Đặc điểm thực vật học và trình tự gen phân loại của cây Bách bộ (Stemona Tuberosa Lour.) tại Việt Nam

Đặc điểm hình thái

Lá hình trái tim, mọc đối cú khi thuụn dài, gõn lỏ chạy dọc theo phiến lỏ và nổi rừ trờn phiến lá, ngoài gân chính, trến phiến lá còn có 10 – 12 gân phụ chạy dọc từ cuống lá đến ngọn lá [33]. Bách bộ có dạng rễ củ dài khoảng 6-12cm, đường kính của củ khoảng 0,5- 1,5cm, đầu trên hơi phình to, đầu dưới thuôn nhỏ dần, bên ngoài có vết nhăn tạo thành rãnh dọc sâu, củ có màu vàng trắng hoặc xám vàng.

Trình tự một số gen phân loại cây Bách bộ

Các trình tự DNA barcode lạp thể thường có tính bảo thủ cao, căn cứ vào đặc điểm của trình tự DNA này, mà các nhà khoa học chia DNA barcode lục lạp thành 3 nhóm như sau: Nhóm I là các gen mã hóa những yếu tố thuộc hệ thống quang hợp như phytosystem (psaA, psaB, psbA, psbB..), cytochrome b6f (petA, petB..), ATP synthase (atpA, atpB..), Rubisco (rbcL) và NAD(P)H dehydrogenease (ndhA, ndhB..) (Storchova et al, 2007 [22]). Tuy nhiên, những khó khăn này lại trở nên đơn giản khi sử dụng DNA barcode trong việc xác định quan hệ chủng loại sinh vật, phương pháp này được gọi là phân loại học phân tử (Molecular taxonomy) đã cho những kết quả khá chính xác, giúp cho việc phát hiện loài mới, giải quyết các mối nghi ngờ về vị trí phân loại, đánh giá đầy đủ về tính đa dạng di truyền, chủng loại phát sinh và sự tiến hóa của nhiều loài động vật, thực vật và vi sinh vật.

Thành phần hóa học của Bách bộ

CBOL đã công nhận rbcL là một trong những trình tự gen tiềm năng cao cho các nghiên cứu về DNA barcode ở thực vật trong việc xác định quan hệ di truyền và phát sinh chủng loài. Tuy nhiên, do những hạn chế nhất định của rbcL trong phân biệt loài, nên hầu hết các nhóm nghiên cứu đều cho rằng nên sử dụng kết hợp rbcL với matK sẽ cho hiệu quả cao, bởi đây là hai locus barcode chuẩn cho thực vật [26], [28], [30].

Một số bài thuốc có guồn gốc từ Bách bộ

Từ những hợp chất trên, cho thấy, các thành phần hóa học trong rễ Bách bộ có tác dụng làm giảm tính kích thích của trung khu hô hấp, từ đó ức chế phản xạ ho, làm giảm cơn ho. Sau đó, trộn đều tất cả bột nguyên liệu, cho thêm mật ong nguyên chất (với tỉ lệ vừa phải) vào cùng và nặn thành viên nhỏ.  Điều trị vàng da, phù toàn thân: Dùng rễ dBách bộ tươi nguyên (mới đào) rửa sạch với nước muối có độ mặn vừa phải.

Cách sử dụng: đắp dược liệu lên rốn, sau đó dùng nửa tô xôi giã mềm dẻo đắp chồng lên dược liệu. Dùng gạc hoặc khăn bông sạch băng lại trong 12 ngày hoặc đến khi nhận thấy trong ruột có mùi hôi rượu thì tiểu được và hết phù [35].  Trị giun kim: Dùng rễ Bách bộ tươi rửa sạch với nước muối có độ mặn vừa phải, để ráo.

 Trị giun đũa: Dùng 12 gram rễ Bách bộ tươi rửa sạch với nước muối có độ mặn vừa phải, để ráo. Cho tất cả dược liệu trên vào nồi sắc cùng với 400ml nước cho đến khi lượng nước trong nồi đặc lại còn khoảng 60ml.

Vật liệu, hóa chất và thiết bị

Phương pháp xác định trình tự nucleotide của đoạn gen matK, rbcL Trình tự nucleotide của các đoạn gen được xác định tại bằng máy giải trình tự ABI PRISM® 3100 Avant Genetic Analyzer, sử dụng bộ Kit BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing với cặp mồi đặc hiệu. Sau khi thu được mẫu Bách bộ tại Thanh Hóa và Hòa Bình, chúng tôi tiến hành phân tích đặc điểm hình thái hai mẫu này tại phòng thí nghiệm Thực vật học, Bộ môn Sinh học, Khoa Khoa học Tự nhiên, Đại học Hồng Đức Thanh Hóa. Thân dạng khí sinh, hình trụ, trên lát cắt ngang của thân có hình tròn không đều, thõn phõn biệt rừ mấu và giúng, cỏc giúng của thõn nhẵn, loe rộng ở hai đầu của mấu, màu lục nhạt.

Cả hai mẫu Bách bộ thu được, lỏ đều mọc đối hoặc so le, cỏc gõn lỏ nổi rừ ở mặt dưới của lỏ, gõn lỏ cú hình cung xuất phát từ cuống lá kéo dài đến hết phiến lá (hình 3.2). Từ các kết quả trên, cho thấy, về hình thái, kích thước lá Bách bộ thu tại Thanh Hóa và Hòa Bình không có sự khác nhau nhiều, chỉ số sai khác lớn nhất là chiều dài phiến lá (lệch 3,1cm). Từ các kết quả phân tích hình thái của Bách bộ như trên, cho thấy, hai mẫu Bách bộ được thu từ Hòa Bình và Thanh Hóa không có sự khác nhau nhiều, điều này có thể khẳng định, hai mẫu này có quan hệ cùng loài.

Tuy nhiên để khẳng định đặc điểm về giải phẫu của hai mẫu này, chúng tôi tiếp tục thực hiện lập tiêu bản giải phẫu cuống lá, thân, rễ và tiến hành so sánh hai mẫu Bách bộ này. Sau khi thu được các kết quả về giải phẫu của cuống lá, thân của hai mẫu cây Bách bộ thu tại Thanh Hóa và Hòa Bình, chúng tôi tiếp tục thực hiện giải phẫu rễ loại cây này, kết quả được trình bày tại hình 3.9. Kết quả trên hình 3.9 và 3.10 cho thấy, trên tiêu bản giải phẫu rễ Bách bộ tại Thanh Hóa và Hòa Bình không có sự sai khác, từ ngoài vào trong đều có thứ tự là chu bì; mô mềm vỏ; đai caspari; bó mạch và mô mềm.

Từ những phân tích kết quả hình thái cây, hoa, quả, hạt và giải phẫu của cuống lá, thân và rễ Bách bộ thu tại Thanh Hóa và Hòa Bình cho thấy, hai mẫu Bách bộ này là cùng loài.

Kết quả phân tích đoạn gen matK và rbcL của cây Bách bộ

• Kết quả phân lập và phân tích trình tự nucleotide của đoạn gen matK
• Kết quả phân lập và phân tích trình tự nucleotide của đoạn gen rbcL

Trình tự matK của mẫu Bách bộ thu tại Thanh Hóa TCTCTCATTTAATTATGTATTAGATATACTAATACCCCATCCTATCCATTTAG AAATTTTGGTTCAAATCCTTCAATGCCGGATCCAAGATGTTTCCTCTTTGCAT TTATTGCGATTCTTTCTCCATAAATATCATAATTGGGATAGTTTCATTACTCC GAAGAAATCCATTTACGTTTTTTCAAAAGAAAATAAAAGACTATTTCGAGTCC TAGATAATTCTTATGTATCTGGATGCGAATTTGTATTCGTTTTTTTTATTAAA AAATCCTCTTATTTACGATCAACATCTTCTGGAACCTTTCTTGAGCGAACACG TTTCTATGGAAAAATGGAACATCTTAATCTTATAGTAGTGTGTCGTAATTATT TTCCAAAGACCTTTTGGGTCTTCAAGGATCCCTTCATGCATTATGTTCGATAT CAAGGAAAAGCAATTTTGGCTTCAAAGAGAACTCCTCTTCTGATGAAGAAATG GAGATGCCACCTTGTCAATTTATGGCAATATTATTTTCACTTTTGGTCTCAAC CGCACAGGATTCGTATAAATCAATTATCGAATAATTCCTTCTATTTTTGGGGT TATCTTTCAAGTGTACTAATAAATCCTTCATCGGTAAGGAATCAAATGCTCGA GAATTCATTTATAATAGATACTGTTACTAAAAAATTCGATTCCATAGTCCCAG TTATTCCTCTTATTGGAGCATTGTCTAAAGCTAAATTTTGTACCGTATCGGGG CATCCTAGTAGTAAGCCGATATGGGCCGATGTATCAGATTCTGCTATTATTGA TCGATTTGGTCGGATATGTAGAAATCTTTCTCATTATCACAGCGGATCCTCAA AAAAACAGAGTTTGTATCGAATAAGGTATATACTTCGACTTCGTGTGCA. Đây cũng chính là cơ sở để chúng tôi tiếp tục tiến hành so sánh các trình tự matK thu được với các trình tự gen matK đã công bố trên ngân hàng gen quốc tế, làm cơ sở để chúng tôi tiến hành phân tích quan hệ di truyền của các trình tự thu được và các trình tự đã công bố trên gen banks. Sau khi thu được trình tự matK của hai mẫu Bách bộ thu tại Thanh Hóa và Hòa Bình, chúng tôi tiến hành phân tích, so sánh và xác định quan hệ di truyền của các trình tự matK thu được và các trình tự matK đã được công bố trên gen bank [37] kết quả được trình bày tại hình 3.12.

Kết quả tại hình 3.14 cho thấy, sản phẩm PCR đoạn gen rbcL được phân lập từ hai mẫu lá Bách bộ với cặp mồi đặc hiệu rbcL - F/ rbcL -R thu được băng DNA duy nhất ở vị trí khoảng 600 bp, kết quả này phù hợp với trình tự các cặp mồi tương ứng, đủ độ tin cậy làm cơ sở cho việc đọc trình tự rbcL phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo. Sau khi điện di, chúng tôi tiến hành đọc trình tự rbcL của hai mẫu lá Bách bộ thu được trên máy ABI PRISM® 3100 Avant Genetic Analyzer, sử dụng bộ Kit BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing với cặp mồi đặc hiệu, kết quả thu được tại bảng 3.5 và 3.6. Trình tự rbcL của mẫu Bách bộ thu tại Thanh Hóa TTGGATCCAGCTGGTGTTAAGATTACAAATTGAATTATTATACTCCTGATTAC AGAAACCAAGGATACTGATATCTTGGCAGCATTTCGAGTAACTCCTCAACCCG GAGTTCCGCCTGAAGAAGCAGGGGCAGCGGTAGCTGCTGAATCTTCTACTGGT ACATGGACAACTGTGTGGACTGATGGACTTACCAGTCTTGATCGTTACAAAGG ACGATGCTACCACATCGAGAGCGTTGTTGGGGAGGAAAATCAATATATTGCTT ATGTAGCTTATCCTTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTACTAATATGTTT ACTTCCATTGTAGGTAATGTATTTGGTTTCAAAGCCCTACGAGCTCTACGTCT GGAGGATCTGCGAATTCCTCCTGCCTATTCCAAGACTTTTCAAGGACCGCCTC ATGGTATCCAAGTTGAAAGAGATAAATTGAACAAGTACGGTCGTCCCCTATTG GGATGTACTATTAAACCAAAATTGGGATTATCTGCAAAGAACTACGGTAGAGC CGTTTATGAATGTCTACGCGGTGGACTGATTTTT.

Đây cũng chính là cơ sở để chúng tôi tiếp tục tiến hành so sánh các trình tự rbcL thu được với các trình tự gen rbcL đã công bố trên ngân hàng gen quốc tế, làm cơ sở để chúng tôi tiến hành phân tích quan hệ di truyền của các trình tự thu được và các trình tự đã công bố trên gen banks. Sau khi thu được trình tự rbcL của hai mẫu Bách bộ thu tại Thanh Hóa và Hòa Bình, chúng tôi tiến hành phân tích, so sánh và xác định quan hệ di truyền của các trình tự rbcL thu được và các trình tự rbcL đã được công bố trên gen bank [37] kết quả được trình bày tại hình 3.15. Từ những phân tích về hình thái, giải phẫu và hai trình tự matK; rbcL của mẫu lá Bách bộ thu tại Thanh Hóa và Hòa Bình cho thấy, hai mẫu này có quan hệ cùng loài và có trình tự matK quan hệ di truyền cùng loài Stemona tuberosa với trình tự matK mã số KT204764 đã được công bố trên gen banks.

Điều này cho thấy, Bách bộ có giá trị dược học cao, cần tiếp tục có các công trình nghiên cứu nhiều hơn nữa về thành phần các hoạt chất cụ thể trong củ, hạt Bách bộ, từ đó xây dựng nên các quy trình nuôi trồng, phát triển và khai thác hiệu quả nguồn dược liệu này, nâng cao giá trị nguồn tài nguyên thực vật này.