khảo sát sự tương quan giữa tính chất methyl hóa bất thường trên gen apc với tính chất nhiễm hpv trên bệnh nhân người việt nam

Bên cạnh đó, công bố khoa học của Richard và cộng sự 2010 ghi nhận tính chất methyl hóa vượt mức trên các gen có chức năng đè nén u liên quan đến sự hình thành và diễn tiến các loại ung

TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU

Tổng quan về ung thư

Ung thư là một thuật ngữ chung chỉ một nhóm các bệnh lý có thể ảnh hưởng đến bất kì phần nào của cơ thể Ung thư khởi phát từ sự tăng trưởng không kiểm soát của các tế bào, có thể xâm nhập và di căn đến các vị trí khác của cơ thể thông qua hệ thống mạch máu hay mạch bạch huyết [77]

Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO), ung thư khởi phát từ một tế bào duy nhất trải qua nhiều giai đoạn, thường là từ một sự tổn thương tiền ung thư đến các khối u ác tính Những thay đổi này là kết quả của sự tương tác giữa các yếu tố di truyền của cơ thể với các loại tác nhân bên ngoài như tác nhân vật lý, hóa học, sinh học:

− Tác nhân vật lý: tia cực tím và bức xạ ion hóa [106]

− Tác nhân hóa học: khói thuốc lá, thạch tín, amiang, các thành phần của khói thuốc lá, aflatoxin (chất gây nhiễm bẩn thực phẩm) [106]

− Tác nhân sinh học: nhiễm trùng từ virus, vi khuẩn hay kí sinh trùng [106]

Hình 1.1 Diễn tiến quá trình sinh ung [76]

SVTT: Lâm Thị Thanh Tâm Trang 4

− Ung thư biểu mô (carcinoma): ung thư khởi phát ở da hoặc trong các mô lót hay lớp biểu mô phủ bên trong các cơ quan nội tạng Có một số dạng ung thư biểu mô như sau: ung thư tuyến, ung thư biểu mô tế bào vảy và ung thư biểu mô tế bào chuyển tiếp [97]

− Ung thư mô liên kết (sarcoma): ung thư khởi phát trong các mô liên kết hoặc trong xương, sụn, mỡ, cơ, mạch máu [97]

Bệnh bạch cầu là một loại ung thư bắt đầu từ máu và mô tạo máu như tủy xương, dẫn đến sản sinh quá mức các tế bào máu bất thường tràn vào máu.

− U lympho bào, u tủy (lyphoma, myeloma): ung thư khởi phát từ các tế bào lympho của hệ thống miễn dịch [97]

− Ung thư hệ thống thần kinh trung ương: ung thư khởi phát trong các tế bào não hoặc tủy sống [97]

I.1.4 Ung thư cổ tử cung

Ung thư cổ tử cung là một bệnh ung thư ác tính Hình thành trong lớp lót bên trong cổ tử cung, đường giao nhau của âm đạo và tử cung [35]

Quá trình khởi phát ung thư cổ tử cung bắt đầu trong các tế bào xung quanh cổ tử cung Bao gồm quá trình tạo u trong biểu mô tử cung (Cervical Intraepithelial Neoplasia - CIN), sự tổn thương trong biểu mô của các tế bào hình vảy (Squamous Intraepithelial Lesion - SIL) và sự loạn sản (dysplasia ) [35]

Theo hệ thống phân loại của Tổ chức y tế Thế giới (WHO), mức độ loạn sản và tạo u ở tầng biểu mô cổ tử cung (Cervical Intaepithelial Neoplasia - CIN) được chia thành các cấp độ [106] :

SVTT: Lâm Thị Thanh Tâm Trang 5

− CIN1: sự loạn sản ở mức độ nhẹ

− CIN2: sự loạn sản ở mức độ vừa

− CIN3: sự loạn sản ở mức độ nghiêm trọng

Trong hệ thống phân loại của Bethesda, mức độ tổn thương biểu mô và diễn tiến hình thành ung thư cổ tử cung được chia thành các cấp độ:

− LSIL (Low - grade Squamous Intraepithelial Lesion): sự tổn thương bên trong biểu mô hình thành vảy cấp độ thấp, tương ứng CIN1 [108]

− HSIL (High - grade Squamous Intraepithelial Lesion): sự tổn thương bên trong biểu mô hình vảy cấp độ cao, tương ứng với CIN2, CIN3 [108]

⮚ Các giai đoạn phát triển ung thư cổ tử cung

− Giai đoạn I: ung thư khởi phát tại các tế bào cổ tử cung Dựa vào số lượng tế bào ung thư được tìm thấy, ung thư cổ tử cung gồm các giai đoạn IA, IB [95]

− Giai đoạn II: ung thư đã lan rộng ra ngoài cổ tử cung nhưng chưa xâm lấn vào vùng xương chậu hoặc phần phía dưới của âm đạo [95]

+ Giai đoạn IIA: ung thư đã di cư ra khỏi vùng cổ tử cung đến khoảng 2/3 phía trên của âm đạo [95]

+ Giai đoạn IIB: ung thư đã lan tràn ra ngoài cổ tử cung đến các mô xung quanh nhưng chưa lan đến xương chậu [95]

− Giai đoạn III: ung thư đã lan rộng đến phần dưới của âm đạo và có thể lan rộng đến vùng xương chậu [95]

+ Giai đoạn IIIA: ung thư đã lan rộng đến phần dưới của âm đạo nhưng chưa lan rộng đến phần xương chậu [95]

+ Giai đoạn IIIB: Ung thư đã lan rộng đến xương chậu, khối u đã đủ lớn để ngăn cản các ống niệu quản (ống nối thận đến bàng quang) [95]

SVTT: Lâm Thị Thanh Tâm Trang 6

− Giai đoạn IV: ung thư đã lan rộng ra ngoài vùng xương chậu, có thể tìm thấy tế bào ung thư trong niêm mạc bàng quang, trực tràng hoặc đã lan rộng đến các bộ phận khác của cơ thể [95]

+ Giai đoạn IVA: các tế bào ung thư di căn đến vùng mô, cơ quan lân cận: bàng quang hoặc trực tràng [95]

+ Giai đoạn IVB: các tế bào ung thư di căn đến vùng mô, cơ quan khác ở xa trên cơ thể: gan, ruột, phổi hoặc xương [95]

I.1.5 Tình hình ung thư cổ tử cung ở trên thế giới

Theo số liệu thống kê của Globocan (2012), ung thư cổ tử cung là loại ung thư phổ biến thứ tư trên Thế giới Năm 2012, có khoảng 528.000 trường hợp mới, 266.000 trường hợp tử vong, chiếm 7,5% số ca tử vong do ung thư ở phụ nữ Ở các vùng chưa phát triển, số trường hợp tử vong do ung thư xấp xỉ khoảng 87,0% Ung thư cổ tử cung là bệnh ung thư xảy ra phổ biến nhất ở phụ nữ thuộc khu vực Đông Phi và Trung Phi [105]

Hình 1.2 Tỷ lệ phụ nữ mắc bệnh ung thư cổ tử cung trên thế giới

SVTT: Lâm Thị Thanh Tâm Trang 7

I.1.6 Tình hình ung thư cổ tử cung ở Việt Nam

Theo Globocan 2012, ung thư cổ tử cung thuộc nhóm ung thư thường gặp ở phụ nữ Việt Nam, trong nhóm bệnh lý này còn có ung thư vú, ung thư phổi, ung thư gan và ung thư dạ dày Có khoảng 5.146 trường hợp mắc bệnh ung thư cổ cung (9,4%) Số trường hợp tử vong là 2.864 (2,4%) [105]

Hình 1.3 Tỷ lệ số trường hợp tử vong do ung thư cổ tử cung ở phụ nữ trên thế giới (Globocan, 2012) [104]

Hình 1.4 Tỷ lệ phụ nữ mắc bệnh ung thư cổ tử cung ở Việt Nam

SVTT: Lâm Thị Thanh Tâm Trang 8

Human papillomavirus (HPV) là virus gây u nhú ở người, thuộc nhóm tác nhân gây bệnh lây truyền qua đường tình dục ở cả nam giới và nữ giới trên Thế giới [18]

Dựa vào sự tương quan giữa kiểu gen HPV với sự xâm nhiễm, gây tổn thương cổ tử cung và cơ chế sinh ung, HPV có thể được chia thành các nhóm như sau:

− Nhóm HPV type nguy cơ thấp (Low - risk type): 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61,

− Nhóm HPV type nguy cơ cao (High - risk type): 16, 18, 31, 33, 34, 35, 39, 45,

51, 52, 56, 58, 59, 68, và 73 [8] Theo báo cáo khoa học của Hausen và cộng sự (1966), nhóm HPV type nguy cơ cao có khả năng gây ra sự tăng sinh mất kiểm soát dẫn đến hình thành các khối u ác tính ngay khi hiện diện với một lượng (nồng độ) thấp trong cơ thể ký chủ [38]

− Nhóm HPV type chưa xác định nguy cơ (Unknown - risk type): 2a, 3, 7, 10,

Hình 1.5 Tỷ lệ số trường hợp tử vong do ung thư cổ tử cung của phụ nữ ở Việt Nam (Globocan, 2012) [100]

SVTT: Lâm Thị Thanh Tâm Trang 9

⮚ Cơ chế gây ung thư của HPV

Trong cơ chế xâm nhiễm, HPV type nguy cơ thấp thường ở thể episome, DNA bộ gen của HPV tồn tại độc lập với bộ gen tế bào ký chủ Thông thường, trong thể episome, gen E2 của HPV luôn được biểu hiện sớm trong cơ chế xâm nhiễm, đây là gen có chức năng kìm hãm sự hoạt động của các “oncogene”: E6, E7 [18]

Virus HPV nguy cơ cao có đặc tính là khả năng gắn chèn vào bộ gen tế bào vật chủ Điểm khác biệt của chủng virus này là tốc độ tái bản nhanh hơn khoảng 40% so với các chủng khác Sự gắn chèn này khiến gen E2 bất hoạt, dẫn đến giải phóng hai "oncogene" là E6 và E7 ngoài tầm kiểm soát Hai "oncogene" này biểu hiện thành "oncoprotein" E6 và E7, gây ra những thay đổi trong tế bào vật chủ và có thể dẫn đến ung thư.

Epigenetics

Epigenetics là những thay đổi di truyền trong biểu hiện gen không liên quan đến những thay đổi trong trình tự DNA Epigenetics có vai trò điều hòa sự phân bào, sự phát triển bình thường và duy trì sự biểu hiện của gen ở tế bào động vật có vú [28]

Các cơ chế thuộc epigenetics gồm có: sự methyl hóa DNA, sự biến đổi histone, sự biến đổi cấu trúc nucleosome và microRNA (miRNA) Những cơ chế này kiểm soát sự biểu hiện gen trong tế bào lành [6] Tính chất bất thường của epigenetics (DNA hypermethylation, DNA hypomethylation, ) có thể làm thay đổi sự biểu hiện gen và dẫn đến sự biến đổi tế bào lành thành tế bào ác tính, khởi phát quá trình sinh ung [72,28]

Sự methyl hóa DNA là một cơ chế biến đổi biểu sinh, đóng vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh hoạt động của gen trong tế bào nhân chuẩn Trong tế bào bình thường, sự methyl hóa DNA được phân bố trên toàn bộ hệ gen và có vai trò trong việc duy trì tính toàn vẹn của bộ gen, kiểm soát sự biểu hiện gen và ngăn ngừa sự chuyển đổi tế bào thành tế bào ung thư.

Hình 1.6 Cơ chế hoạt động của oncoprotein E6 và E7 [18]

SVTT: Lâm Thị Thanh Tâm Trang 11 hóa DNA có vai trò kiểm soát quá trình phát triển phôi, tăng sinh và phân bào, in dấu gen, bất hoạt nhiễm sắc thể X, ức chế các yếu tố lặp lại và các yếu tố chuyển vị [68,70]

Sự methyl hóa này có vai trò kiểm soát quá trình sao chép, sửa chữa DNA [60,84]

DNA methyltransferases (DNMTs) facilitate DNA methylation by transferring the CH3 group from S-adenosyl-methionine to cytosine at the C5 position, creating 5-methylcytosine (5mC) This methylation primarily occurs within CpG dinucleotide pairs, influencing gene expression patterns.

Trong tế bào động vật có vú, methyl hóa DNA được thực hiện bởi họ enzyme DNA methyltransferases (DNMTs): DNMT1, DNMT2, DNMT3a, DNMT3b [60,8] DNMT3a và DNMT3b có chức năng như de novo methyltransferases DNMT2 có chức năng methyl hóa trình tự DNA tương đồng với vật liệu di truyền của Retrovirus [60]

Sự rối loạn chức năng của các enzym DNMTs dẫn đến sự methyl hóa DNA bất thường: sự methyl hóa vượt mức (hypermethylation) hoặc giải methyl hóa (hypomethylation) DNA [54] Sự giải methyl hóa xuất phát từ sự loại bỏ các nhóm methyl trên các phân tử cytosine, dẫn đến sự mất ổn định gen và kích hoạt các gen tiền sinh ung (oncogene) Sự methyl hóa vượt mức thường xảy ra ở vùng promoter của gen ức chế khối u (tumour suppressor gene), dẫn đến “sự im lặng” của các gen này [47]

Hình 1.7 Phản ứng methyl hóa DNA [54]

SVTT: Lâm Thị Thanh Tâm Trang 12

❖ Đảo CpG Đảo CpG là các đoạn trình tự DNA giàu CpG, có kích thước khoảng 200-1000 nucleotide [13,57] Trong bộ gen người, có khoảng 60-70% đảo CpG tập trung trên vùng promoter [10,25]

Các cặp CpG có thể thuộc vào trình tự nhận biết của các yếu tố phiên mã (hot-spot) kiểm soát sự biểu hiện gen [60] Baylin và cộng sự (2001) cho thấy sự methyl hóa ở đảo CpG giữ vai trò kích hoạt/kìm hãm sự hoạt động của các gen đè nén u.

Tổng quan về gen APC

I.3.1 Vị trí, cấu trúc và chức năng của gen APC

Gen APC (Adenomatous polyposis coli) định vị ở nucleotide 112.707.505 đến 112.846.239 trên trên nhiễm sắc thể số 5 (5q21.22) Gen APC có kích thước là 138.734 bp [99]

Gen APC mã hóa protein ức chế khối u có kích thước 312 kDa Protein APC tương tác với protein β-catenin [2,53] tham gia kiểm soát đường truyền tín hiệu Wnt, kiểm soát sự tăng sinh tế bào, sự phân bào và biệt hóa một số loại tế bào: ruột [60,7] , biểu bì [34] , xương [81]

Theo công bố khoa học của Aoki và cộng sự (2007), gen APC liên quan đến bệnh u tuyến polyposis có tính gia đình (FAP)

Hình 1.8 Vị trí gen APC (Genecard)

β-catenin đóng vai trò kép, liên kết với thụ thể màng frizzled và đồng thụ thể LRP-5/6 để kích hoạt con đường tín hiệu Wnt, thúc đẩy phiên mã các gen mục tiêu Ngược lại, β-catenin cũng tạo phức hợp với Axin, APC, CK1 và GSK3, dẫn đến phosphoryl hóa và thoái biến β-catenin, ngăn chặn tương tác với TCF/LEF và ức chế phiên mã các gen liên quan.

Hình 1.9 Con đường tín hiệu Wnt [53]

SVTT: Lâm Thị Thanh Tâm Trang 14

I.3.2 Các công trình nghiên cứu khoa học về tính chất methyl hóa gen APC

Trong công trình nghiên cứu của Tsuchiya và các cộng sự (2000), xác định tần suất methyl hóa của gen APC trong ung thư dạ dày là 82,5% Tần suất methyl hóa trên vùng promoter của gen APC trong mẫu máu và mẫu mô sinh thiết ung thư trực tràng là 18% được ghi nhận trong công trình nghiên cứu của Esteller và các cộng sự (2000)

Công trình nghiên cứu của Yang và các cộng sự (2005) ghi nhận tần suất methyl hóa của gen APC là 48% (15/31) trong các mẫu khối u của bệnh bạch cầu tế bào

Nghiên cứu của Alivand và cộng sự (2011) đã xác định tần suất methyl hóa gen APC trong các mẫu mô khối u ung thư dạ dày là 77,8%.

Hiện nay, có rất ít công bố khoa học về tính chất methyl hóa vùng promoter gen APC trên bộ mẫu ung thư cổ tử cung, bộ mẫu nhiễm HPV trên người bệnh Việt Nam Công bố khoa học của Phuong và các cộng sự (2016) ghi nhận tần suất methyl hóa vượt mức của gen APC trong các mẫu dịch phết tế bào có tính chất nhiễm HPV type nguy cơ cao, HPV type nguy cơ thấp và HPV type không nguy cơ lần lượt là 75%, 12,5% và 30%

Các phương pháp phân tích sự methyl hóa

Phương pháp methylation-specific PCR (MSP) mô tả lần đầu tiên bởi Herman và cộng sự (1996) Phương pháp MSP sử dụng cặp mồi đặc hiệu trạng thái allele methyl hóa và trạng thái allele không methyl hóa

SVTT: Lâm Thị Thanh Tâm Trang 15

Trước khi thực hiện phản ứng MSP, trình tự DNA bộ gen được biến đổi sodium bisulfite trước Sau quá trình biến đổi bisulfite, các cytosine (C) không bị methyl hóa biến đổi thành uracil (U) nhưng các cytosines bị methyl hóa (mC) không bị biến đổi [22]

Sau đó, trình tự DNA bộ gen đã biến đổi bisulfite đưa vào phản ứng MSP, gồm hai phản ứng PCR riêng biệt với một cặp mồi đặc hiệu allele methyl hóa (cặp mồi methyl hóa) và một cặp mồi đặc hiệu allele không methyl hóa (cặp mồi không methyl hóa) Trình tự các mồi hiện diện ít nhất một vị trí CpG [20]

Hình 1.10 Cơ chế biến đổi DNA bằng sodium bisulfite [23]

Hình 1.11 Mô tả phương pháp MSP [103]

SVTT: Lâm Thị Thanh Tâm Trang 16

Phương pháp Bisulfite sequencing PCR (BSP) là phương pháp kết hợp giữa PCR và giải trình tự Tương tự phương pháp MSP, trình tự DNA bộ gen được biến đổi bisulfite Sau đó, sản phẩm DNA biến đổi bằng bisulfite được đưa vào phản ứng PCR với một cặp mồi đặc hiệu với vùng trình tự mục tiêu, bao quanh các vị trí CpG cần được khảo sát (trình tự mồi xuôi và mồi ngược không chứa các vị trí CpG) để khuếch đại allele methyl hóa và allele không methyl hóa [37,94]

Phương pháp Nested-MSP là phương pháp MSP cải tiến nhằm khắc phục được những hạn chế của phương pháp MSP Phương pháp này cho phép phân tích một số mẫu có đặc điểm: số lượng tế bào ít hoặc chất lượng DNA thấp (lẫn tạp nhiễm) [56]

Phương pháp Nested-MSP trải qua hai giai đoạn kế tiếp nhau Giai đoạn 1 thực hiện phản ứng PCR đầu tiên, cặp mồi khuếch đại một vùng trình tự DNA mục tiêu trên DNA bộ gen đã được biến đổi bisulfite Vùng trình tự DNA mục tiêu bao quanh các vị trí CpG (vị trí hot spot) [8,29,24] Giai đoạn 2 thực hiện 2 phản ứng PCR riêng biệt lần lượt với một cặp mồi đặc hiệu alelle methyl hóa và một cặp mồi đặc hiệu alelle không bị methyl hóa [24]

Hình 1.12 Minh họa phương pháp Nested-MSP [24]

SVTT: Lâm Thị Thanh Tâm Trang 17

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Vật liệu

Chúng tôi thu thập bệnh phẩm là dịch phết tế bào tử cung đi kèm thông tin lâm sàng về tình trạng nhiễm HPV nguy cơ cao, HPV nguy cơ thấp hoặc không nhiễm HPV Các mẫu bệnh phẩm này được cung cấp bởi Phòng khám Âu Lạc (Công ty cổ phần Công nghệ Việt Á) và Công ty cổ phần Dịch vụ Phân tích Di truyền.

II.1.1 Các công cụ tin sinh học

− http://sg.idtdna.com/calc/analyzer

− http://www.urogene.org/methprimer/

− http://ghr.nlm.nih.gov/

− http://gpminer.mbc.nctu.edu.tw/

II.1.3 Xử lý số liệu

− Phần mềm Excel, MedCalc (version 16.4.3)

Phương pháp

II.2.1 Khai thác dữ liệu

Dựa trên số liệu từ NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), các nghiên cứu khoa học liên quan đến sự xác định tính chất methyl hóa bất thường (vượt mức) trên vùng promoter của gen APC ở bệnh nhân ung thư đã được tìm kiếm và thu thập.

Ung thư cổ tử cung là căn bệnh phổ biến ở Việt Nam và trên thế giới Nghiên cứu về tình trạng methyl hóa gen trong ung thư cổ tử cung giúp hiểu rõ hơn về cơ chế sinh bệnh và phát triển của bệnh Các gen APC đóng vai trò quan trọng trong quá trình này Từ khóa "methylation", "cervical cancer" và "APC" là những khái niệm then chốt giúp tìm hiểu sâu hơn về căn bệnh này, hỗ trợ chẩn đoán và điều trị hiệu quả.

Từ đó, chúng tôi ứng dụng công cụ MedCalc  nhằmphân tích các nội dung:

− Xác định tần số methyl hóa bất thường của gen APC trên bộ mẫu UTCTC trên Thế giới

− Khai thác dữ liệu về phương pháp nghiên cứu, các loại mẫu bệnh phẩm được sử dụng trong những công trình nghiên cứu về tính chất methyl hóa bất thường của gen APC trên bộ mẫu UTCTC

II.2.2 Khảo sát in silico gen APC

II.2.2.1 Thu thập trình tự gen, xác định cấu trúc gen APC

Chúng tôi thu thập trình tự nucleotide của gen APC, từ ngân hàng gen NCBI Bên cạnh đó chúng tôi cũng thu thập các cặp mồi đặc hiệu allele methyl hóa và allele không methyl hóa trên gen mục tiêu dựa vào các công trình nghiên cứu khoa học liên quan

II.2.2.2 Xác định vị trí đảo CpG, các nhân tố phiên mã

Dựa trên phần mềm trực tuyến http://www.urogene.org/methprimer/ chúng tôi xác định được vị trí của đảo CpG và thu được trình tự vùng promoter sau khi biến đổi để tiến hành khảo sát vị trí bắt cặp của hai cặp mồi methyl hóa và không methyl hóa

Sử dụng phần mềm trực tuyến http://gpminer.mbc.nctu.edu.tw/, chúng tôi đã xác định được vị trí của các nhân tố phiên mã trên trình tự đảo CpG thuộc vùng promoter gen APC.

SVTT: Lâm Thị Thanh Tâm Trang 19

II.2.2.3 Đánh giá thông số vật lý các cặp mồi methyl hóa và không methyl hóa

Dựa trên công cụ trực tuyến Oligoanalyzer 3.1 (http://sg.idtdna.com/calc/analyzer) chúng tôi xác định các thông số của mồi như: chiều dài, %GC, nhiệt độ nóng chảy, cấu trúc thứ cấp (self dimer, hetero dimer, hairpin-loop)

II.2.3 Xử lý số liệu

Chúng tôi sử dụng phần mềm Excel, MedCalc  (version 16.4.3) nhằm tổng hợp số liệu, phân tích tần số methyl hóa vượt mức trên gen APC liên quan đến một số bệnh ung thư, tập trung trên bệnh ung thư cổ tử cung và tính chất nhiễm HPV trong nội dung khai thác dữ liệu và phân tích kết quả thực nghiệm Đồng thời, chúng tôi khảo sát dữ liệu về các phương pháp sinh học phân tử và các loại mẫu bệnh phẩm sử dụng trong những nghiên cứu thực nghiệm thuộc cùng hướng nghiên cứu Số liệu thống kê theo kiểm định Chi bình phương (p