ĐÁNH GIÁ TẦN SUẤT METHYL HÓA ĐẢO CpG TRÊN VÙNG PROMOTER GEN P16INK4α TRONG UNG THƯ BIỂU MÔ VÒM HỌNG Ở NGƯỜI VIỆT NAM

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Vật liệu

Hóa chất biến đổi bisulfite: Sử dụng bộ kít MethylEdge™ Bisulfite Conversion System N1301 của Promega. Thu thập thông tin, khai thác các dữ liệu từ các bài báo khoa học về ung thư vòm họng và các ung thư khác liên quan đến tần số methyl hóa của gen p16INK4α thông qua các cơ sở dữ liệu sinh học pubmed- NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) bằng các từ khóa: p16INK4α, DNA methylation (methyl hóa DNA), epigenetics, nasopharyngeal carcinoma (ung thư vòm họng), lung cancer (ung thư phổi) breast cancer (ung thư vú), cervicial cancer (ung thư cổ tử cung) …. Khảo sát in silico, thống kê các nguồn mẫu được sử dụng, tần số methyl hóa của gen p16INK4α và phương pháp được sử dụng để phát hiện tần số methyl hóa của gen p16INK4α.

Thu thập trình tự vùng promoter gen p16INK4α từ genecards (www.genecards.org) với mã số S719497. Trong nghiên cứu này, tiến hành thu thập trình tự cặp mồi các bài báo tin cậy, phân tích và đánh giá các thông số vật lý quan trọng của mồi: Tm (nhiệt độ nóng chảy), L (chiều dài), tỷ lệ phần trăm GC, khả năng tạo cấu trúc thứ cấp: self dimer, hairpin loop và hetero dimer bằng chương trình IDT-Intergrated DNA Technologies (https://sg.idtdna.com/analyzer/Applications/oligoanalyzer). Nguyên tắc: hàm lượng DNA có thể xác định được nhờ sự hấp thu mạnh ánh sáng ở bước sóng 260 nm.

Chỉ số OD230 cho thấy khả năng nhiễm tạp chất của mẫu chẳng hạn bị nhiễm carbohydrate hoặc phenol và tỷ lệ OD260/230 đạt trong khoảng giá trị là từ 2.0-2.2 thí mẫu tách chiết sẽ tinh sạch. Các bước tiến hành: DNA sau khi tách chiết được pha loãng 50 lần bằng TE. 2 Chuẩn bị chứng dương: sử dụng DNA methyl hóa và không methyl hóa đã được kiểm chứng từ nguồn tương tự với nguồn mẫu thí nghiệm.

Thêm 600μl dd ME Binding Buffer vào cột xoay ME, chuyển mẫu đã biến đổi bisulfite vào cột. Nguyên tắc: Các acid nucleic là các đại phân tử tích điện âm, trong điện trường các phân tử DNA sẽ di chuyển về phía cực dương của điện trường. Chất này có khả năng gắn xen vào giữa các bazơ của acid nucleic và phát quang dưới tác dụng của tia tử ngoại (λ = 300 nm).

Các mẫu sau khi được giải trình sự được tiến hành hiệu chỉnh trước khi đưa vào các bước phân tích sau.

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

Nhận xét: thông qua việc thống kê các tần số trong ung thư vòm họng từ các nghiên cứu trước đây, giúp nhận thấy được sự khác biệt có ý nghĩa giữa tế bào ung thư (TBUT) và tế bào bình thường (TBBT). Kỹ thuật dùng để đánh giá mức độ methyl hóa và nguồn mẫu sử dụng là hai nguyên nhân chính dẫn đến tần số methyl hóa khác nhau giữa các nghiên cứu. Để phát triển quy trình thực nghiệm nhằm xác định mức độ methyl hóa, đầu tiên chúng tôi tiến hành thống kê để đánh giá mức độ phổ biến của các kỹ thuật và loại mẫu sử dụng trong các nghiên cứu.

Trong số các bài báo phân tích trong bảng 3.1 có một số bài báo sử dụng cùng lúc nhiều phương pháp khác nhau để so sánh và đánh giá mức độ methyl hóa trên một hoặc nhiều nguồn mẫu khác nhau. Do đó thống kê số liệu trong 10 bài báo có được 25 loại mẫu bệnh cùng với 14 phương pháp được sử dụng, trong đó MSP là phương pháp được sử dụng nhiều nhất với tỉ lệ 72,73% trong các nghiên cứu để phân tích mức độ methyl hóa của gen p16INK4α, các nghiên cứu còn lại sử dụng các kĩ thuật như Real-Time PCR, MTPCR, Q-PCR. Có thể thấy rằng tuy có nhiều kĩ thuật cải biên từ MSP, nhưng MSP vẫn được sử dụng nhiều bởi sự đơn giản, độ nhạy cao và phát hiện nhanh hiện tượng methyl hóa xảy ở các vùng gen khảo sát (bảng 3.2).

Sau khi phân tích các loại mẫu trong 10 công trình nghiên cứu, chúng tôi nhận thấy mẫu mô sinh thiết sử dụng nhiều trong các nghiên cứu chiếm tỉ lệ cao đến 80%. Trong các nghiên cứu đều bắt đầu bằng việc sử dụng mẫu mô sinh thiết hay đúc paraffin bởi chính đặc điểm của loại mẫu này: lấy chính xác ngay tại khối mô ung thư (có số lượng tế bào ung thư rất cao so với tế bào bình thường) để xác định chính xác tình trạng methyl hóa của tế bào có biến đổi bất thường. Bên cạnh đó, với mục tiêu hướng tới khẳng định tính hữu dụng của biomarker trong tiên đoán, theo dõi sự tiến triển khối u, các loại mẫu khác cũng được sử dụng vì chúng được lấy từ bệnh nhân chưa hoặc vừa mới có các dấu hiệu của bệnh.

Từ thống kê trung bình có trọng số trên cho thấy việc sử dụng mẫu mô đúc paraffin cho tần số methyl hóa gen p16INK4α là cao nhất và có sự khác biệt về tần số methyl hóa giữa các mẫu sử dụng. Kết quả tỷ lệ methyl hóa trên gen p16INK4α được khảo sát bởi nhiều phương pháp và trên nhiều loại mẫu khác nhau, chính vì thế mà tỷ lệ methyl hóa trên gen này có sự khác biệt giữa các công trình nghiên cứu. Ghi chú: TBUTVH-TBBTVH: tế bào ung thư vòm họng-tế bào bình thường vòm họng; TBUTV-TBBTV: tế bào ung thư vú-tế bào bình thường vú; TBUTP- TBBTP: tế bào ung thư phổi-tế bào bình thường phổi.

Nhìn chung tần số methyl hóa khá cao (trên 50% tổng số) cho từng loại ung thư, điều này cho thấy tình trạng methyl hóa gen p16INK4α liên quan chặt chẽ với bệnh ung thư nói chung và bốn loại ung thư nói riêng.Vì vậy, mức độ methyl hóa gen p16INK4α là dấu chứng sinh học để tiên lượng và chuẩn đoán sớm ung thư. Nhận xét: Kết quả khảo sát từ các phần mềm trực tuyến Methprimer, TFBIND cho thấy trong vùng promoter của gen p16INK4α có vùng đảo CpG, cùng với một số nhân tố phiên mã cụ thể là: E2F, SP1, AP2, P300, … (hình 3.4), nên vùng đảo CpG này thật sự thích hợp cho việc đánh giá mồi tham khảo cho phương pháp MSP- phương pháp sử dụng các cặp mồi bắt đặc hiệu tại một số vị trí CG từ đó trả lời được vị trí CG khảo sát có bị methyl hóa hay không. Các vị trí đảo CpG trong trình tự mồi và bên trong sản phẩm MSP tạo ra giữa hai mồi hoặc các motif nucleotide kế cận các vị trí CpG đều là các ví trí “nóng” (hot spot): chúng chính là các trình tự hoặc mồi hoặc một phần các trình tự nhận biết các nhân tố điều hòa phiên mã quan trọng.