbcL và matK phân lập được phục vụ nhận diện cây Bách bộ

tại Việt Nam

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Kết quả phân tích các đặc điểm về hình thái, giải phẫu là dữ liệu được tư liệu khoa học cho cây Bách bộ tại Việt Nam Đặc biệt là đặc điểm về trình tự

nucleotide của đoạn gen rbcL và matK phân lập từ cây Bách bộ là những dữ liệu

khoa học quý giúp nhận diện cây Bách bộ bằng công nghệ gen Kết quả nghiên cứu vừa có ý nghĩa về khoa học và vừa có nhiều ứng dụng trong thực tiễn

Chương 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Đặc điểm hình thái và trình tự gen phân loại của cây Bách bộ 1.1.1 Đặc điểm hình thái

Cây Bách bộ có tên khoa học là Stemona tuberosa Lour Stemonaceae Thân thuộc dạng dây leo có kích thước nhỏ, nhẵn, quấn vào giá thể để leo, tuy nhiên khả năng leo không cao, mỗi đốt thân có thể dài trên 10cm Lá hình trái tim, mọc đối có khi thuôn dài, gân lá chạy dọc theo phiến lá và nổi rõ trên phiến lá, ngoài gân chính, trến phiến lá còn có 10 – 12 gân phụ chạy dọc từ cuống lá đến ngọn lá [33]

Hoa có dạng cụm, mọc ở kẽ lá, cuống hoa dài từ 2- 4cm, trong cụm hoa có 1-2 bông hoa to màu vàng hoặc màu đỏ Bao hoa có cấu tạo gồm 4 nhụy giống nhau, chỉ nhị ngắn Bầu hoa hình nón, quả nặng có 4 hạt, mua ra hoa thường là từ tháng 4 đến tháng 6 hàng năm [33]

Bách bộ có dạng rễ củ dài khoảng 6-12cm, đường kính của củ khoảng 1,5cm, đầu trên hơi phình to, đầu dưới thuôn nhỏ dần, bên ngoài có vết nhăn tạo thành rãnh dọc sâu, củ có màu vàng trắng hoặc xám vàng Củ có chất cứng giòn chắc, có vị ít ngọt, đắng nhiều, có mùi thơm ngát, vỏ ngoài rễ củ có màu đỏ hoặc nâu sẫm là tốt [33], [35]

0,5-1.1.2 Trình tự một số gen phân loại cây Bách bộ 1.1.2.1 DNA barcode

DNA barcode được biết đến như là một công cụ thữu ích trong việc nhận diện các mẫu sinh vật và phân loại học phân tử có độ tin cậy cao Hiện nay, việc sử dụng DNA barcode trong phân loại học phân tử đang được các nhà khoa học trong và ngoài nước quan tâm đặc biệt Việc làm này không chỉ giúp các nhà khoa học phân loại và sắp xếp một cách chính xác các loài sinh vật trong hệ thống phân loại sinh vật mà còn giúp nhận diện một cách chính xác các mẫu sinh vật không đầu đủ về hình thái, hoặc các mẫu sinh vật chưa phát triển hoàn thiện,… trong đó có thực vật Mặt khác, DNA barcode còn giúp các nhà dược

học nhận diện và phát hiện các loài giả danh, giúp các nhà khoa học hình sự phát hiện dấu tích của kẻ gian, các nhà phân loại học phát hiện được sự có mặt của một số loài mới mà trong thực tế chưa gặp, … Từ đó cho thấy, DNA barcode có vai trò vô cùng quan trọng trong thực tiễn, cùng với phân loại hình thái, DNA barcode là chỗ dựa tin cậy trong việc phân loại và sắp xếp sinh vật theo trật tự chính xác trong hệ thống phân loại học các loài sinh vật

Trên thế giới, năm 2003, Paul Hebert [19], là người đã đề xuất khái niễm “mã vạch DNA” (DNA barcode), khi ông sử dụng DNA Barcode trong việc nhận diện các mẫu sinh vật tại Đại học Guelph ở Ontario, Canada Từ đó DNA barcode được xem như là một cách để xác định loài

Về trúc trúc, mã vạch DNA là một trình tự nucleotide cụ thể của một chuỗi DNA ngắn nằm trong hệ genome của sinh vật, có cùng nguồn gốc tổ tiên (orthologous), trong đó có vùng ít bị thay đổi (rất ổn định - bảo thủ) và có vùng dễ thay đổi trong quá trình tiến hóa Do đó, căn cứ vào mức độ thay đổi trong trình tự DNA này để đánh giá sự sai khác di truyền trong quan hệ chủng loài của sinh vật Từ đó cho thấy, mã vạch DNA là một phương pháp định danh mới bằng việc sử dụng một đoạn DNA chuẩn ngắn nằm trong hệ genome của sinh vật để đánh giá sự phát sinh chủng loài và xác định quan hệ di truyền của sinh vật Theo thống kê tại trang web http://www.boldsystems.org/[31], đến nay đã có khoảng 11.769.884 mẫu có mã vạch DNA và khoảng 339.261 loài sinh vật đã có mã vạch, chủ yếu là động vật, tiếp theo là thực vật và sau đó là các loài nấm và các dạng sinh vật khác) Từ cơ sở dữ liệu trên cho thấy, việc xây dựng cơ sở dữ liệu cho mã vạch DNA trong sinh vật sẽ là một xu thế nghiên cứu trong thời gian tới trong hệ thống phân loại sinh vật (Valentini et al, 2009 [25])

Đến thời điểm hiện tại, các kết quả nghiên cứu đã cho thấy, có nhiều đoạn DNA đặc trưng được sử dụng làm DNA mã vạch Các đoạn DNA mã vạch có thể là những đoạn DNA nằm ở trong nhân (nuclear DNA - nDNA), như: 18S,

5,6S, 26S, 5S spacer và vùng ITS; có thể là những đoạn DNA nằm ở ty thể

(Mitochondrial DNA - mtDNA), như: Cytb và vùng kiểm soát (control region);

có thể là những đoạn DNA nằm trong lục lạp (Chloroplast DNA - cpDNA),

như: matK, rcbL, atpβ, ndnF, 16S (Kress et al, 2008 [24]; Aron et al, 2008 [5])

Các trình tự DNA barcode lạp thể thường có tính bảo thủ cao, căn cứ vào đặc điểm của trình tự DNA này, mà các nhà khoa học chia DNA barcode lục lạp thành 3 nhóm như sau: Nhóm I là các gen mã hóa những yếu tố thuộc hệ thống

quang hợp như phytosystem (psaA, psaB, psbA, psbB ), cytochrome b6f (petA, petB ), ATP synthase (atpA, atpB ), Rubisco (rbcL) và NAD(P)H dehydrogenease (ndhA, ndhB ) (Storchova et al, 2007 [22]) Nhóm II là các gen mã hóa cho các rRNA (rrn16, rrn5 ), trnA (trnH, trnK ), RNA polymerase (rpoA, rpoB ), các gen tiểu phần ribosome (rps2, rps3 ); và nhóm 3 gồm các khung đọc mở ORF gọi là ycfs (chưa rõ chức năng) và các gen mã hóa protein như MatK, cemA…

Mỗi đoạn mã vạch DNA có những đặc trưng riêng và có khả năng phân biệt sinh vật ở các mức độ khác nhau Ví dụ, các đoạn DNA như: 18S, 16S, 5,6S có khả năng phân biệt sinh vật ở mức họ và chi; các đoạn DNA, như:

26S, RbcL, ndnF, atpβ có khả năng phân biệt ở mức chi và loài; các đoạn DNA, như: ITS, matK, cytb, 5S spacer có khả năng phân biệt ở mức loài và dưới loài (subspecies, variety, strain) (Xiwen Li et al, 2014 [27] Chen et al, 2010 [11]) Vì

vậy, việc lựa chọn những đoạn DNA barcode đặc trưng để làm mã vạch phù hợp cho từng nhóm sinh vật, mức độ phân loại và việc phối hợp giữa các đoạn mã

vạch DNA là rất cần thiết và đem lại hiệu quả cao (Kress et al, 2008 [16]; CBOL Plant Working Group, 2009 [7]; Vijayan et al, 2010 [26]; Yao et al, 2010 [28])

Ví dụ, Đối với động vật, mã vạch được sử dụng rộng rãi nhất là locus

cytochrome C oxidase I (COI) của ty thể [13], tuy nhiên các marker ty thể khác,

chẳng hạn như Cytb, 12S hoặc 18S cũng được sử dụng nhằm tăng cao độ tin cậy và hạn chế các kết quả không mong đợi trong việc sử dụng các chỉ thị phân tử đối với việc xác định quan hệ chủng loài các loài Khác với động vật trên đối

tượng thực vật, các nhà khoa học đã khuyến cáo, việc sử dụng chuỗi trình

tự COI trong phân loại học là không thích hợp cho hầu hết các loài thực vật, bởi

mức độ tiến hóa của gen mã hóa cytochrome C oxidase 1 ở thực vật chậm hơn

động vật rất nhiều; do vậy, trình tự COI ở thực vật chưa đảm bảo các tiêu chí của mã vạch DNA (Fazekas et al., 2008 [12]; Chase et al., 2005 [10]; Kress et al., 2007 [15]) Ở thực vật, với đặc điểm là tốc độ tiến hóa của các gen trên ty

thể không nhanh như ở động vật, do vậy không đủ sai khác để phân biệt được các loài Vì vậy, trong nghiên cứu quan hệ phát sinh chủng loài sinh vật dựa trên trình tự DNA barcode, người ta thường sử dụng các đoạn DNA đặc trưng ở lục lạp và nhân sao cho phù hợp với đối tượng, mức độ phân loại để làm mã vạch

DNA (Kress et al., 2007 [15]) là vô cùng quan trọng Tùy vào mức độ, đối tượng

phân tích mà mỗi vùng gen sẽ được sử dụng làm mã vạch trong phân loại một cách hợp lý để tăng tính hiệu quả và độ tin cậy Điều này đã được minh chứng

bởi nghiên cứu của Holliingsworth et al., (2009) [8], đã chỉ ra sự kết hợp giữa gen matK và gen Rbci ở lục lạp để sử dụng như một mã vạch DNA có hiệu quả

cao nhất trong định danh phân tử cho nhiều loài thực vật

Về cơ bản, kỹ thuật này dựa vào việc sử dụng một trình tự DNA khoảng (400-800 bp) như là một tiêu chuẩn để nhận dạng và xác định quan hệ chủng loài của các loài sinh vật một cách nhanh chóng và chính xác Do đó, kỹ thuật DNA mã vạch không chỉ giúp các nhà phân loại học trong công tác phân loại và xác định loài, mà còn nâng cao năng lực kiểm soát, hiểu biết và tận dụng sự đa dạng sinh học Ngoài ra, kỹ thuật này có triển vọng nghiên cứu và ứng dụng trong khoa học cuộc sống, trong khoa học pháp y, y tế, nghiên cứu y dược, sản xuất và kiểm soát chất lượng thực phẩm…

1.1.2.2 Các tiêu chuẩn cơ bản của trình tự DNA barcode

Phương pháp phân loại hình thái, giải phẫu so sánh có lịch sử phát triển lâu đời và đã thành công trong việc xây dựng được một hệ thống phân loại sinh vật tương đối đầy đủ và toàn diện Tuy nhiên, phương pháp phân loại

này cũng gặp không ít những khó khăn khi cần xác định những mẫu vật đang trong giai đoạn phát triển chưa hoàn thiện, những mẫu có đặc điểm hình thái giống nhau (loài động hình) do cùng thích nghi với điều kiện môi trường, hoặc khó nhận biết do có nhiều điểm tương đồng ở bậc phân loại thấp như loài và dưới loài [14] Tuy nhiên, những khó khăn này lại trở nên đơn giản khi sử dụng DNA barcode trong việc xác định quan hệ chủng loại sinh vật, phương pháp này được gọi là phân loại học phân tử (Molecular taxonomy) đã cho những kết quả khá chính xác, giúp cho việc phát hiện loài mới, giải quyết các mối nghi ngờ về vị trí phân loại, đánh giá đầy đủ về tính đa dạng di truyền, chủng loại phát sinh và sự tiến hóa của nhiều loài động vật, thực vật và vi sinh vật

Đối với thực vật, hệ gen lục lạp mang nhiều đặc điểm thích hợp đối với

chỉ thị DNA và hệ gen nhân, vùng DNA nằm giữa các gen hay còn gọi ITS

(Internal Transcribed Spacer) thường được sử dụng làm DNA chỉ thị trong một số nghiên cứu [6], [21], [24] Trong những năm gần đây, nhiều vùng gen đã được

nghiên cứu và đề xuất là chỉ thị DNA cho thực vật như matK, Rpoc… [10], [16],

[19], [23] Theo Taberlet và cs (2007) [23], hệ thống mã vạch DNA lý tưởng phải đáp ứng các yêu cầu sau đây:

- Thứ nhất, đoạn DNA chỉ thị phải đủ độ biến thiên để phân biệt giữa các loài nhưng cũng phải không khác nhau quá mức giữa các cá thể trong cùng loài - Thứ hai, hệ thống định danh bằng DNA phải được chuẩn hóa, với cùng một vùng DNA có thể được sử dụng cho các nhóm phân loại khác nhau

- Thứ ba, đoạn DNA chỉ thị cần chứa đủ thông tin phát sinh loài để có thể dễ dàng định danh loài vào các nhóm phân loại (chi, họ,…)

- Thứ tư, có khả năng áp dụng với các mẫu vật thô, với vị trí cặp mồi nhân gen có độ bảo thủ cao, dễ dàng thực hiện phản ứng khuếch đại và đọc trình tự DNA

1.1.2.3 Đối với trình tự matK (Maturase K) và rbcL

(ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit)

Đối với trình tự DNA barcode matK

Ở thực vật, trong số các gen lục lạp, matK là một trong những gen tiến hoá

nhanh nhất, có kích thước khoảng 1550 bp và mã hóa cho enzyme maturase liên

quan đến quá trình loại bỏ các intron trong quá trình phiên mã RNA Do matK

tiến hoá nhanh và có mặt hầu hết trong giới thực vật, đồng thời đáp ứng đầy đủ các tiêu chuẩn của DNA barcode, nên đã được sử dụng như một chỉ thị trong nghiên cứu mối quan hệ giữa các loài và phát sinh loài ở thực vật Điều này được

chứng minh bởi CBOL đã tiến hành thử nghiệm matK trên gần 550 loài thực vật và thấy rằng 90% mẫu thực vật hạt kín, matK dễ dàng được khuếch đại bằng cách sử dụng một cặp mồi đơn; do đó, CBOL đã đề nghị sử dụng matK là một

trong những locus barcode chuẩn cho thực vật [26], [29]

Trong thực tế, MatK trình tự này đã thành công trong việc xác định các

loại thuốc thảo dược "Dahuang" có nguồn gốc từ Rheum palmatum L (Polygonaceae), R tanguticum (Maxim ex Regel) Maxim ex Balf, R officinale Baill., và loài gần gũi Rheum L với mức độ biến đổi nội bộ loài và giữa các loài khác nhau là cao Vì vậy, nó thường được sử dụng để xác định các nguyên liệu thảo dược ở những vị trí địa lý khác nhau [6], [18]

Đối với trình tự DNA barcode rbcL

Trong các gen lạp thể, rbcL là gen đầu tiên được đọc trình từ thực vật và

cũng là là trình tự gen đặc trưng mã hóa các tiểu đơn vị lớn của rubilose - 1,5 - bisphosphate cacboxylase/ oxygenase (RUBISCO) Đây cũng là trình tự về cơ

bản mang đủ các tiêu chuẩn của một DNA barcode, do đó rbcL đã được sử

dụng tương đối rộng rãi trong nghiên cứu phát sinh loài và phân loại thực vật

với hơn 10000 trình tự rbcL có sẵn trong GenBank Do trình tự rbcL dễ dàng

được khuếch đại bởi kỹ thuật PCR ở một số nhóm thực vật, cho nên, gần đây

CBOL đã công nhận rbcL là một trong những trình tự gen tiềm năng cao cho

các nghiên cứu về DNA barcode ở thực vật trong việc xác định quan hệ di

truyền và phát sinh chủng loài Tuy nhiên, do những hạn chế nhất định của rbcL

trong phân biệt loài, nên hầu hết các nhóm nghiên cứu đều cho rằng nên sử

dụng kết hợp rbcL với matK sẽ cho hiệu quả cao, bởi đây là hai locus barcode

chuẩn cho thực vật [26], [28], [30]

1.2 Thành phần hóa học của Bách bộ

Theo các nghiên cứu gần đâu của các nhà khoa học trong và ngoài nước đã khẳng định, trong rễ cây Bách bộ có chứa nhiều các hoạt chất có giá trị dược học cao; cụ thể:

Trong Radix Stemonae Japonicae có chứa các thành phần hóa học như Isostemonidine, Protostemonine, Paipunine, Stemonine, Stemonidine, Sinostemonine [33]

Trong Radix Stemonae Sessilifoliae có chứa các thành phần hóa học như: Protostemonine, Tubersostemonine, Stemonine, Isostemonidine, Hodorine, Sessilistemonine [33]

Trong Radix Stemonae Tuberosae có chứa các thành phần hóa học như: Isotubersostemonine, Stemine, Hypotubersostemonine, Stemonine, Tubersostemonine, Oxotubersostemonine [33]

Rễ Bách bộ chứa Tuberostemonin, Stnin, Oxotuberostemonin Ngoài ra trong cây bách bộ còn có chứa một số Alcaloid khác chưa rõ cấu trúc như: Isostemonin C22H33O4N, Stmonin C22H33O4N4N, Isotuberostemonin C22H33O4N, Setemonidin C19H31O5N, Hypotuberostemonin C19H21O3N, Paipunin C24H34O4N, Stemotuberin Ngoài ra còn có các hợp chất khác như: Glucid 2,3%, Protid 9,25%, Lipid 0,84% và một số Acid hữu cơ (Malic, Oxalic, Acid Citric, Succinic, Acetic, ) stemonin [35]

Từ những hợp chất trên, cho thấy, các thành phần hóa học trong rễ Bách bộ có tác dụng làm giảm tính kích thích của trung khu hô hấp, từ đó ức chế phản xạ ho, làm giảm cơn ho Bên cạnh đó còn có tính sát trùng, kháng khuẩn rất mạnh Do đó, Bách bộ được sử dụng trong điều trị bệnh ho (ho gà, lao phổi, nhiễm khuẩn đường hô hấp, …), chữa giun và diệt côn trùng… Ngoài ra, Bách bộ còn có một số các tác dụng khác như: giệt ký sinh trùng, điều trị các bệnh nhiễm khuẩn, viêm da, mề đay… [2], [3]

1.3 Một số bài thuốc có guồn gốc từ Bách bộ

 Điều trị ho lâu năm: Dùng 20 gram rễ Bách bộ rửa sạch với nước muối

có độ mặn vừa phải, sau đó thái nhỏ và cho vào cối giã nát, chắt lấy nước cốt Tiếp theo, cho nước cốt vào nồi sắc lại (ở lửa vừa phải) cho đến khi dẻo quánh Cách dùng: Mỗi lần uống 1 muỗng canh, uống 3 lần/ngày [35]

 Chữa ho dữ dội: Dùng rễ Bách bộ rửa sạch với nước muối có độ mặn

vừa phải, để ráo nước Cách chế biến: Rễ nhỏ để nguyên, rễ lớn bổ đôi., sau đó cho rễ vào một bình thủy tinh có nắp đậy kín, tiếp theo rót rượu trắng vào bình đến khi ngập rễ, ngâm trong 1 ngày Cách dùng: Mỗi ngày uống 1 chén chia đều thành 3 lần Ngoài ra, có thể dùng rễ Bách bộ và gừng tươi (cạo vỏ) với tỉ lệ 1:1, rửa sạch, cho vào cối giã nát, chắt lấy nước, sắc uống 2 chén/ngày cho đến khi bệnh tình thuyên giảm [35]

 Điều trị ho nhiều: Bài thuốc này sử dụng cả dây lẫn rễ cây Bách bộ

rửa sạch với nước muối có độ mặn vừa phải Sau đó, thái nhỏ và cho vào cối giã nát, chắt lấy nước cốt, tiếp theo, trộn nước cốt thu được với mật ong nguyên chất theo tỉ lệ 1:1, sau đó cho dược liệu vào nồi và nấu thành cao Cách dùng: Ngâm nước nuốt từ từ 3 lần/ngày, sử dụng trong 5 ngày sẽ khỏi [35]

 Chữa ho hàn cho trẻ nhỏ: Dùng rễ Bách bộ rửa sạch với nước muối

có độ mặn vừa phải, để ráo, sau đó cho vào chảo và thực hiện sao vàng ở lửa nhỏ Tiếp theo, lấy 30 gram ma hoàng khử mắt, rửa sạch, phơi khô; sau đó tán bột cả hai dược liệu Tiếp theo, sử dụng hạnh nhân bỏ vỏ, bỏ đầu nhọn, cho vào chảo và thực hiện sao vàng ở lửa nhỏ, sau đó cho hạnh nhân vào nước sôi già,

vớt ra, để ráo và tán thành bột Sau đó, trộn đều tất cả bột nguyên liệu, cho thêm mật ong nguyên chất (với tỉ lệ vừa phải) vào cùng và nặn thành viên nhỏ Uống 23 viên/ngày với nước ấm [35]

 Điều trị vàng da, phù toàn thân: Dùng rễ dBách bộ tươi nguyên (mới

đào) rửa sạch với nước muối có độ mặn vừa phải Thái nhỏ và cho vào cối giã nát, chắt lấy nước cốt Cách sử dụng: đắp dược liệu lên rốn, sau đó dùng nửa tô xôi giã mềm dẻo đắp chồng lên dược liệu Dùng gạc hoặc khăn bông sạch băng lại trong 12 ngày hoặc đến khi nhận thấy trong ruột có mùi hôi rượu thì tiểu được và hết phù [35]

 Trị giun kim: Dùng rễ Bách bộ tươi rửa sạch với nước muối có độ mặn

vừa phải, để ráo Sau đó, cho vào nồi cùng với một ít nước, sắc kẹo và thụt vào hậu môn ngày 1 lần, trong 1 tuần [34], [35]

 Trị giun đũa: Dùng 12 gram rễ Bách bộ tươi rửa sạch với nước muối

có độ mặn vừa phải, để ráo Sau đó, cho vào nồi cùng với 500ml nước Sắc và uống vào mỗi buổi sáng lúc đói Sử dụng liên tục trong 5 ngày [34], [35]

 Chữa lao phổi có hang: Dùng 20 gram rễ Bách bộ, 10 gram đơn bì, 10

gram đào nhân và 10 gram hoàng cầm, rửa sạch với nước muối có độ mặn vừa phải Cho tất cả dược liệu trên vào nồi sắc cùng với 400ml nước cho đến khi lượng nước trong nồi đặc lại còn khoảng 60ml Uống mỗi ngày 1 thang Sử dụng liên tục từ 2 – 3 tháng [34], [35]

 Chữa lao phổi: Dùng 12 gram rễ Bách bộ rửa sạch với nước muối có

độ mặn vừa phải Sau đó, sắc và uống cùng với 12 gram bột Bạch cập [34], [35]

 Chữa ho gà: Dùng 1015 gram rễ Bách bộ rửa sạch với nước muối có

độ mặn vừa phải Sau đó, sắc và uống, hoặc dùng 1220 gram dược liệu sắc và uống với đường cát [34], [35]

 Trị mề đay: Dùng 29 gram bách bộ, 8 gram hùng hoàng và 8 gram

bằng sa, rửa sạch với nước muối Sau đó, sắc và rửa vùng da bệnh [34], [35]

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, ĐỊA ĐIỂM, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Vật liệu, hóa chất và thiết bị

2.1.1 Đối tượng, địa điểm và vật liệu nghiên cứu * Đối tượng, địa điểm, thời gian thu mẫu

Mẫu cây Bách bộ tự nhiên tại Thanh Hóa và Hòa Bình Thời gian nghiên cứu từ tháng 10/2022 – 03/2023

Hóa chất phục vụ cho tách chiết DNA tổng số, phân lập, tách dòng, xác định trình tự gen và phân tích thành phần hóa học cây Bách bộ

Thiết bị: Máy PCR System 9700 (Appied Biosystem, Mỹ), máy điện di Powerpac300 (Bio-Rad, Mỹ), máy soi DNA (Mini-transllumminatior, Bio-Rad, Mỹ), máy Voltex (Mimishaker, IKA, Đức), máy ly tâm, máy xác định hàm lượng nucleic acid NanoDrop, thiết bị giải trình tự DNA và các thiết bị hiện đại khác

Các cặp mồi đặc hiệu được sử dụng để nhân bản 2 trình tự gen nói trên được trình bày tại bảng 2.1

Bảng 2.1 Trình tự các cặp mồi sử dụng để nhân bản 2 trình tự tương ứng

al 2002 [9]

al 2002 [9]

* Nội dung nghiên cứu

i) Phân tích đặc điểm hình thái các mẫu cây Bách bộ thu được tại khu vực nghiên cứu

ii) Nghiên cứu cấu tạo giải phẫu của cuống lá, thân và rễ cây Bách bộ ở khu vực nghiên cứu

iii) Phân tích được trình tự gen rbcL, Matk, thành phần alcaloide toàn phần

và tuberostemonine phân lập được từ loài Stemona tuberosa Lour trong chi

2.2.2 Phương pháp lập tiêu bản giải phẫu lá, thân, rễ

Cây Bách bộ về được bảo quản tươi nguyên, rửa sạch, sau đó dùng dao cắt ngang lá, thân, rễ; lát cắt phải thật mỏng và vuông góc, sau đó tiến hành theo các bước sau:

- Làm sạch mẫu và nhuộm kép: Gồm các thao tác sau

+ Ngâm các lát cắt từ rễ, thân, lá trong nước Javen từ 15-20 phút + Rửa mẫu bằng nước cất

+ Rửa lại bằng Axit axetic (để tẩy sạch hypoclorat có trong javen còn lại trong khoang tế bào)

+ Rửa lại bằng nước cất

+ Nhuộm camin 5% (ngâm trong khoảng 30-40 phút) + Rửa lại bằng nước cất

+ Nhuộm xanh metylen 1/10.000 trong thời gian 30-40 giây + Rửa bằng nước cất

- Lên kính bằng glyxerin, sau đó quan sát trực tiếp, chụp ảnh và phân tích giải phẫu thu được

2.2.3 Phương pháp tách DNA

DNA tổng số được tách chiết từ lá của các mẫu Bách bộ thực hiện theo phương pháp CTAB Chúng tôi tiến hành tách chiết DNA tổng số theo các bước như sau:

Bước 1 Lấy 200mg lá non nghiền trong nitơ lỏng (- 1960C) thành bột mịn Bổ sung vào mẫu 6ml đệm rửa có thành phần (Tris - HCl 100mM, pH = 8,0; EDTA 5mM, pH = 8,0; NaH2PO4 0,4%; sorbitol 350mM; nước) Chia ra Ống eppendorf 1,5ml Li tâm trong 15 phút, với tốc độ 12000 vòng/phút ở 4°C, bỏ dịch, thu cặn ( Bước này lặp lại 2 lần)

Bước 2 Thêm vào mỗi ống 500 pl đệm chiết ( bao gồm các thành phần: Tris - HCl 100mM, pH = 8,0; EDTA 20mM, pH = 8,0; CTAB 4%; NaCl 1,4M; nước), mix nhẹ, ủ ở nhiệt độ 65°C trong vòng 30 phút (15 phút đảo nhẹ ống 1 lần) Sau khi ủ xong, lấy ra để ở nhiệt độ phòng 5 phút

Bước 3 Li tâm trong 15 phút, với tốc độ 12000 vòng/phút ở 4°C Thu dịch pha trên chuyển sang ống eppendorf 1,5 ml mới

Bước 4 Bổ sung thêm 500pl C : I (24 cloroform: 1 isoamyl) để loại protein và tạp chất, đảo đều ống trong 15 phút Li tâm trong 15 phút, với tốc độ 12000 vòng/phút ở 4°C Hút cẩn thận 500pl dịch trong ở pha trên sang ống eppendorf 1,5pl mới (bỏ tủa) Bước này lặp lại 2 lần

Bước 5 Thêm 500 pl isopropanol, mix nhẹ, tủa DNA ở -20°C để qua đêm Sau đó li tâm trong 15 phút, với tốc độ 12000 vòng/phút ở 4°C, loại dịch thu tủa

Bước 6 Bổ sung 500 pl cồn 70 độ Li tâm 10 phút, 12000 vòng/phút ở 4°C, loại bỏ dịch thu tủa (lặp lại 2-3 lần) Làm khô ở nhiệt độ phòng rồi hòa tan DNA trong 50pl nước cất 2 lần đã khử trùng Bảo quản ở tủ -20oC đến khi sử dụng

2.2.4 Phương pháp nghiên cứu sinh học phân tử

Theo phương pháp của Peter và cs (2011) [32] và bảng các cặp mồi DNA Barcoding

Trong đó, đoạn gen matK, rbcL được khuếch đại bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu matK_390f/matK_1326r và rbcL f/ rbcL l với kích thước

dự kiến là khoảng 900 và 600 nucleotide

Với chu trình nhiệt và thời gian phản ứng của PCR bao gồm: Biến tính khởi động ở 94ºC trong 4 phút; lặp lại 25 chu kì (Sambrook et al, 1989 [20]) (biến tính ở 94ºC trong 30 giây, gắn mồi ở 55ºC trong 40 giây, tổng hợp và kéo dài ở 72ºC trong 40 giây); ổn định mẫu và kết thúc phản ứng ở 72ºC trong 10 phút và bảo quản mẫu ở 4ºC

Phản ứng PCR được tiến hành với thành phần phản ứng được trình bày ở bảng 2.2

Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR nhân gen

(l)

1 PCR Masster Mix

2.2.5 Phương pháp chạy điện di kiểm tra sản phẩm PCR

Sau khi chạy điện di, lấy riêng phần gel agarose cho vào hộp chứa dung dịch Ethidium bromide Nhuộm trong 10 phút, sau đó lấy bản gel ra, ngâm trong nước 2 - 3 phút Đem vào máy quan sát dưới đèn tử ngoại (UV) và chụp ảnh

2.2.6 Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR

Sau khi nhân được gen matK; rbcL bước tiếp theo cần thu nhận gen ở

dạng tinh sạch và không lẫn gel agarose Quá trình tinh sạch được thực hiện theo Kit GenJET PCR Purification của hãng Thermo Scientific

2.2.7 Phương pháp xác định trình tự nucleotide của đoạn gen matK, rbcL

Trình tự nucleotide của các đoạn gen được xác định tại bằng máy giải trình tự ABI PRISM® 3100 Avant Genetic Analyzer, sử dụng bộ Kit BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing với cặp mồi đặc hiệu Trình tự gen đó được phân tích, so sánh và lập cây phát sinh chủng loại bằng các chương trình Bioedit, BLAST, DNAstar

2.2.8 Phương pháp định lượng alkalod toàn phần trong dược liệu Bách bộ

Định lượng alkalod toàn phần trong dược liệu bách bộ theo Dược điển Việt Nam V, Hàm lượng alcaloid (X%) toàn phần theo công thức [1]

𝑋 (%) = (10 − n)x 3,75𝑎

n: dung dịch natri hydroxyd 0,1 N (CĐ) đã dùng tính bằng ml

a: Khối lượng bột dược liệu đem định lượng đã trừ độ ẩm, tính bằng gam

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Đặc điểm hình thái cây Bách bộ

Sau khi thu được mẫu Bách bộ tại Thanh Hóa và Hòa Bình, chúng tôi tiến hành phân tích đặc điểm hình thái hai mẫu này tại phòng thí nghiệm Thực vật học, Bộ môn Sinh học, Khoa Khoa học Tự nhiên, Đại học Hồng Đức Thanh Hóa

A B

Hình 3.1 Ảnh chụp cây Bách bộ tại Thanh Hóa và Hòa Bình

Kết quả trên hình 3.1 cho thấy, Bách bộ có dạng dây leo bằng thân quấn, thường thân cây dài từ 4 - 7 m, trong một số điều kiện, thân cây có thể dài hơn Thân dạng khí sinh, hình trụ, trên lát cắt ngang của thân có hình tròn không đều, thân phân biệt rõ mấu và gióng, các gióng của thân nhẵn, loe rộng ở hai đầu của mấu, màu lục nhạt Thiết diện mặt cắt của thân Bách bộ thu tại Thanh Hóa có đường kính trung bình 0,36cm, trong khi đó, chỉ số này của thân cây Bách bộ thu tại Hòa Bình là 0,42cm Lá có màu xanh nhạt (hình 3.2), màu sắc mặt trên và dưới gần giống nhau, mép phiến lá trơn; phiến lá hình thuân dài, không có

lông, sáp; chiều rộng của phiến lá Bách bộ ở Thanh Hóa trung bình là 8,5cm, số liệu này của phiến lá Bách bộ thu tại Hòa Bình là 8,4cm Chiều dài của phiến lá Bách bộ thu tại Thanh Hóa trung bình là 14,7cm, chỉ số này của là Bách bộ thu tại Hòa Bình là 17,8cm Cuống lá Bách bộ thu tại Thanh Hóa trung bình là 6,0cm, chỉ số này ở lá cây Bách bộ thu tại Hòa Bình là 5,6cm Cả hai mẫu Bách bộ thu được, lá đều mọc đối hoặc so le, các gân lá nổi rõ ở mặt dưới của lá, gân lá có hình cung xuất phát từ cuống lá kéo dài đến hết phiến lá (hình 3.2) Từ các kết quả trên, cho thấy, về hình thái, kích thước lá Bách bộ thu tại Thanh Hóa và Hòa Bình không có sự khác nhau nhiều, chỉ số sai khác lớn nhất là chiều dài phiến lá (lệch 3,1cm) Tuy nhiên, trong thực tế, nếu cây Bách bộ sống trong môi trường đầy đủ về điều kiện thổ nhưỡng và có sự chăm sóc tốt, lá có thể có kích thước lớn, phiến lá hình bản

Mặt trên lá

Mặt dưới lá

BB8

Hình 3.2 Ảnh chụp lá Bách bộ

BB8: Mẫu lá Bách bộ Hòa Bình; BB15: Mẫu lá Bách bộ Thanh Hóa Bách bộ có bộ rễ chùm và tạo thành củ, mỗi chùm thường có nhiều củ, số lượng không ổn định; củ có hình thuôn, thu nhỏ hai đầu, màu trắng ngà, dài 15 - 30 cm, khi củ già có thể có màu nâu

Cụm hoa (hình 3.3) mang 1-2 hoa, mọc ở kẽ lá, màu vàng lục; lá bắc hẹp; bao hoa gồm 4 mảnh giống nhau, hẹp ngang, dài khoảng 4 cm, mặt trong màu đỏ tía, có mùi hôi khó chịu; nhị 4 bằng nhau, chỉ nhị ngắn, đính ở gốc; bầu hình tháp Quả nang (hình 3.4), hình trứng, quả non có màu xanh khi già quả chuyển màu vàng từ cuống dần xuống đỉnh quả, mỗi quả chứa từ 12-28 hạt Khi quả chín vỏ quả tự tách ra hai bên mép để hạt thoát ra ngoài Về kích thước, quả có chiều dài quả từ 5,2 – 8,5 cm; chiều rộng quả từ 2,6 – 3,7 cm

Hạt Bách bộ (hình 3.5) khi hạt chín, có màu nâu đen, có các rãnh nhăn chạy dọc theo hạt, hạt có chiều từ 1,7 – 2,05 mm hạt, đường kính hạt từ 0,4 – 0,5 mm; khối lượng 1000 hạt của các mẫu giống dao động từ 75 – 96 g

Hình 3.5 Ảnh chụp hạt Bách bộ

BB8: Hạt Bách bộ Hòa Bình; BB15: Hạt Bách bộ Thanh Hóa

Từ các kết quả phân tích hình thái của Bách bộ như trên, cho thấy, hai mẫu Bách bộ được thu từ Hòa Bình và Thanh Hóa không có sự khác nhau nhiều, điều này có thể khẳng định, hai mẫu này có quan hệ cùng loài Tuy nhiên để khẳng định đặc điểm về giải phẫu của hai mẫu này, chúng tôi tiếp tục thực hiện lập tiêu bản giải phẫu cuống lá, thân, rễ và tiến hành so sánh hai mẫu Bách bộ này

3.2 Đặc điểm giải phẫu cuống lá, thân, rễ cây Bách bộ 3.2.1 Đặc điểm giải phẫu cuống lá

Để thực hiện nghiên cứu giải phẫu của cuống lá, chúng tôi tiến hành cắt ngang cuống lá của cây Bách bộ Kết quả phân tích giải phẫu của cuống

lá của cây Bách bộ được trình bày ở hình 3.5

BB 15 BB 8 Hình 3.6 Ảnh chụp giải phẫu cuống lá Bách bộ

BB8: Bách bộ Hòa Bình; BB15: Bách bộ Thanh Hóa