khảo sát thực nghiệm sự methyl hóa đảo cpg trên vùng promoter gen p16ink4α trong bệnh ung thư biểu mô vòm họng ở người việt nam

Mà hiện tượng epigenetics chính là sự methyl hóa vượt mức hypermethylation trên các gen ức chế khối u tumor suppressor genes, cụ thể được biết đến là gen p16INK4α , methyl hóa vượt mức t

Tổng quan về ung thư

Tình hình ung thư trên thế giới và Việt Nam

Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), đã thống kê tỷ lệ mắc bệnh trên thế giới vào năm 2012, số người mắc bệnh ung thư có khoảng 14,1 triệu ca mới, khoảng 8,2 triệu ca tử vong và đến 2015 thì có số người mắc ung thư tăng lên khá cáo hơn 15 triệu người mắc bệnh ung thư, trong đó có hơn 8,8 triệu người tử vong [59]

Báo cáo khóa luận tốt nghiệp

SVTH: Lương Thị Bích Thuận Trang 2

Hình 1.1 Tỷ lệ mắc bệnh và tỷ lệ tử vong trong ung thư trên thế giới Ở Việt Nam, theo thống kê của Cơ quan Quốc tế Nghiên cứu về Ung thư (International Agency for Research on Cancer) vào năm 2015, số người mắc phải bệnh ung thư có hơn 139.000 và có đến hơn 106.000 người tử vong [63].

Tình hình ung thư vòm họng

Ung thư vòm họng là một trong những dạng ung thư hiếm gặp ở hầu hết các nơi trên thế giới nhưng lại rất phổ biến ở Trung Quốc, các quốc gia phía Đông và Nam châu Á, một số nước Bắc Phi và châu Âu Theo thống kê của Cơ quan Quốc tế Nghiên cứu về Ung thư (International Agency for Research on Cancer) tính đến năm 2012, trên thế giới có đến 86.691 mắc bệnh ung thư vòm họng chiếm đến 0,6% tỉ lệ trong số các bệnh ung thư, trong đó có đến hơn 50.000 tử vong chiếm tỉ lệ khoảng 0,6% Ở Việt Nam, có gần 5.000 người mắc bệnh ung thư vòm họng chiếm 3,9% trong số các bệnh ung thư, trong đó có hơn 2.800 người tử vong chiếm tỷ lệ khoảng 3% [63].

Tổng quan về ung thư vòm họ ng

Ung thư vòm họng

Ung thư vòm họng là bệnh ung thư bắt đầu từ vòm mũi họng, phần trên của họng phía sau mũi và gần đáy của hộp sọ [60]

Hình 1.2 Giải phẩu về vùng vòm họng

Ung thư vòm họng do các nguyên nhân có tác động qua lại với nhau gây ra, gồm sự xâm nhiễm của EBV (Epstein-Barr virus), sự methyl hóa vượt mức trên các đảo CpG ở vùng promoter của một số gen như p16 INK4 α , DAPK, E-cadherin, RASSF1A, p14, RARò2…, yếu tố mụi trường và chế độ ăn uống [60][29].

Phân loại ung thư vòm họng [61]

Theo Ủy ban Liên Hợp Mỹ về ung thư (AJCC) phân ra các giai đoạn của ung thư vòm họng:

Giai đoạn 0: các tế bào ung thư tại chỗ (in situ)

Giai đoạn I: các khối u ở vòm mũi họng và có thể đã lây lan đến các mô mềm của khoang mũi và/ hoặc vùng hầu họng

Giai đoạn IIA: các khối u đã phát triển thành các mô ở bên trái hoặc bên phải của phần trên cổ họng

Giai đoạn IIB của ung thư vòm họng được đặc trưng bởi khối u xâm lấn vượt qua giới hạn giải phẫu của mũi họng, lan rộng đến các mô mềm xung quanh như xoang mũi hoặc họng hầu Đặc biệt, giai đoạn này ghi nhận sự di căn hạch bạch huyết khu vực với khối u lan sang một hoặc nhiều hạch lân cận Tình trạng này biểu thị sự tiến triển của bệnh và cần được điều trị tích cực để kiểm soát sự phát triển và di căn của khối u hiệu quả.

Giai đoạn IIIA: khối u đã lan rộng đến các xoang hoặc các xương gần vùng mũi họng, khối u có thể hoặc không thể đã lan đến các hạch bạch huyết ở cổ hoặc phía sau cổ họng

Giai đoạn IIIB: các khối u vẫn có thể được giới hạn ở vòm mũi họng, nó có thể phát triển thành các mô mềm của khoang mũi hoặc vùng hầu họng, bên trái hoặc bên phải của phần trên của họng Các khối u đã di căn vào hạch bạch huyết cổ lân cận trên cả hai bên

Giai đoạn IVA: khối u đã phát triển trong sọ hoặc dây thần kinh xương sọ, các hầu dưới (phần dưới của cổ họng), mắt, hoặc các mô lân cận của khối u Khối u có thể hoặc không có thể đã lan đến các hạch bạch huyết lân cận ở cổ

Giai đoạn IVB: các khối u có thể hoặc không có thể đã mở rộng sang các mô mềm lân cận hoặc xương, đã lan đến các hạch bạch huyết hoặc đang nằm trong vùng vai trên xương đòn

Giai đoạn IVC biểu thị khối u đã có khả năng xâm lấn mô mềm hoặc xương lân cận Quá trình di căn diễn ra theo hai hướng: khối u có thể lan tới hạch bạch huyết gần đó hoặc di căn xa đến các vị trí ở xa trong cơ thể.

Epigenetics

Định nghĩa

Epigenetics là sự thay đổi di truyền trong biểu hiện gen mà không đi kèm với những thay đổi trình tự DNA và được di truyền ổn định qua nhiều thế hệ [25].

Hiện tượng epigenetics

Hiện tượng epigenetics tham gia vào chu trình điều hòa biểu hiện gen, đặc biệt liên quan đến các gen ức chế khối u [61]

Biến đổi epigenetics bao gồm methyl hóa DNA, biến đổi histone (phosphoryl hóa, acetyl hóa, methyl hóa) và các phân tử RNA nhỏ (như microRNA, RNAi,…) [61]

Đảo CpG

Đảo CpG là vùng giàu dinucleotide CpG (cystosine phosphate guanine) có kích thước khoảng 0,5 - 4,0 kb, bao gồm các cystosine và guanine nằm kề nhau được liên kết với nhau bằng liên kết phosphodiester, phần trăm GC > 50% Đảo CpG thường kéo dài từ vùng đầu 5’ đến exon 1 thuộc thuộc vùng trình tự promoter, ở các tế bào bình thường phần lớn các đảo CpG không bị methyl hóa, chỉ những phân nhóm riêng biệt bắt đầu từ vùng promoter đến vùng exon đầu tiên của gen thì bị methyl hóa [19] [61].

Methyl hóa DNA

Methyl hóa DNA là quá trình gắn gốc methyl (-CH3) vào carbon vị trí số 5 của vòng cytosine (C) đứng trước guanines của đảo dinucleotide CpG (cystosine- phosphate-guanine-CpG) hình thành hình thành 5-methylcytosine (5mc) [54]

Methyl hóa DNA là một hiện tượng biến đổi epigenetics Methyl hóa DNA là một hiện tượng bình thường xảy ra trong quá trình phát triển của tế bào, chúng đóng vai trò quan trọng trong điều hòa biểu hiện gen cho nhiều loại tế bào gồm sự phát

SVTH: Lương Thị Bích Thuận Trang 6 phát triển phôi thai, quá trình phiên mã, cấu trúc NST, bất hoạt NST số X và đánh dấu bộ gen [10] [19] Giống như sửa đổi histone, methyl hóa DNA không ảnh hưởng đến trình tự DNA [54]

Hình 1.4 Quá trình methyl hóa DNA

Quá trình methyl hóa DNA do enzyme DNA methyltransferase (DNMTs) thực hiện, thêm nhóm methyl vào cytosine tại vị trí C5' DNMTs gồm nhóm de novo methyltransferase (DNMT3A và DNMT3B) tạo vị trí methyl hóa mới và nhóm duy trì methyltransferase (DNMT1) giữ vững mô hình methyl hóa DNMT1 có vai trò quan trọng trong quá trình phát triển phôi và biệt hóa tế bào soma.

SVTH: Lương Thị Bích Thuận Trang 7 quá trình sao chép có khả năng hoạt động xuyên suốt pha S trong chu kỳ tế bào nhằm duy trì ổn định sự methyl hóa của các tế bào soma khác nhau DNMT1 có khả năng tăng cường quá trình sinh tổng hợp DNA vì DNMT1 tương tác nhân tố DNA polymerase trong quá trình tăng trưởng tế bào [8][34][44]

Hình 1.5 Cơ chế methyl hóa DNA chuyển hóa 5-cystosine (5C) thành 5 methylcytosine

Methyl hóa DNA trong ung thư

Methyl hóa DNA liên quan đến điều hòa hoạt động gen, bất hoạt nhiễm sắc thể

X và đánh dấu bộ gen Methyl hóa DNA cần thiết cho sự phát triển bình thường và không thể thiếu cho sự tồn tại của những tế bào biệt hóa Tuy nhiên, methyl hóa bất thường là nguyên nhân dẫn đến nhiều bệnh lý bao gồm có ung thư [32]

Sự thay đổi bất thường methyl hóa trong các đảo CpG của vùng promter gồm sự methyl hóa vượt mức (hypermethylation) hay sự giải methyl hóa (hypomethylation) làm mất sự ổn định của di truyền và làm thay đổi biểu hiện gen, gây nên sự im lặng đối với các gen ức chế khối u, kích thích các gen tiền ung thư (oncogene) phát triển [20]

Siêu metyl hóa tại các đảo CpG đặc hiệu trên bộ gen làm tắt gen ức chế khối u, liên quan đến nhiều quá trình điều hòa tế bào như sửa chữa DNA, chu trình tế bào, quá trình apoptosis, tạo điều kiện cho sự phát triển tế bào bất thường.

SVTH: Lương Thị Bích Thuận Trang 8 lọc hậu quả sinh u có mối liên quan đến một số bệnh ung thư Nguyên nhân chủ yếu của hiện tượng methyl hóa vượt mức là do sự hoạt động quá mức của nhóm họ enzyme DNMTs, việc biểu hiện quá mức của nhóm họ enzyme DNMTs ở các tế bào bình thường có thể gây ra các hiện tượng methyl hóa bất thường của DNA quan trọng nhất là sự bất thường này làm gia tăng quá trình methyl hóa DNA [32]

Mất methyl hóa (hypomethylation) góp phần ức chế gen ức chế khối u bằng nhiều cơ chế: gắn kết protein MBD vào đảo CpG cạnh tranh gắn nhóm methyl, gắn chất kìm hãm như 5-glycosylate vào yếu tố phiên mã bất hoạt quá trình phiên mã gen, cạnh tranh bám của yếu tố phiên mã vào vùng khởi động gen ức chế khối u Hypomethylation là dấu hiệu di truyền hình thành khối u, xảy ra tại các vùng trình tự lặp lại, vùng khởi động nghèo dinucleotide CpG, thúc đẩy hình thành NST tiền sắp xếp bộ gen, tổn thương gen và tái hoạt động trình tự endoparasitic, dẫn đến hoạt động bất thường của gen góp phần phát triển ung thư.

Hình 1.6 Mô hình methyl hóa DNA và ung thư [59]

Tổng quan về gen p16 INK4α

Vị trí

Gen p16 INK4α nhiều tên gọi như CDKN2A (Cyclin- Depedent Kinase inhibitor

2A), MST1 (multiple tumor suppressors 1) ở vị trí nhiễm sắc thể số 9p21.3, chiều dài

27550 bases, với trọng lượng phân tử 16.533 Da [62].

Vai trò và chức năng

Gen p16 INK4α là một gen ức chế khối u, đã được ghi nhận đóng vai trò trong việc biệt hóa tế tào, im lặng tế bào và lão hóa tế bào [35], là một trong những gen ức chế khối u mã hóa các protein ngăn cản sự phát triển của tế bào và chuyển từ pha G1 sang pha G0 tạm ngưng hoạt động chu kỳ tế bào [45]

Gen p16 INK4α có chức năng điều hòa âm chu kỳ tế bào (negative-regulation) chủ yếu theo con đường pRb / E2F [61] p16 INK4α điều hòa chu trình tế bào giai đoạn pha G1-S bằng cách ức chế sự gắn kết của phức hợp CDK4/6 và cyclin D1, ức chế phosphoryl hóa pRB dẫn đến ức chế được yếu tố phiên mã E2F nên ngăn cản quá trình tăng trưởng của tế bào [16]

Gen ức chế khối u p16 INK4α đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa phiên mã thông qua sự phosphoryl hóa CTD của RNA polymerase II Bằng cách liên kết với CTD và yếu tố phiên mã TFIIH, p16 INK4α ức chế phosphoryl hóa CTD, ảnh hưởng đến quá trình phiên mã Ngoài ra, p16 INK4α tương tác với JNK1 hoặc JNK3, ngăn chặn phosphoryl hóa c-jun và điều hòa phiên mã thông qua con đường jnks.

P16 INK4α là một gen ức chế chu trình tế bào, khi bất hoạt do sự methyl hóa vùng promoter, nó sẽ làm mất khả năng ức chế CDK4/6 của p16 INK4α Do đó, pRB bị phosphoryl hóa giải phóng yếu tố phiên mã E2F, thúc đẩy chu trình tế bào chuyển sang giai đoạn S, dẫn đến sự tăng sinh tế bào không kiểm soát.

SVTH: Lương Thị Bích Thuận Trang 10 từ pha G1 sang pha S làm tế bào tăng sinh, cộng thêm sự mất đi chức năng sửa sai của p53 dẫn đến sự tăng sinh của tác tế bào hư hỏng, góp phần tạo nên khối u [17][53]

Hình 1.7 Cơ chế hoạt động và mã hóa di truyền của p16 INK4α

Tình hình nghiên cứu sự methyl hóa gen p16 INK4α trong ung thư vòm họng

Sự tạo thành khối u trong ung thư vòm họng là một quá trình nhiều bước và liên quan đến di truyền và sự thay đổi biểu sinh Trong những thập niên này, trên thế giới các nhà nghiên cứu đã tập trung vào việc nghiên cứu các nền tảng phân tử của ung thư và mở rộng ra triển vọng cho sự phát triển nhằm làm các dấu chứng cho việc chẩn đoán sớm và chiến lược điều trị mới Ngày nay có nhiều bằng chứng chứng tỏ rằng sự thay đổi trong phân bố của 5-methylcytosine là một yếu tố quan trọng trong các bước gây ung thư Những thay đổi này bao gồm sự giải methyl hóa (hypomethylation) hay methyl hóa vượt mức (hypermethylation) các vị trí CpG trên vùng 5’-promoter làm mất sự ổn định của di truyền và làm thay đổi biểu hiện gen, gây nên sự im lặng đối với các gen ức chế khối u, kích thích các gen tiền ung thư [22] Yang Shao et a., (2014) [57], Fangyun Tian et al., (2013) [9], S Challouf et al.,

(2012) [5] và nhiều nghiên cứu khác liên quan đến sự methyl hóa vượt mức tại các vị

SVTH: Lương Thị Bích Thuận Trang 11 trí CpG vùng promoter được công bố, sự methyl hóa vượt mức đã được đưa ra là một cách để làm bất hoạt gen ức chế khối u p16 INK4α cũng như các gen khác trong ung thư

Tại Việt Nam, sự methyl hóa của các gen ức chế khối u trong các ung thư khác nhau đã được đưa vào nghiên cứu như công trình nghiên cứu của Trương Kim Phượng và et al., (2015) [36], nhưng chưa có công trình nghiên cứu nào được công bố liên quan đến sự methyl hóa đảo CpG vùng promoter của gen p16 INK4α trong ung thư vòm họng.

Các phương pháp phát hiện methyl hóa

Phương pháp Methylation-Specific PCR (MSP)

Phương pháp MSP giúp đánh giá nhanh tình trạng methyl hóa của hầu hết các vùng CpG thuộc đảo CpG Đầu tiên, DNA được biến đổi bởi sodium bisulfite, chuyển những Cytosine không bị methyl hóa thành Uracil [30]

Phương pháp MSP được thực hiện bằng kỹ thuật PCR nhằm xác định allele methyl hóa và không methyl hóa dựa trên phản ứng PCR với cặp mồi riêng biệt methyl hóa và không methyl hóa Cặp mồi methyl được thiết lập có chứa những đoạn CpG đã được methyl hóa Cặp mồi unmethyl được thiết kế để bắt cặp với đoạn mồi không bị methyl hóa tại vị trí bắt cặp với mồi và do đó có sự thay thể C bằng T trong trình tự mồi Cặp mồi được thiết kế có chứa vùng CpG và chứa ít nhất 3 trình tự CG [15]

Hình 1.9 Quá trình biến đổi Bisulfite

Phương pháp BSP (Bisulfite sequencing PCR)

BSP là phản ứng PCR diễn ra qua hai bước: bước đầu tiên là biến đổi sodium bisulfite DNA, rồi sau đó thực hiện phản ứng PCR khuếch đại trình tự DNA đã được biến đổi bởi các mồi đặc hiệu Sản phẩm PCR có thể được sử dụng theo ba cách sau: (1) giải trình tự sau khi tạo dòng, (2) giải trình tự trực tiếp, (3) kết hợp với các enzyme cắt giới hạn [22]

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Vật liệu

2.1.1 Mẫu mô sinh thiết vòm họng

Thu thập mẫu mô sinh thiết ung thư vòm họng và mẫu dịch phết được giữ trong PBS từ bệnh viện Chợ Rẫy TP.HCM

2.1.2 Dung cụ – thiết bị – hóa chất

Các dụng cụ thông thường trong phòng thí nghiệm sinh học phân tử bao gồm: kẹp lấy mẫu, đèn cồn, eppendorf, pipetteman, đầu típ, ống đong, erlen…

Máy vortex (Vortex ZX3, Velp Ý)

Máy ly tâm lạnh (Hettich Universal 320R, Đức)

Bộ điện di DNA (BioRad)

Cân kỹ thuật (Satorious, Đức)

Tủ hút khí độc (Ascent Max)

Máy quang phổ kế (Scanning UV/VIS, Smart Spec, BioRad)

Máy luân nhiệt (My-Cycler Thermal, BioRad)

Máy chụp ảnh gel (Gel Doc XR System, BioRad)

Hóa chất sử dụng trong quá trình tách chiết DNA gồm:

Dung dịch ly giải tế bào: Lysis buffer: Tris-HCl pH 1M, EDTA 0,5M; 2% SDS 10%; 0.1M NaCl 0,5M (Đó hấp); ddH2O (đó hấp), 100 àg/ml proteinase

Dung loại protein: Phenol/chloroform/isoamylalcohol (25:24:1 v/v/v)

Dung dịch tủa và rửa: NaOAc 3M Ethanol 95%-99% Ethanol 70%

Dung dịch bảo quản DNA: TE buffer: Tris 1M pH 8,0; EDTA 0,5 M

Hóa chất biến đổi bisulfite: Sử dụng bộ kít MethylEdge™ Bisulfite Conversion System N1301 của Promega

Hóa chất dùng để PCR: Mastermix (2X), ddH2O (đã hấp)

Phương pháp tiến hành

2.2.1 Khai thác dữ liệu in silico

Thu thập thông tin, khai thác các dữ liệu từ các bài báo khoa học về ung thư vòm họng và các ung thư khác liên quan đến tần số methyl hóa của gen p16 INK4α thông qua các cơ sở dữ liệu sinh học pubmed- NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) bằng các từ khóa: p16 INK4α , DNA methylation (methyl hóa DNA), epigenetics, nasopharyngeal carcinoma (ung thư vòm họng), lung cancer (ung thư phổi) breast cancer (ung thư vú), cervicial cancer (ung thư cổ tử cung) …

Khảo sát in silico, thống kê các nguồn mẫu được sử dụng, tần số methyl hóa của gen p16 INK4α và phương pháp được sử dụng để phát hiện tần số methyl hóa của gen p16 INK4α

Bảng thống kê tần số methyl hóa của gen p16 INK4α trong ung thư vòm họng và các ung thư khác

Tên tài liệu Tên gen:

Tác giả Năm Tên Phương pháp

Thu thập trình tự vùng promoter gen p16 INK4α từ cơ sở dữ liệu Genecards (www.genecards.org) với mã số S719497 Tiếp theo, phân tích trình tự này bằng chương trình Methprimer để xác định các đảo CpG trong vùng promoter.

(http://medgen.ugent.be/methblast/)

Trong nghiên cứu này, trình tự cặp mồi các bài báo tin cậy được thu thập Các thông số vật lý quan trọng của mồi được phân tích và đánh giá gồm: Tm (nhiệt độ nóng chảy), L (chiều dài), tỷ lệ phần trăm GC Khả năng tạo cấu trúc thứ cấp như self dimer, hairpin loop và hetero dimer cũng được đánh giá bằng chương trình IDT-Intergrated DNA Technologies.

Bảng 2.1 Bảng mồi gen p16 INK4α

Mồi Trình tự (5’3’) Tài liệu tham khảo

Ghi chú: M-p16 INK4α -F (methyl forward): mồi xuôi, M-p16 INK4α -R (methyl reverse): mồi ngược Gạch chân là C thuộc CpG, p16 INK4 -S1_F: mồi xuôi sequence, p16 INK4 - S1_R: mồi ngược sequence

Phương pháp tách chiết phenol/chloroform

Nguyên tắc: Đề tài sử dụng phương pháp phenol/chloroform để tách chiết DNA Trong đó, màng tế bào và màng nhân được biến tính bằng chất tẩy mạnh Sau đó protein sẽ được biến tính bằng phenol/chloroform và bị loại bỏ DNA bộ gen sẽ được tủa với ethanol lạnh

Quy trình tách chiết DNA cho mẫu mô ung thư vòm họng:

Các bước tiến hành Bước 1 Mẫu mô được cắt nhỏ và cho vào một eppendorf (1,5 ml), cho 1000μl dung dịch trữ mẫu, vortex nhẹ và ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút, thu cắn

Bước 2 Thêm 100μl dung dịch đệm PBS, vortex nhẹ và ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút, thu cắn

Bước 3 Tiến hành phỏ vỡ màng tế bào với 700 àl lysis buffer (NaCl, EDTA,

Tris HCl, SDS, Proteinase K và ddH2O), ủ qua đêm ở nhiệt độ 56 o C Bước 4 Mẫu sau khi ủ được đem ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút, thu dịch nổi Loại bỏ protien: Bổ sung 700 àl PCI (phenol:chloroform:isoamyl alcohol tỷ lệ 25:24:1) rồi vortex nhẹ, ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút và thu phần dịch nổi bên trên

[lưu ý bước này có thể lặp lại nhiều lần tùy thuộc vào kết quả biến tính protein]

Bước 5 Bổ sung 1V chloroform, đảo trộn nhẹ và ly tâm 13.000 vòng/phút trong

10 phút thu phần dịch nổi

Bước 6 Tủa DNA: bổ sung 0.1V NH4OAC 5M (hoặc NaOAc 3M) và 1V isopropanol 100%, ủ qua đêm ở nhiệt độ -4 o C Thực hiên ly tâm 13.000 vòng/phút trong 20 phút và loại bỏ phần dịch nổi

Bước 7 Rửa mẫu bằng 1ml Ethanol 70%, ly tâm 13.000 vòng/15 phút, phơi

Bước 8 Bảo quản DNA: bổ sung 50 àl TE 1X và bảo quản ở -20 o C Đánh giá DNA tách chiết bằng Phương pháp đo quang phổ:

Nguyên tắc: hàm lượng DNA có thể xác định được nhờ sự hấp thu mạnh ánh sáng ở bước sóng 260 nm Giá trị mật độ quang OD260 (Optical Density 260 nm) của các mẫu DNA cho phép xác định nồng độ DNA trong dung dịch (với OD260= 1OD 50 μg/ml DNA sợi đôi) Độ tinh sạch của DNA được đánh giá qua tỷ lệ OD260/OD280 nằm trong khoảng giá trị từ 1.8-2.0 Song song đó, chỉ số OD230 cũng được tiến hành đo chung với chỉ số OD260 và OD280 Chỉ số OD230 cho thấy khả năng nhiễm tạp chất của mẫu chẳng hạn bị nhiễm carbohydrate hoặc phenol và tỷ lệ OD260/230 đạt trong khoảng giá trị là từ 2.0-2.2 thí mẫu tách chiết sẽ tinh sạch

Để xác định nồng độ và độ tinh khiết của DNA, thực hiện các bước sau:- Pha loãng 50 lần mẫu DNA đã chiết xuất bằng dung dịch TE.- Đo độ hấp thụ của dung dịch DNA ở các bước sóng 230 nm, 260 nm và 280 nm.- Sử dụng tỷ số OD260/OD280 để đánh giá độ tinh sạch của dung dịch DNA.

2.2.4 Phương pháp biến đổi bisulfite DNA sử dụng bộ kit

Bảng 2.2 Chuẩn bị ME Wash buffer 1X

Cách tiến hành Bước 1 Thêm 24 ml ethanol 100% vào 6ml ME-Wash buffer

Bước 2 Trộn đều hỗn hợp, ở nhiệt độ phòng

1 Chuẩn bị 20 μl DNA tinh sạch Một phản ứng có thể biến đổi từ 100 pg-2 μg; nồng độ tốt nhất là 200-500ng

Chú ý: Nếu thể tích nhỏ hơn 20 μl thì bổ sung thêm bằng nuclease-free water sao cho đủ 20 μl Thể tích lớn hơn thì chia nhỏ ra để đạt 20 μl

2 Chuẩn bị chứng dương: sử dụng DNA methyl hóa và không methyl hóa đã được kiểm chứng từ nguồn tương tự với nguồn mẫu thí nghiệm

Bảng 2.4 Các bước thực hiện biến đổi bisulfite

Các bước tiến hành Bước 1 Cho 130 μl bisulfite ME Conversion Reagent và 20 μl DNA vào ống microcentrifuge 200 μl Spin mẫu

Tiến hành chu trình nhiệt:

60 phút ở 54 o C Ổn định ở nhiệt độ 4 o C Bước 3 Tiến hành ủ tại 4 o C tránh tiếp xúc với ánh sáng trong 20 giờ

Bước 4 Đặt cột ME-spin vào ống thu nhận

Thêm 600μl dd ME Binding Buffer vào cột xoay ME, chuyển mẫu đã biến đổi bisulfite vào cột Đật nắp và đảo trộn, ly tâm 13000vòng/phút trong 30s, sau đó loại bỏ phần dịch và gắn cột xoay ME trở lại ống tube

Bước 6 Sau đú cho cột ME Spin vào lại ống thu nhận Thờm 100àl 1X ME Wash

Buffer, ly tâm (13000 vòng/phút) trong 30s

Bước 7 Thờm 200àl ME Desulfonation Buffer, đúng nắp và ủ ở nhiệt độ phũng trong 15 phút, ly tâm 13000v/phút trong 30s

Bước 8 Đặt cột xoay ME vào tube mới Thêm 10μl ME Elution Buffer, ly tâm 13000vòng/phút trong 30s

Chú ý: Thể tích có thể sử dụng lên đến 20 μl nếu cần thiết Có thể thay thế bằng nuclease-free water hoặc TE buffer (pH>= 6.0)

Bước 9 Cho cột xoay ME vào eppendorf 1.5ml Trữ 4 o C sử dụng trong 1 tuần, nếu lâu hơn thì trữ ở -20 o C và tránh ánh sáng

2.2.5 Kỹ thuật MSP phát hiện sự methyl hóa gen p16 INK4α

Tiến hành đặt phản ứng PCR với hai cặp mồi sau:

Bảng 2.5 Mồi methyl và unmethyl cho gen p16 INK4α

Ký hiệu mồi Trình tự mồi 5’-3’

Chú thích: M-mồi methy, U- mồi unmethyl, in đậm màu đỏ là C thuộc CpG

Phản ứng PCR được tiến hành trong thể tớch 15 àl với mồi p16 INK4α thành phần và chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR được mô tả theo Bảng 2.7, Hình 2.1

Bảng 2.6 Thành phần phản ứng PCR

Thành phần Thể tớch (àl)

Master mix 7,5 p16 INK4α -F primer 0,5 p16 INK4α -R primer 0,5 ddH2O 5,5

Lưu ý: riêng chứng âm thay DNA bằng ddH 2 O

Hình 2.1 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR

2.2.6 Phương pháp điện di trên gel agarose

Nguyên tắc: Các acid nucleic là các đại phân tử tích điện âm, trong điện trường các phân tử DNA sẽ di chuyển về phía cực dương của điện trường Tốc độ di chuyển phụ thuộc vào khối lượng và cấu trúc của phân tử DNA Các acid nucleic trong gel agarose sẽ được ghi lại dưới tia tử ngoại (UV) nhờ ethidium bromide Chất này có khả năng gắn xen vào giữa các bazơ của acid nucleic và phát quang dưới tác dụng của tia tử ngoại (λ = 300 nm) Kích thước của các acid nucleic sẽ được xác định khi so sánh với kích thước đã biết trước của thang chuẩn

2.2.7 Giải trình tự sản phẩm MSP

Các mẫu sau khi được giải trình sự được tiến hành hiệu chỉnh trước khi đưa vào các bước phân tích sau Tất cả các trình tự đều được cắt bỏ phần nhiễu ở hai đầu bằng chương trình Chromas Lite Version 2.1.1

3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

Từ các từ khóa đã nêu, tiến hành khai thác dữ liệu thông tin trong ngân hàng dữ liệu NCBI, nhằm khái quát tổng quan về các nghiên cứu tình hình methyl hóa vùng promoter gen p16 INK4α dẫn đến bất hoạt gen ức chế khối u trong các bệnh nhân ung thư vòm họng và một số ung thư khác Kết quả thu thập được 33 (cập nhập đến năm 2015) công trình nghiên cứu liên quan đến nghiên cứu, cụ thể trong ung thư vòm họng, ung thư vú, ung thư cổ tử cung và ung thư phổi có mối tương quan đến sự methyl hóa gen p16 INK4α

Mức độ methyl hóa gen p16 INK4α trong ung thư vòm họng có sự khác biệt đáng kể tùy thuộc vào phương pháp và loại mẫu nghiên cứu, dẫn đến biến động trong tần suất methyl hóa của gen này giữa các nghiên cứu.

Trong ung thư vòm họng, số liệu thống kê được 10 công trình nghiên cứu với

1466 mẫu được tiến hành đánh giá tần số methyl hóa với các phương pháp và loại mẫu ở các thông số cự thể ở bảng 3.1 như sau:

Bảng 3.1 Bảng tần số methyl hóa gen p16 INK4α

Phương pháp Loại mẫu Số lượng

[18] MSP TBUT Mô sinh thiết 30 33,0%

TBBT Mô và dịch phết

[47] MSP TBUT Mô sinh thiết 19 32%

[50] MSP TBUT Mô sinh thiết 44 65%

[22] MSP TBUT Mô đúc paraffin, mô sinh thiết

TBBT Mô sinh thiết, huyết thanh

[5] MSP TBUT Mô sinh thiết 36 33,3%

[9] MSP, Q-MSP TBUT Mô đúc paraffin

Mẫu nhiễn EBV type cao

Mẫu người lành mang EBV

Ghi chú: TBUT-TBBT: tế bào ung thư–tế bào bình thường, TLTK: tài liệu tham khảo, -: không có tần số methyl hóa

Bảng 3.2 Bảng tần số methyl hóa trung bình có trọng số của gen p16 INK4α trong tế bào ung thư vòm họng và tế bào bình thường

Ghi chú: TBTS-TBUT: Trung bình trọng số tế bào ung thư, TBTS-TBBT: Trung bình trọng số tế bào bình thường

Hình 3.1 Tần số methyl hóa trung bình có trọng số của gen p16 INK4α trong tế bào ung thư vòm họng và tế bào bình thường

Nhận xét: thông qua việc thống kê các tần số trong ung thư vòm họng từ các nghiên cứu trước đây, giúp nhận thấy được sự khác biệt có ý nghĩa giữa tế bào ung thư (TBUT) và tế bào bình thường (TBBT) Tế bào ung thư (TBUT) có tần số trong bình có trọng số (TSTBTS) đạt 41,13% với tần số methyl TBUT dao động từ 22%-66%, có sự khác biệt có ý nghĩa so với tế bào bình thường (TBBT) đạt 1.76% với tần số methyl hóa TBBT từ 2%-2.2%, điều này cho thấy được sự liên quan chặt chẽ giữa sự methyl hóa gen p16 INK4α với ung thư vòm họng

Bảng 3.3 Phương pháp sử dụng trong 10 công trình nghiên cứu

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

Khảo sát in silico

3.3.1 Xác định cấu trúc gen, vị trí gen p16 INK4α :

Gen p16 INK4α hay còn gọi là CDKN2A nằm trên nhiễm sắc thể 9p21, có chiều dài 27550 nu bắt đầu từ nu 21967752 đến nu 21995301, trọng lượng phân tử gen là 16 kDa [1] Trong nghiên cứu này, trình tự gen p16 INK4α có mã truy cập trên ngân hàng gen NCBI là NC_000009 [31].

3.3.2 Khảo sát vị trí và cấu trúc của đảo CpG thuộc vùng promoter gen p16 INK4α

Trình tự vùng promoter gen p16 INK4α được thu nhập trên genecards với mã số S719497 tương ứng với chiều dài 998 bp Sau đó, tiến hành xác định các đảo CpG trên vùng promoter bằng chương trình Methprimer Kết quả được trình bày hình:

Hình 3.4 Hình A: Các đảo CpG được xác định trên promoter gen p16 INK4α

Hình B: vùng promoter mồi methyl bắt cặp và các nhân tố phiên mã

Chú thích: Hình A Vị trí các đảo CpG1, CpG2, CpG3 Hình B các vùng màu đỏ là vị trị các đảo CpG trên promoter, trình tự trong khung: các nhân tố phiên mã, thanh gạch dưới màu đen: vị trí bắt cặp của mồi

Nhìn chung, kết quả khảo sát cho ta thấy 3 đảo CpG trên vùng promoter tương ướng với kích thước 130bp (CpG1) bắt đầu từ vị trí nu 350 kết thúc ở vị trí 479, 142bp (CpG2) vị trí từ 580-721, 192bp (CpG3) vị trí từ 752-943

Mồi tham khảo được thiết kế dựa trên vùng đảo CpG, nhằm mục đích tiến hành đánh giá tình trạng methyl hóa của vị trí CG trong vùng này Với cặp mồi methyl và

SVTH: Lương Thị Bích Thuận Trang 30 không methyl được tham khảo từ công trình nghiên cứu của Tian F et al., (2013), Ayadi W et al., (2008), vị trí bắt của cặp mồi trùng với lại vị trí vùng đảo CpG3, vì thế đảo này được lựa chọn để khảo sát mức độ methyl hóa bất thường của gen p16 INK4α (hình 3.5 và hình 3.6) Ngoài ra, chương trình TFBIND được sử dụng để xác định các vị trí nhân tố phiên mã như E2F, SP1, AP2, P300,… (hình 3.4)

Nhận xét: Kết quả khảo sát từ các phần mềm trực tuyến Methprimer, TFBIND cho thấy trong vùng promoter của gen p16 INK4α có vùng đảo CpG, cùng với một số nhân tố phiên mã cụ thể là: E2F, SP1, AP2, P300, … (hình 3.4), nên vùng đảo CpG này thật sự thích hợp cho việc đánh giá mồi tham khảo cho phương pháp MSP- phương pháp sử dụng các cặp mồi bắt đặc hiệu tại một số vị trí CG từ đó trả lời được vị trí CG khảo sát có bị methyl hóa hay không Các vị trí đảo CpG trong trình tự mồi và bên trong sản phẩm MSP tạo ra giữa hai mồi hoặc các motif nucleotide kế cận các vị trí CpG đều là các ví trí “nóng” (hot spot): chúng chính là các trình tự hoặc mồi hoặc một phần các trình tự nhận biết các nhân tố điều hòa phiên mã quan trọng Những vị trí này dễ dàng bị đột biến hay methyl hóa dẫn đến gen không được phiên mã, không có khả năng biểu hiện chức năng gen ức chế khối u

Mồi xuôi (MF) và mồi ngược (MR) methyl được xác định tại đảo CpG3 bởi phần mềm annhyb, mồi xuôi từ nu 783 đến nu 806, mồi ngược từ nu 912 đến nu 932, khuyếch đại vùng gen có kích thước 150bp, ngoài ra vùng đảo CpG3 được biểu diễn nhiều điểm CG nhất trong 4 vùng (dựa vào Hình 3.4) Do đó, vùng đảo CpG4 được chọn vùng khuyếch đại vùng promoter thuộc gen p16 INK4α

Đánh giá mồi

3.4.1 Kiểm tra thông số vật lý của mồi

Bảng 3.7 Kết quả khảo sát các đặc tính vật lý của mồi trên IDT

Hetero dimer ΔG (kcal/ mol e) MF_M TTATTAGAGGGT

Ghi chú: MF (methyl forward): mồi xuôi, MR (methyl reverse): mồi ngược Gạch chân là C thuộc CpG, U (Unmethylation): không methyl hóa, M (Methylation): methyl hóa

Nghiên cứu các thông số vật lý chỉ ra rằng các cặp mồi methyl và không methyl có chiều dài nằm trong khoảng 21-24 nucleotide, đáp ứng yêu cầu 18-25 nucleotide Các mồi có độ ổn định cao, liên kết nucleotide mạnh với %GC cao, nhưng không tối ưu vì mồi methyl MR có %GC là 66,7%, vượt quá khoảng 50-60% Nhiệt độ Tm dao động trong khoảng 55-65 độ C, các mồi nằm trong khoảng 55-64 độ C và chênh lệch không quá 5 độ C giữa hai cặp mồi Hầu hết các mồi có thông số ΔG lớn hơn -9 kcal/mol Khả năng tạo cấu trúc thứ cấp bao gồm hairpin loop, homodimer và heterodimer.

SVTH: Lương Thị Bích Thuận Trang 32 cặp với nhau) Nếu cấu trúc này càng bền vững thì hiệu quả của phản ứng PCR sẽ càng thấp vì nó sẽ góp phần cản trở khả năng bắt cặp của các mồi vào trình tự DNA đích Để xác định độ bền vững của các liên kết trên, người ta dùng một khái niệm là giá trị biến đổi năng lượng tự do ΔG (kcal/mole) Theo hãng IDT, giá trị ΔG lớn hơn âm 9 kcal/mole thì sẽ không ảnh hưởng đến phản ứng PCR sử dụng các cặp mồi khuếch đại Vì vậy, kết quả đánh giá mồi được sử dụng trong nghiên cứu này là tối ưu

3.4.2 Kiểm tra độ đặt hiệu của mồi qua chương trình annhyb

Hình 3.5 Vị trí trình tự mồi methyl trên vùng trình tự promoter thuộc gen p16 INK4α

Ghi chú: Vùng màu đỏ là trình tự mồi xuôi, vùng màu xanh là trình tự mồi ngược

Với kết quả Annhyb cho thấy mồi methyl bắt cặp đặc hiệu 100% với trình tự đã được biến đổi bisulfite và không có mismatch Vị trí bắt cặp mồi xuôi từ nu 783 đến nu 806, mồi ngược từ nu 912 đến nu 932, trùng với vị trí đảo CpG vùng promoter trên gen p16 INK4α Kích thước sản phẩm là 150bp trùng với kích thước sản phẩm của các công trình nghiêm cứu Fangyun Tian et al., (2013), Wajdi A et al., (2008)

Hình 3.6 Vị trí trình tự mồi unmethyl trên vùng trình tự promoter thuộc gen p16 INK4α

Ghi chú: Mồi xuôi- màu xanh lá, mồi ngược- màu đỏ Màu hồng là mismatch

Vị trí bắt cặp mồi xuôi từ nu 783 đến nu 806, mồi ngược từ nu 912 đến nu 933 nằm trong vùng promoter thuộc gen p16 INK4α Kích thước sản phẩm là 151bp trùng với kích thước sản phẩm của công trình nghiên cứu Joseph Kwong et al., (2002),

Fangyun Tian et al., (2013) Các vị trí mismatch ở hình chính là các vị trí C bị biến đổi methyl hóa

Kết luận: Việc sử dụng phần mền IDT thực hiện việc đánh giá cặp mồi methyl và unmethyl đều cho kết quả thông số vật lý cơ bản phù hợp với lại các quy định đánh giá mồi Bên cạnh đó, hai cặp mồi còn bắt cặp đặc hiệu với trình từ vùng promoter tại các đảo CpG đã khảo sát tại hình 3.2.1, tạo nên sản phẩm có chiều dài trùng với kích thước sản phẩm của các công trình nghiên cứu trước đó được công bố thông qua phần mên Annhyb Từ những điều trên, cặp mồi phù hợp để thực hiện cho thực nghiệm sắp tới cho bản ứng MSP

Khảo sát thực nghiệm

3.5.1 Kết quả tách chiết DNA

Sau khi chiết xuất DNA từ mẫu mô ung thư vòm họng và dịch phết vòm họng bằng phương pháp phenol/chloroform, các mẫu được đo OD Kết quả thu được như sau:

Bảng 3.8 Bảng nồng độ và chất lượng DNA tách chiết

Chú thích: HSPL là hệ số pha loãng; mẫu T40-T47 là mẫu mô ung thư vòm họng; mẫu L23, L24 là mẫu dịch phết vòm họng

Nhận xét: Giá trị tỉ số OD260/280 đạt giá trị trong khoảng 1,8-2,0 cho thấy độ tinh sạch DNA đạt yêu cầu, nếu giá trị thấp hơn hoặc cao hơn khoảng giá trị trên có nghĩa là sản phẩm đã bị nhiễm protein hoặc RNA Kết quả trên cho thấy, mẫu T40, T41 có giá trị OD260/280 = 1.978, 1.981, DNA được thu hồi tốt, tinh sạch Mẫu T44, L23 có

SVTH: Lương Thị Bích Thuận Trang 35 gia trị OD260/280 = 2.067, 2.048, giá trị này gần bằng với 2 nên cho thấy độ tinh sạch của 2 mẫu này tương đối chấp nhận được Mẫu T47 có giá trị OD260/280 = 1.688 cho thấy mẫu vẫn còn nhiễm protein Còn các mẫu còn lại có giá trị OD260/280 > 2 nhiều cho thấy mẫu tinh sạch này còn nhiễm RNA Đồng thời, chỉ số OD230 cho thấy khả năng nhiễm tạp chất của mẫu chẳng hạn bị nhiễm carbohydrate hoặc phenol và tỷ lệ OD260/230 đạt trong khoảng giá trị là từ 2.0-2.2 thí mẫu tách chiết sẽ tinh sạch [65] Tỷ lệ OD260/230 ở tất cà các mẫu (bảng 3.8) đều có tỷ số thấp hơn rất nhiều so với khoảng từ 2.0-2.2, từ đó nhận thấy sản phẩm tách chiết vẫn còn dư phenol hoặc là carbonhydrate, thao tác thực hiện vẫn chưa tốt

Tuy nhiên, những mẫu tách chiết vẫn được sử dụng để biến đổi bisulfite dù độ tinh sach của một số mẫu không đạt yêu cầu, nhưng trong mẫu tách chiết vẫn có DNA thông qua thông số nồng độ DNA được tính trên bảng 3.8

3.5.2 Kết quả phản ứng MSP trên các mẫu mô ung thư vòm họng

Sau khi tách chiết và biến đổi sodium bisulfite, tiến hành thực hiện MSP để khảo sát mức độ methyl hóa của các mẫu DNA bệnh phẩm với cặp mồi methyl đặc hiệu, khuếch đại cho vùng gen khảo sát Đặt phản ứng PCR với mồi methyl đặc hiệu cho gen p16 INK4α trên 8 mẫu bệnh phẩm ung thư vòm họng và 2 mẫu lành, sản phẩm khuếch đại từ cặp mồi methyl có kích thước mong muốn là 150bp (hình 3.7)

Hình 3.7 Kết quả điện di sản phẩm MSP

Chú thích: L là thang, có kích thước 100bp, mẫu T40, T41, T42, T43, T44, T45, T46, T47, L23, L24 chạy PCR với cặp mồi methyl p16 INK4α , nhiệt độ bắt cặp (Ta) 59 o C, điện di ở 100V-25 phút

Nhận xét: 10 mẫu đặt PCR ghi nhận nhiệt độ bắt cặp cho mồi methyl khá tốt, băng sản phẩm ra đúng với kích thước đã khảo sát in silico đối với mẫu T44, T47 Từ kết quả điện di cho thấy kích thước băng sản phẩm khoảng 150bp gần đúng với kích thước băng sản phẩm từ bài báo tham khảo của Fangyun Tian et al., (2013), Wajdi

A et al., (2008) Những mẫu còn lại T40, T41,T42, T43,T45,T46, L23, L24 không thể hiện sự methyl hóa gen p16 INK4α

Với các mẫu mô sinh thiết được sử dụng trong nghiên cứu ở người bệnh Việt

Kết quả tần số methyl hóa CpG đảo trong mẫu mô sinh thiết của bệnh nhân ung thư vòm họng đạt 25% nằm trong phạm vi dao động 22%-33,3% theo các nghiên cứu công bố trên thế giới Điều này củng cố chẩn đoán ung thư vòm họng dựa trên giải phẫu bệnh và được thực hiện bằng phương pháp MSP.

Trong quá trình thực hiện vì bị giới hạn thời gian nên cặp mồi unmethyl chưa được thực hiện trong khảo sát

Bảng 3.9 Bảng thống kê kết quả phương pháp MSP

Chú thích: (-): mẫu đối chứng âm; + : xuất hiện vạch; -: không xuất hiện vạch

Trong kết quả bước đầu, thực hiện trên 8 mẫu bệnh phẩm và 2 mẫu lành, cho thấy mẫu bệnh phẩm bị methyl hóa 25% (2/8), so với các công trình nghiên cứu công bố trên thế giới với mẫu mô sinh thiết như của Lo K W et al., (1996) là 22%, Hsiao et al., (2003) là 33%, Tan S H et al., (2006) là 32%, , các nghiên cứu được công bố có mẫu mô sinh thiết có tần số dao động từ 22%-33.3% (bảng 3.1, bảng 3.2), cho thấy tần số methyl hóa ở người bệnh trên thế giới và người bệnh Việt Nam không quá chênh lệch, nằm trong khoảng dao động của tần số methyl các nghiên cứu trên thế giới

Từ kết quả điện di sản phẩm MSP, chúng tôi tiến hành đem mẫu T44, T47 đi giải trình tự

Hiện tại kết quả giải trình tự chưa có do điều kiện về thời gian

Ký hiệu mẫu Methyl Ký hiệu mẫu Methyl

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

Kết luận

Sau một thời gian thực hiện đề tài, chúng tôi đã đạt được một số kết quả ban đầu như sau:

Thu thập được tần số methyl hóa gen p16 INK4α trong ung thư vòm họng chiếm đến 41.13% trong tổng số 10 công trình nghiên cứu trên thế giới

Trong các nghiên cứu được công bố, kỹ thuật MSP và mẫu mô sinh thiết được sử dụng phổ biến nhất

Thu thập thông tin, xác định vị trí và mô tả cấu trúc vùng promoter, các đảo CpG thuộc gen p16 INK4α

Sau quá trình đánh giá mồi, cặp mồi methyl và unmethyl cho kích thước sản phẩm 150bp và 151bp tương ứng với kết quả của các công trình nghiên cứu được công bố trên thế giới trong ung thư vòm họng

Kỹ thuật MSP được ứng dụng thành công trong việc phát hiện methyl gen p16 INK4α trong mẫu bệnh Đánh giá tần số methyl hóa gen p16 INK4α trên mẫu mô ở người Việt Nam, tần số methyl hóa các mẫu mô bệnh là 25%.

Đề nghị

Từ kết quả trên, tiến hành PCR giải trình tự để có thể đánh giá tốt hơn về tình trạng methyl hóa p16 INK4α trong ung thư vòm họng ở người Việt Nam

Tiếp tục khảo sát sự methyl hóa của gen p16 INK4α với cỡ mẫu lớn hơn (ước tính là 81 mẫu), nhằm khảo sát tình trạng methyl hóa mẫu ung thư vòm họng ở Việt Nam Tiếp tục tiến hành khảo sát tần số methyl hóa gen p16 INK4α ở nhiều loại mẫu như mẫu dịch phết, mẫu máu, mẫu đúc paraffin ờ bệnh ung thư vòm họng

Tiêu đề	Khảo Sát Thực Nghiệm Sự Methyl Hóa Đảo CpG Trên Vùng Promoter Gen p16INK4α Trong Bệnh Ung Thư Biểu Mô Vòm Họng Ở Người Việt Nam
Tác giả	Lương Thị Bích Thuận
Người hướng dẫn	ThS. Lao Đức Thuận
Trường học	Trường Đại Học Mở Tp.Hcm
Chuyên ngành	Công Nghệ Sinh Học
Thể loại	Báo Cáo Khóa Luận Tốt Nghiệp
Năm xuất bản	2016
Thành phố	Tp. Hồ Chí Minh

Định dạng
Số trang	56
Dung lượng	1,05 MB