khảo sát tính chất methyl hóa vượt mức trên vùng promoter gen rarβ của bệnh nhân nhiễm hpv ở việt nam

TỔNG QUAN

Đại cương về ung thư cổ tử cung

I.1.1 Khái niệm về ung thư

Ung thư là một thuật ngữ chung mô tả các dạng bệnh lý phản ánh những thay đổi về sự tăng sinh và hoạt động của tế bào, có thể ảnh hưởng đến bất kì phần nào của cơ thể [93] Ung thư khởi phát từ một tế bào bình thường bị biến đổi qua nhiều giai đoạn, điển hình là sự tổn thương tiền ung thư và sự tăng sinh mất kiểm soát, sự xâm lấn của các tế bào ung thư dẫn đến hình thành các khối u ác tính Sự di căn là sự di chuyển các tế bào ác tính và xâm lấn các mô ở gần (xâm lấn cục bộ) hay ở xa qua hệ thống bạch huyết hay mạch máu [93]

I.1.2 Ung thư cổ tử cung

Ung thư cổ tử cung là ung thư ác tính, hình thành trong các mô cổ tử cung (cơ quan kết nối tử cung và âm đạo) [74] Tiến trình hình thành và diễn tiến ung thư cổ tử cung trải qua một khoảng thời gian dài, các tế bào biểu mô cổ tử cung bị biến đổi, chuyển từ trạng thái tiền sinh ung trở thành ung thư với các mức độ tổn thương khác nhau, gồm có loạn sản biểu mô cổ tử cung (Cervical intraepithelial neoplasia - CIN) và tổn thương biểu mô vảy ở mức độ thấp (Low-grade squamous Intraepithelial lesion - LSIL) và ở mức độ cao (High-grade squamous Intraepithelial lesion - HSIL) [94]

Các dạng ung thư cổ tử cung thường gặp là ung thư tế bào biểu mô vảy (Squamous cell carcinoma) và ung thư mô tuyến (Adeno carcinoma) [94] Ung thư biểu mô tế bào vảy phổ biến nhất, chiếm khoảng 80- 85% trong tất cả các loại ung thư cổ tử cung [74] Bên cạnh đó, ung thư mô tuyến, ung thư biểu mô tế bào nhỏ, ung thư tuyến vảy, ung thư tuyến mô liên kết, u melanin và ung thư hạch bạch huyết là các loại ung thư cổ tử cung hiếm gặp

SVTH: Huỳnh Tấn Tài Trang9

Các giai đoạn phát triển của ung thư cổ tử cung [95]

- Giai đoạn 0 (tiền ung thư)

Trong giai đoạn này, sự loạn sản xảy ra ở các lớp tế bào lót cổ tử cung ở cấp độ nhẹ, gây sự tổn thương ở dạng loạn sản nội biểu mô cổ tử cung (cervical intraepithelial neoplasia - CIN)

Dựa vào phương pháp quan sát bằng kính hiển vi, nhằm phân tích sự tổn thương vùng mô cổ tử cung, CIN được chia thành các cấp độ:

• CIN1: chứng loạn sản nhẹ biểu hiện có ít tế bào/mô bất thường

• CIN2: chứng loạn sản trung bình, biểu hiện có nhiều tế bào/mô bất thường hơn

• CIN3: chứng loạn sản nặng, là tiền ung thư nghiêm trọng nhất, biểu hiện hầu hết tế bào/mô bất thường

Sự sinh ung xảy ra bên trong cổ tử cung nhưng chưa xâm lấn sang các cơ quan khác

Các tế bào ung thư di chuyển ra ngoài cổ tử cung, xâm nhập vào các mô xung quanh nhưng không lan sang các mô dọc theo xương chậu hoặc phần dưới của âm đạo

Các tế bào ung thư di chuyển, xâm nhập vào phần dưới của âm đạo và/hoặc các mô dọc theo xương chậu

Các tế bào ung thư đã di căn đến các cơ quan khác, di chuyển và xâm nhập vào hệ ruột, bàng quang hoặc các cơ quan khác (phổi, gan)

Human Papillomavirus (HPV) là nguyên nhân dẫn đến một số bệnh lý lây truyền qua đường tình dục ở nam giới và phụ nữ trên toàn thế giới [8] HPV là nguyên

SVTH: Huỳnh Tấn Tài Trang10 nhân dẫn đến bệnh lý u sùi trên da, sùi mào gà cơ quan sinh dục, hậu môn, u nhú thanh quản trẻ sơ sinh [60]

HPV thuộc họ Papillomaviridea, gồm có khoảng 200 type HPV [8] Năm 1980, nhà virus học người Đức Harold zur Hausen và cộng sự đầu tiên chứng minh mối liên quan chặt chẽ giữa HPV và ung thư cổ tử cung [4][16]

Dựa vào mức độ gây tổn thương và dẫn đến cơ chế gây ung thư , HPV được xếp vào hai nhóm chính: HPV type nguy cơ thấp (low-risk type) và nhóm HPV type nguy cơ cao (high-risk type) Các type thuộc nhóm nguy cơ thấp: 6, 11, 40, 42,

43, 44, 54, 61, 70, 72, 81, [8] Nhóm HPV type nguy cơ cao có khả năng gắn chèn vật liệu di truyền (DNA) vào bộ nhiễm sắc thể của tế bào người, liên quan đến cơ chế sinh ung thư cổ tử cung Một số type thuộc nhóm nguy cơ cao gồm có: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73 và 82 [8] Khoảng 70% các trường hợp ung thư cổ tử cung là do nhiễm HPV type 16 và HPV type 18 Trong tổng số trường hợp phụ nữ nhiễm HPV, có khoảng trong đó 24% nhiễm HPV type 16 và 9% nhiễm HPV type 18 [16]

Hình 1.1: Sự xâm nhiễm và tiến trình gây ung thư cổ tử cung của virus HPV [81]

SVTH: Huỳnh Tấn Tài Trang11

I.1.4 Cơ chế gây ung thư của HPV

Trong cơ chế xâm nhiễm vào tế bào ký chủ, vật liệu di truyền của HPV được đóng gói ở dạng “episome” (DNA dạng vòng, tồn tại độc lập với bộ nhiễm sắc thể tế bào ký chủ) ở nhóm HPV nguy cơ thấp hoặc gắn chèn vào bộ nhiễm sắc thể tế bào ký chủ ở nhóm HPV nguy cơ cao Ở dạng “episome”, gen E2 của HPV hoạt động, quá trình sinh tổng hợp protein E2 diễn ra trong tế bào chất của tế bào ký chủ Protein E2 tham gia vào cơ chế kìm hãm sự biểu hiện của hai gen E6 và E7, là hai “oncogene” của HPV giữ vai trò quan trọng trong cơ chế sinh ung Ở dạng gắn chèn vào bộ nhiễm sắc thể tế bào ký chủ, sự hoạt động của gen E2 bị bất hoạt dẫn đến kích hoạt sự biểu hiện hai oncogen E6, E7 [29]

Trong tế bào ký chủ, p53 (Tumor Protein p53) và yếu tố ức chế sự sinh u pRb (retinoblastoma protein) giữ vai trò chính trong cơ chế kiểm soát chu trình tế bào, sự tăng sinh và sự chết theo chương trình của tế bào [35] Chức năng của p53 và pRb lần lượt bị bất hoạt bởi protein E6, E7, dẫn đến mất kiểm soát chu trình tế bào, sự tăng sinh và sự chết theo chương trình của tế bào ký chủ Đồng thời, quá trình tái bản của HPV diễn ra [29]

Protein E6 gồm có 150 amino acid, có vùng cấu trúc Cys-X-X-Cys gắn với kẽm (Zn) Protein E6 tương tác với p53 thông qua sự hình thành liên kết giữa E6 và phối tử E6AP [29]

Gen E7 mã hóa cho protein E7, gồm 98 acid amin và bao gồm 3 vùng bảo tồn gọi là CR1, CR2, CR3 Sự kết hợp của protein E7 với pRb đã được khử phosphorin dẫn đến giải phóng phức hợp E2F/DP Ở trạng thái tự do, các nhân tố E2F có vai trò hoạt hóa quá trình tăng sinh của tế bào, kích hoạt sự biểu hiện của các gen sinh ung, [29]

Hình 1.2: Co’ chế hoạt động của oncoprotein E6, E7 trong CO’chế sinh ung |97L

1 1.4 Tình hình ung thư cổ tử cung trên thế giói

Theo số liệu thống kê của Globocan (2012), ung thư cố tử cung đứng hàng thứ tư trong nhóm ung thư có trường họp mắc mới và gây tử vong cao nhất ở phụ nữ Trong đó, số trường họp mắc mới và trường họp bị tử vong do ung thư cô tử cung lần lượt là 527.624 trường họp (7,9%) và 266.000 trường họp (7,5%) Đáng chú ý là có khoảng 85% trường họp mắc bệnh mới và 87% trường họp tủ' vong tập trung ở các nước đang phát triển 11 °41.

■ Buồng trứng Tuyên giáp Gan

Các loại ung thư khác

Hình 1.3: Tỷ lệ mắc bệnh ung thư cổ tử cung ỏ’ nữ giới trên Thế giói 11041

SVTH: Huỳnh Tấn Tài Trang 12

SVTH: Huỳnh Tấn Tài Trang13

I.1.5 Tình hình ung thư cổ tử cung ở Việt Nam

Epigenetics, sự methyl hóa DNA và đảo CpG

Epigenetics là sự biến đổi di truyền trong sự biểu hiện kiểu gen nhưng không xảy ra những biến đổi trong trình tự DNA [65] Các cơ chế biến đổi epigenetics: sự methyl hóa DNA (DNA methylation) và sự biến đổi histone (Histone modification) [65] Công trình nghiên cứu của Paredes và cộng sự (2011) ghi nhận epigenetics có vai trò quan trọng trong kiểm soát sự hình thành và diễn tiến của ung thư [31]

Hình 1.4: Tỷ lệ mắc bệnh ung thư cổ tử cung ở nữ giới tại Việt Nam

SVTH: Huỳnh Tấn Tài Trang14

Sự methyl hóa là một biến đổi cộng hóa trị dẫn đến sự bổ sung nhóm –CH3 vào vị trí carbone số 5 của Cytosine trong cặp nucleotide CpG nhờ xúc tác của hệ enzyme DNA methyltransferase (DNMTs) Các enzyme này thúc đẩy phản ứng chuyển nhóm –CH3 từ S-adennosylmethionine (SAM) đến Cytosine [30] Sự methyl hóa là trường hợp biến đổi epigenetics chính trong bộ gen động vật có vú, khoảng 70% các cặp nucleotide CpG trong bộ gen của động vật có vú đều bị mehtyl hóa [39]

Họ enzyme DNA methyltransferase (DNMTs) gồm có: DNMT1, DMNT2, DNMT3a, DNMT3b, DNMT3L [18] DNMT1 có nhiệm vụ duy trì gốc methyl ở những vị trí Cytosine trên sợi đơn DNA sản phẩm trong quá trình sao chép DNA, dẫn đến cơ chế di truyền tính chất methyl hóa DNA cho các thế hệ tế bào tiếp theo [32] Enzyme DNMT3a, DNMT3b giữ vai trò trong sự methyl hóa DNA de novo và duy trì sự methyl hóa [19]

Hình 1.5: Các cơ chế epigenetics [98]

SVTH: Huỳnh Tấn Tài Trang15

Sự biến đổi chức năng của các enzym DNA methyltransferase dẫn đến sự methyl hóa DNA bất thường, gồm có methyl hóa vượt mức (hypermethylation) hoặc giải methyl hóa (hypomethylation) [39] Sự methyl hóa DNA vượt mức gây nên sự “im lặng” trong biểu hiện gen, điển hình là sự bất hoạt chức năng của các gen ức chế khối ung (tumour suppressor gene) [57][62] Giải methyl hóa có thể dẫn đến một số hậu quả: mất tính ổn định trên gen, kích hoạt các yếu tố chuyển vị hoặc bất hoạt cơ chế in dấu gen (imprinting genes) và kích hoạt cơ chế hoạt động của các gen tiền sinh ung (oncogene) [20]

Các nhà khoa học ghi nhận tính chất methyl hóa vượt mức diễn ra trên đảo CpG ở vùng promoter của một số gen ức chế khối ung trong một số loại tế bào ung thư: cổ tử cung, phổi, buồng trứng… [52] Từ đó cho thấy tính chất methyl hóa DNA vượt mức là dấu hiệu sớm trong sự hình thành và diễn tiến ung thư, có thể

Hình 1.6: Phản ứng methyl hóa [66]

Hình 1 7: Sự methyl hóa trong tế bào lành và tế bào ung thư [99]

SVTH: Huỳnh Tấn Tài Trang16 là dấu chứng sinh học tiềm năng trong việc tiên lượng, chẩn đoán sớm các bệnh ung thư [52]

Trong bộ gen động vật có vú, đảo CpG là những vùng gen có kích thước khoảng

200 -1000 bp với tỷ lệ CG>50% CpG là dinucleotide được hình thành bởi liên kết phosphodiester (ký hiệu bởi chữ “p”) giữa nucleotide cytosine và guanine [45] Trong bộ gen người, khoảng 60% vùng promoter các gen có chứa đảo CpG và thường không bị methyl hóa trong tế bào lành Sự methyl hóa trong các đảo CpG nằm trong vùng promoter dẫn đến kết quả là im lặng trong biểu hiện gen [46]

Tổng quan về gen RARβ

I.3.1 Vị trí, cấu trúc và chức năng của gen RAR β

Gen RARβ (Retinoic Acid Receptor Beta - RARβ) nằm trên nhiễm sắc thể số 3

(3p24.2), định từ 25.174.332 bp đến 25.597.932 bp, có kích thước là 423.601 bp (GeneCards) Gen RARβ thuộc nhóm ức chế khối u, mã hóa protein thuộc siêu họ thụ thể hormon thyroid – steroid, gồm ba loại thụ thể retinoic acid: RARα, RARβ,

Retinoid acid là dạng dẫn xuất của vitamin A, có chức năng trong con đường tín hiệu tế bào, kiểm soát sự tăng sinh của tế bào và sự phát sinh cơ quan, kiểm soát sự sinh ung Retinoid tương tác với thụ thể acid (Retinoid acid receptors – RARs) và thụ thể Retinoid X ( Retinoid X receptors – RXRs ), các thụ thể này có vai trò kích thích sự phiên mã bởi liên kết với thành phần phản ứng retinoic acid (Retinoic Acid Response Elements – RAREs) nằm trên vùng promoter của gen mục tiêu [37][77]

Gen RARβ là một gen ức chế khối u, mã hóa có vai trò tương tác với thụ thể retinoic acid, sự im lặng của RARβ2 là một nguyên nhân dẫn đến tế bào khối u tăng sinh bất thường [37] Nhiều nghiên cứu chứng minh rằng trong các tế bào ung

SVTH: Huỳnh Tấn Tài Trang17 thư (ung thư cổ tử cung, ), sự biểu hiện của gen RARβ2 giảm hoặc không bị kìm hãm hoàn toàn [37]

Gen RARβ gồm có hai vùng promoter ở đầu 5’ kiểm soát sự phiên mã mRNA của bốn loại thụ thể : RARβ1, RARβ2, RARβ3, RARβ4 Trong đó chỉ có sự phiên mã mRNA của RARβ2 chịu sự kiểm soát bởi vùng promoter thứ hai [84]

Hình 1 8: Vị trí gen RAR β (GeneCards)

I.3.2 Tính chất methyl hóa gen RAR β

Công trình nghiên cứu Yamnanaka và cộng sự (2003) sử dụng phương pháp MSP phân tích sự methyl hóa trên vùng vùng promoter gen RARβ trong 109 mẫu mô ung thư tuyến tiền liệt Kết quả nghiên cứu ghi nhận tần suất methyl hóa trên vùng promoter gen RARβ là 78% [82]

Công trình nghiên cứa của Ivanova và cộng sự (2002) sử dụng phương pháp MSP và phương pháp Northern blot phân tích sự methyl hóa đảo CpG thuộc vùng trình tự promoter kéo dài đến exon đầu tiên của gen RARβ2 trong 20 mẫu mô của các bệnh nhân ung thư cổ tử cung dạng SCC (Squamous cell carcinomar) Nhóm tác giả xác định tần suất methyl hóa DNA trên gen RARβ2 xấp xỉ 40% Đây là minh chứng cho thấy sự methyl hóa ở đầu 5’ của gen RARβ2 là dấu chứng tiềm năng trong tiên lượng, chẩn đoán bệnh ung thư [37]

Năm 2010, công trình nghiên cứu của Hawes và cộng sự xác định tần suất methyl hóa gen RARβ vào khoảng 31% trong 117 mẫu mô của bệnh nhân ung thư phổi

Công trình nghiên cứu của Hoshimoto và cộng sự (2015) sử dụng phương pháp MSP xác định mức độ methyl hóa trên 140 mẫu ung thư biểu mô thực quản dạng ESCC (Esophageal squamous cell carcinoma) Kết quả nghiên cứu ghi nhận tính

SVTH: Huỳnh Tấn Tài Trang18 chất biến đổi cơ chế epigenetics, điển hình là sự methyl hóa vượt mức DNA liên quan đến đến sự hình thành và phát triển khối u [33]

Hiện nay, bộ dữ liệu về tính chất methyl hóa trên vùng promoter gen RARβ trên người bệnh Việt Nam có rất ít công bố, chúng tôi chỉ thu thập được một số công bố khoa học do PGS.TS Lê Huyền Ái Thúy chủ trì nghiên cứu và dựa trên bộ mẫu bệnh phẩm Công ty cổ phần Việt Á cung cấp Điển hình vào năm 2011, công bố nghiên cứu của Lê Thị Trúc Linh và cộng sự (2011) thực hiện quy trình MSP xác định tính chất methyl hóa trên gen RARβ là 58% trên 31 mẫu bệnh phẩm (5 mẫu mô và 32 mẫu dịch phết tế bào) được khẳng định có tính chất nhiễm HPV type nguy cơ cao (16, 18, 11, 33) [11]

Tiếp theo, công trình nghiên cứu của Lao Duc Thuan et al (2013) ứng dụng phương pháp MSP xác định mức độ methyl hóa trên vùng promoter gen RARβ là 77.4 % (24/31 mẫu bệnh phẩm) [12] Năm 2014, công bố khoa học của Phuong et al (2014) xác định tính chất methyl hóa trên vùng promoter gen RARβ là 78,8% trên 33 mẫu bệnh phẩm nhiễm HPV type nguy cơ cao [13] Các công bố nghiên cứu này là tiền đề khoa học để chúng tôi kế thừa và tiến hành tiếp tục khảo sát tính chất tính chất methyl hóa trên vùng promoter gen RARβ trên bộ mẫu bệnh phẩm (dịch phết tế bào, ) có nhiễm hoặc không nhiễm HPV type nguy cơ cao, bằng phương pháp sinh học phân tử phù hợp (MSP hoặc Nested-MSP).

Các phương pháp phân tích sự methyl hóa DNA

I.4.1 Phương pháo MSP (Methylation-specific Polymerase Chain Reaction)

Methylation-specific PCR (MS-PCR) đã được phát triển bởi Herman và cộng sự vào 1996 MSP là phương pháp PCR cải tiến, cho phép xác định tình trạng methyl hóa của bất kỳ vị trí CpG thuộc các đảo CpG, phổ biến ở vùng promoter của các gen [91] Để tiến hành phản ứng MSP, trình tự DNA bộ gen được biến đổi bisulfite để chuyển tất cả cytosine không bị methyl hóa thành uracil và cytosine bị methyl

SVTH: Huỳnh Tấn Tài Trang19 hóa không bị biến đổi Sau khi được biến đổi, sản phẩm DNA bộ gen được sử dụng làm khuôn trong hai phản ứng PCR: một phản ứng với cặp mồi đặc hiệu với trạng thái allele methyl hóa (phản ứng methyl); một phản ứng với cặp mồi đặc hiệu với trạng thái allele không methyl hóa (phản ứng unmethyl) [91] Đối với phương pháp MSP, để phân biệt DNA bị methyl hóa hoặc không bị methyl hóa, trong trình tự mỗi mồi phải có nhiều hơn hai vị trí CpG Kết quả phân tích tính chất methyl hóa được ghi nhận như sau:

(1) Phản ứng methyl âm tính; phản ứng unmethyl dương tính: DNA không bị methyl hóa

(2) Phản ứng methyl dương tính; phản ứng unmethyl dương tính: DNA bị methyl hóa không hoàn toàn

(3) Phản ứng methyl dương tính; phản ứng unmethyl âm tính: DNA bị methyl hóa hoàn toàn.

SVTH: Huỳnh Tấn Tài Trang20

Nested-MSP là phương pháp có độ nhạy cao được sử dụng để phát hiện tình trạng methyl hóa của các mẫu bệnh phẩm có lượng DNA thấp (ví dụ: mẫu parafin,…) [90] Nested-MSP là phương pháp PCR cải tiến bao gồm:

(1) Phản ứng PCR thứ nhất sử dụng một cặp mồi đặc hiệu trên vùng trình tự mục tiêu với DNA bản mẫu đã được biến đổi bisulfit Kết quả PCR khuếch đại vùng trình tự DNA bao quanh các vị trí CpG, nhưng không phân biệt tình trạng methyl hóa/không bị methyl hóa của gen mục tiêu

(2) Phản ứng PCR thứ hai thực chất là phản ứng MSP, thực hiện riêng biệt phản ứng methyl và phản ứng unmethyl trên DNA bản mẫu là sản phẩm của phản ứng PCR thứ nhất [59]

SVTH: Huỳnh Tấn Tài Trang21

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Vật liệu

Chúng tôi thu thập bộ mẫu bệnh phẩm dịch phết tế bào (Pap’smears) (kèm theo các chỉ tiêu lâm sàng) có tính chất nhiễm HPV type nguy cơ cao, nguy cơ thấp, mẫu không nhiễm HPV do Công ty cổ phần dịch vụ Phân tích di truyền cung cấp.

Phương pháp nghiên cứu

II.2.1 Khai thác dữ liệu

Chúng tôi dựa vào một số từ khóa như: “RARβ gene”, “methylation”, “cervical cancer”, “HPV”,… nhằm thu thập các bài báo khoa học tiếng Anh trên cơ sở dữ liệu PubMed, PubMed Central (NCBI), Google Các công bố khoa học này thuộc các hướng nghiên cứu tính chất methyl hóa ở các đảo CpG trên vùng promoter của gen RARβ liên quan đến tính chất nhiễm HPV, ung thư cổ tử cung

II.2.2 Khảo sát in silico

Thu thập trình tự gen mục tiêu:

- Chúng tôi thu nhận trình tự gen RARβ trên cơ sở dữ liệu của Genecard (http://www.genecards.org/)

- GenBank thuộc NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)

Thiết kế và đánh giá mồi:

− Sử dụng công cụ trực tuyến Methprimer xác định vị trí các đảo CpG trên vùng promoter của gen RARβ và xác định các cặp mồi phù hợp với phương pháp phân tích tính chất methyl hóa DNA (Nested-PCR)

− Sử dụng công cụ trực tuyến Gpminer xác định vị trí nhận biết của các nhân tố phiên mã trên vùng promoter của gen RARβ, (vị trí “hot-spot”)

− Sử dụng công cụ trực tuyến OligoAnalyzer 3.1 (IDT) và phần mềm Annhyb khảo sát các thông số vật lý (chiều dài, %GC, nhiệt độ nóng chảy, cấu trúc thứ cấp self dimer, hetero dimer, hairpin-loop), vị trí khuếch đại

SVTH: Huỳnh Tấn Tài Trang22 và kích thước sản phẩm PCR của các cặp mồi phù hợp với phương pháp phân tích tính chất methyl hóa DNA (Nested-PCR)

II.2.3 Khảo sát thực nghiệm

Chúng tôi tách chiết DNA bộ gen người từ các mẫu bệnh phẩm dịch phết tế bào (Pap’smear) dựa trên phương pháp phenol/chloroform Trong đó, màng tế bào và màng nhân được biến tính bằng chất tẩy mạnh (SDS) kết hợp sử dụng enzym proteinase K Sau đó, biến tính và loại bỏ protein bằng phenol/chloroform DNA bộ gen sẽ được tủa với ethanol tuyệt đối trữ lạnh

− Ammonium acetate (NH4CH3CO2) 5M

❖ Dụng cụ và thiết bị

− Pipetman và ddầu tip 0,5 àl, 100 àl và 1000 àl

− Máy ly tâm lạnh (Hettich)

− Bể ổn nhiệt (Thermo Final Test)

SVTH: Huỳnh Tấn Tài Trang23

❖ Các bước tiến hành tách chiết DNA từ các mẫu dịch phết tề bào (Pap’s smear)

- Thu nhận mẫu bệnh phẩm chuyển vào ống eppendorf loại 1,5ml

- Bổ sung một thể tớch phự hợp (500-700 àl) dung dịch ly giải, bao gồm: NaCl 5M, Tris-HCl 1M (pH=8), dung dịch đệm EDTA 0,5M (pH=8), SDS 10%, H2O cất hai lần và proteinase K (nồng độ 20 ng/ml), ủ mẫu trong trong 2 giờ, 56 o C

- Bổ sung một thể tích phù hợp của dung dịch phenol:chloroform (tỷ lệ 1:1) , trộn đều Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 3 phút Chuyển phần dịch nổi phía trên sang ống eppendorf mới

- Thêm một lượng dung dịch chloroform bằng thể tích dịch nổi thu được, đảo nhẹ Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút Chuyển phần dịch nổi phía trên sang ống eppendorf mới (thể tích V1)

- Bổ sung một lượng Ammonium acetate 5M và một lượng Ethanol tuyệt đối theo tỷ lệ 0,2: 2,5 thể tích V1

- Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 20 phút, 4 0 C Loại bỏ phần dịch nổi, thu tủa

- Bổ sung 500 àl Ethanol 70% Ly tõm 13.000 vũng/phỳt trong 5 phỳt , 4 0 C

- Loại bỏ dịch nổi, thu tủa Để khô trong 30 phút

- Hũa tan DNA trong 30-50 àl nước cất hai lần vụ trựng Bảo quản DNA ở 4 0 C đến -20 0 C

II.2.3.2 Kiểm tra chất lượng DNA thu nhận bằng phương pháp đo mật độ quang

Hàm lượng DNA có thể xác định được nhờ sự hấp thu mạnh ánh sáng ở bước sóng 260 nm Giá trị mật độ quang OD 260 nm (Optical Density 260 nm) của các mẫu DNA cho phép xác định nồng độ DNA trong dung dịch, theo công thức:

A 260 nm= 1OD = 50 àg/ml DNA sợi đụi

Do đó, nồng độ DNA (C) trong mẫu được tính theo công thức sau [68] :

SVTH: Huỳnh Tấn Tài Trang24

Chú thích: d: độ pha loãng

Bên cạnh đó, độ tinh sạch của dung dịch acid nucleic thể hiện qua chỉ số A 260 nm nm/ A 280 nm nằm trong khoảng 1,8 – 2

Hóa chất và thiết bị

− Máy đo quang phổ (Bio Rad)

DNA bộ gen được pha loãng bằng nước cất vô trùng Sau đó, chuyển tất cả huyền DNA pha loãng vào cuvette Sau đó, tiến hành đo nồng độ DNA ở bước sóng 260 nm và xác định độ tinh sạch của dung dịch được xác định bằng A 260 nm nm/ A 280 nm

II.2.3.3 Biến đổi DNA bằng sodium bisulfite với bộ kit EZ DNA Methylation-Gold (The Epigenetic company TM )

Các mẫu được xử lý với hỗn hợp biến đổi sodium bisulfite để chuyển cytosine thành uracil (ngoại trừ các 5mC) sẽ được cố định trên màng của cột, sau đó rửa sạch muối và DNA được thu hồi lại

SVTH: Huỳnh Tấn Tài Trang25

- Chuẩn bị dung dịch biến đổi EZ1: Thờm 900 àl dung dịch nước cất 2 lần, 300 àl dung dịch EZ2 và 50 àl dung dịch EZ3 vào ống CT Conversion Reagent, trộn đều trong 10 phút

- Bổ sung 130 àl dung dịch CT Conversion Reagent (EZ1) và 20 àl huyền dịch dung dịch DNA đó hỳt bộ gen vào eppendorf 250 àl, trộn đều Sau đú đưa vào chu trình nhiệt như hình 2.1

Hình 2 1: Chu trình nhiệt biến đổi bisulfite

- Bổ sung 600 àl EZ4 vào cột Zymo-spinTMIC (C1), sau đú thờm dung dịch DNA (đã được xử lý bằng dung dịch chu trình nhiệt) vào cột C1, đảo đều Sau đó, ly tâm 13.000 vòng/ phút trong 30 giây, ở nhiệt độ phòng Loại bỏ dung dịch sau ly tâm, giữ lại cột C1

- Bổ sung 100 àl EZ5 vào cột C1, ly tõm 13.000 vũng/ phỳt trong 30 giõy, ở nhiệt độ phòng Đổ bỏ dung dịch sau ly tâm

- Bổ sung 200 àl EZ6 vào cột C1, để nhiệt độ phũng 15-20 phỳt, ly tõm 13.000 vòng/ phút trong 30 giây Đổ bỏ dung dịch sau ly tâm

- Bổ sung 200 àl EZ5 vào cột C1, ly tõm 13000 vũng/ phỳt trong 30 giõy, ở nhiệt độ phòng, lặp lại bước này 1 lần

- Đặt cột C1 vào Eppendorf 1,5 ml, thờm 10 àl EZ7, ly tõm 13000 vũng/ phỳt trong 30 giây, ở nhiệt độ phòng

- Thu dung dịch DNA đã được biến đổi bisulfite, bảo quản ở -20 o C

II 2.3.4 Phản ứng Nested-MSP

Sau khi tách chiết và biến đôi sodium bisulfite các mẫu DNA tò các mẫu bệnh phẩm dịch phết tế bào (Pap’smears), chúng tôi tiến hành thục hiện phản ứng Nested - MS P nhằm xác định tính chat methyl hóa trên bộ mẫu bệnh phẩm dịch phết tế bào có tính chất nhiễm HPV type nguy cơ cao, nguy cơ thấp, mẫu không nhiễm HPV.

- Nước cất hai lần vô trùng

- Bộ mồi ngoài NF và NR

- Máy luân nhiệt (Bio Rad)

Bảng 2.1 Thành phần phản ứng PCR

SVTH: Huỳnh Tấn Tài Trang 26

SVTH: Huỳnh Tấn Tài Trang27

Chú thích: Ta*: nhiệt độ lai tối ưu P: phút

II.3.4.6 Phương pháp điện di

Kỹ thuật điện di phân tách các phân tử nucleic acid, dựa vào sự di chuyển về phía điện cực dương của các phân tử nucleic acid tích điện âm trong điện trường trên pha rắn (gel agarose, gel polyacrylamide) Sự di chuyển của các phân tử nucleic acid được quyết định bởi điện tích, trọng lượng và cấu hình của phân tử nucleic acid (dạng vòng, dạng thẳng hoặc siêu xoắn)

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

Kết quả khai thác dữ liệu

III.1.1 Gen RAR β ( Retinoic Acid Receptor, Beta )

III.1.1.1 Bộ dữ liệu các công trình nghiên cứu liên quan đến tính chất methyl hóa gen RARβ

Nhằm mục đích tìm hiểu về tính chất methyl hóa trên vùng promoter của gen

RARβ, chúng tôi khai thác dữ liệu nguồn dữ liệu NCBI và nguồn dữ liệu trên Internet với các từ khóa “RARβ gene”, “DNA methylation”, “cervical cancer”… Cập nhật đến tháng 04/2016, chúng tôi thu thập được 38 tài liệu khoa học bằng tiếng anh

Trong tổng số tài liệu khoa học ở dạng tổng quan là 9 bài báo, mô tả chức năng của gen RARβ và cơ chế methyl hóa gen RARβ dẫn đến cơ chế sinh ung Tổng số bài báo khoa học phân tích tần suất methyl hóa gen RARβ trong các loại mẫu bệnh phẩm ung thư và mẫu bệnh phẩm nhiễm HPV là 29

Tuy nhiên, chúng tôi tập trung khảo sát tính chất mehtyl hóa gen RARβ trong các loại mẫu bệnh phẩm thuộc 8 bệnh ung thư thường gặp ở phụ nữ: cổ tử cung, buồng trứng, bàng quang, dạ dày, đầu và cổ, phổi và vú (bảng 3.1)

Bảng 3.1: Bộ dữ liệu tài liệu khoa học về gen RARβ

STT Nội dung Số lượng bài báo Tài liệu tham khảo

Nghiên cứu thực nghiệm về tính chất methyl hóa trên gen RARβ

SVTH: Huỳnh Tấn Tài Trang29

III.1.1.2 Bộ dữ liệu về tần số methyl hóa trong UTCTC và các ung thư khác

Kết quả khảo sát cho thấy tính chất methyl hóa trên vùng promoter gen RARβ thể hiện các mức độ khác nhau trong các loại ung thư khác nhau (Bảng 3.2)

Bảng 3.2 Tần số methyl hóa gen RAR β trên các mẫu bệnh phẩm ung thư

STT Tên ung thư Tần số methyl hóa (%)

Tổng mẫu Tần số methyl trung bình có trọng số (%)

SVTH: Huỳnh Tấn Tài Trang30

Chú thích: nd: none data (không có dữ liệu) Đối với ung thư cổ tử cung đã có nhiều công trình nghiên cứu về tính chất methyl hóa vùng promoter gen RARβ, kết quả khảo sát cho thấy tần suất methyl hóa trung bình khoảng 40,3%, tần suất methyl hóa trung bình có trọng số là 40.0% Bên cạnh đó, chúng tôi nhận thấy tần suất methyl hóa trung bình có trọng số ở ung thư vú, ung thư đầu và cổ và ung thư phổi lần lượt là 47,7%, 32.15%, 60,67%

Bên cạnh đó kết quả khảo sát cho thấy tính chất methyl hóa trên gen RARβ liên quan tối yếu tố nhiễm HPV (bảng 3.3)

Bảng 3 3 Tần số methyl hóa gen RARβ liên quan yếu tố nhiễm HPV

Type HPV (Tổng Mẫu n) Tần số methyl hóa (%) TLTK

SVTH: Huỳnh Tấn Tài Trang31

III.1.1.3 Bộ dữ liệu về phương pháp sinh học phân tử được sử dụng để nghiên cứu về tính chất methyl hóa vùng promoter của gen RARβ

Dựa vào kết quả thu thập được, chúng tôi ghi nhận có nhiều phương pháp sinh học phân tử được sử dụng (Hình 3.1) Tuy nhiên chúng tôi nhận thấy phương pháp sinh học phân tử MSP được sử dụng phổ biến nhất (76,92%) trong các công trình nghiên cứu Đây là cơ sở khoa học để chúng tôi lựa chọn được phương pháp này nhằm khảo sát tính chất methyl hóa DNA trên vùng promoter của gen RARβ

Chú thích: BC (Breast cancer): ung thư vú; BLC (Bladder cancer): ung thư bàng quang; CC (Cervical cancer): UTCTC; GC (Gastric cancer): ung thư dạ dày; HNC (Head and neck cancer): ung thư đầu cổ; LC (Lung cancer): ung thư phổi; LIC (liver cancer): ung thư gan; OVC (Ovarian cancer): ung thư buồng trứng

Hình 3.1: Đồ thị mô tả các phương pháp sinh học phân tử được sử dụng để khảo sát tính chất methyl hóa vùng promoter trên gen RAR β

SVTH: Huỳnh Tấn Tài Trang32

III.1.1.4 Các loại mẫu được sử dụng để khảo sát tính chất methyl hóa gen

Dựa vào kết quả khảo sát các công trình nghiên cứu (hình 3.2), chúng tôi ghi nhận trong 22 công trình nghiên cứu trên 8 loại ung thư nêu sử dụng mẫu mô trong phân tích tính chất methyl hóa trên gen RARβ vào khoảng 96% (trên tổng số công trình nghiên cứu), mẫu bệnh phẩm huyết thanh (máu) được sử dụng với tỷ 4% (trên tổng số công trình nghiên cứu)

Chú thích: BC (Breast cancer): ung thư vú; BLC (Bladder cancer): ung thư bàng quang; CC (Cervical cancer): UTCTC; GC (Gastric cancer): ung thư dạ dày; HNC (Head and neck cancer): ung thư đầu cổ; LC (Lung cancer): ung thư phổi; LIC (liver cancer): ung thư gan; OVC (Ovarian cancer): ung thư buồng trứng

Hình 3.2: Đồ thị mô tả các loại mẫu được sử dụng trong các công trình nghiên cứu khảo sát tính chất methyl hóa vùng promoter trên gen RARβ

SVTH: Huỳnh Tấn Tài Trang33

III.1.1.5 Tần suất methyl hóa gen RARβ trong các loại ung thư

Kết quả hiển thị ở hình 3.3 cho thấy tần suất methyl hóa gen RARβ xuất hiện trong từng loại ung thư khác nhau dao động ở khoảng 5% - 60%, kết quả phân tích có ý nghĩa thống kê (P