Khảo sát sự liên quan giữa tình trạng methyl hóa bất thường của gen APC và nhiễm HPV ở bệnh nhân Việt Nam

Vật liệu

• Khảo sát in silico gen APC
• Khảo sát thực nghiệm 1. Tách chiết DNA

− Khai thác dữ liệu về phương pháp nghiên cứu, các loại mẫu bệnh phẩm được sử dụng trong những công trình nghiên cứu về tính chất methyl hóa bất thường của gen APC trên bộ mẫu UTCTC. Dựa trên phần mềm trực tuyến http://www.urogene.org/methprimer/ chúng tôi xác định được vị trí của đảo CpG và thu được trình tự vùng promoter sau khi biến đổi để tiến hành khảo sát vị trí bắt cặp của hai cặp mồi methyl hóa và không methyl hóa. Dựa trên công cụ trực tuyến Oligoanalyzer 3.1 (http://sg.idtdna.com/calc/analyzer) chúng tôi xác định các thông số của mồi như: chiều dài, %GC, nhiệt độ nóng chảy, cấu trúc thứ cấp (self dimer, hetero dimer, hairpin-loop).

Chúng tôi sử dụng phần mềm Excel, MedCalc (version 16.4.3) nhằm tổng hợp số liệu, phân tích tần số methyl hóa vượt mức trên gen APC liên quan đến một số bệnh ung thư, tập trung trên bệnh ung thư cổ tử cung và tính chất nhiễm HPV trong nội dung khai thác dữ liệu và phân tích kết quả thực nghiệm. Các mẫu DNA bộ gen được xử lý với hỗn hợp biến đổi sodium bisulfite để chuyển cytosine thành uracil (ngoại trừ các 5mC) sẽ được cố định trên màng của cột, sau đó rửa sạch muối và DNA được thu hồi lại. Sau khi thực hiện quá trình biến đổi DNA bằng sodium bisulfite, chúng tôi tiến hành thực hiện phản ứng MSP, Nested-MSP trên DNA bộ gen của các mẫu bệnh phẩm có tính chất nhiễm/hoặc không nhiễm HPV với cặp mồi đặc hiệu allele methyl hóa (MF, MR) và cặp mồi đặc hiệu allele không methyl hóa (UF, UR) trên vùng promoter gen APC.

Khai thác dữ liệu và khảo sát in silico gen APC 1. Kết quả khai thác dữ liệu

SVTT: Lâm Thị Thanh Tâm Trang 28 Chúng tôi thu thập được 9 bài báo khoa học đề cập đến chức năng gen APC trong chu trình tế bào và quá trình hình thành, diễn tiến ung thư. Song song, chúng tôi tìm hiểu về tần số methyl hóa gen APC trong ung thư cổ tử cung và các ung thư khác và các phương pháp sinh học phân tử, loại mẫu được sử dụng trong 27 công trình nghiên cứu thực nghiệm khảo sát tần suất methyl hóa ở đảo CpG trên vùng promoter của gen APC (số liệu cập nhật đến tháng 3 năm 2016). Tuy nhiên, mặt hạn chế của chúng tôi là chưa thu thập được nhiều công bố khoa học xác định tần số methyl gen APC trong bộ mẫu nhiễm HPV hoặc không nhiễm HPV.

Dựa trên các công trình nghiên cứu từ năm 2000 đến năm 2016, chúng tôi ghi nhận tính chất methyl hóa của gen APC trong UTCTC và một số loại ung thư khác (ung thư vú, bàng quang, đại trực tràng, phổi, dạ dày và ung thư buồng trứng), kết quả được trình bày ở Bảng 3.2. SVTT: Lâm Thị Thanh Tâm Trang 30 Chú thích: BC (Breast cancer): ung thư vú, BDC (Bladder cancer) : ung thư bàng quang, CC (Cervical cancer): UTCTC, COLC (Colorectal cancer): ung thư đại trực tràng, GC (Gastric cancer): ung thư dạ dày, LC (Lung cancer): ung thư phổi, OVC (Ovarian cancer): ung thư buồng trứng. SVTT: Lâm Thị Thanh Tâm Trang 31 Chú thích: Others: các phương pháp khác như MethylLight, Methylation-specific reverses transcriptase, Reverse transcription-PCR.

SVTT: Lâm Thị Thanh Tâm Trang 32 Chú thích: BC (Breast cancer): ung thư vú, BDC (Bladder cancer): ung thư bàng quang, CC (Cervical cancer): UTCTC, COLC (Colorectal cancer): ung thư đại trực tràng, GC (Gastric cancer): ung thư dạ dày, LC (Lung cancer): ung thư phổi, OVC (Ovarian cancer): ung thư buồng trứng. Tần suất methyl hóa trên vùng promoter của gen APC xuất hiện trong các loại ung thư khác nhau dao động trong khoảng 22,8- 82,2%, điển hình đối với ung thư cổ tử cung có tính chất methyl hóa vượt mức với tần số xấp xỉ 35,9% (Phụ lục 3). Chúng tôi cũng ghi nhận tần suất methyl hóa trung bình trọng số trên vùng promoter của gen APC vào khoảng 26,4-79,7% ở các loại ung thư: ung thư vú, cổ tử cung, bàng quang, đại trực tràng, phổi, dạ dày và ung thư buồng trứng.

Đáng chú ý là mẫu mô sinh thiết thường được sử dụng nhiều hơn trong các công trình nghiên cứu xác định tính chất methyl hóa trên gen APC, chiếm tỷ lệ 77,9% (21trong 27 công trình nghiên cứu). Trong đó, phương pháp MSP được sử dụng nhiều nhất 74,1% (20 trong 27 công trình nghiên cứu) để phân tích tình trạng methyl hóa DNA trong các mẫu bệnh phẩm ung thư. Với mục tiêu nghiên cứu nhằm hướng đến tìm hiểu tính chất methyl hóa trên gen APC đối với ung thư cổ tử cung, cụ thể là trên các bệnh phẩm ở các giai đoạn diễn tiến của ung thư cổ tử cung dựa vào các phương pháp phân tích khác nhau, chúng tôi ghi nhận được kết quả trình bày ở Bảng 3.3.

HSIL - High-grade Squamous Intraepithelial Lesions (tổn thương bên trong biểu mô vảy ở mức độ cao); SCC - Squamous cell carcinoma (ung thư tế bào biểu mô vảy); AC - Adenoma carcinoma (ung thư tế bào tuyến); (a) Mô đúc - paraffin embedded tissue;.

SCC 15.5%

• Thu thập trình tự gen
• Đánh giá các thông số vật lý của mồi Nested-MSP

Nhằm mục tiêu thiết lập quy trình phân tích tính chất methyl hóa trên vùng gen APC, Chúng tôi ghi nhận thêm các công trình nghiên cứu của Dong và cộng sự (2001), Wisman và cộng sự (2006) cũng ứng dụng phương pháp MSP trong nghiên cứu tính chất methyl hóa trên vùng gen APC của bệnh ung thư cổ tử cung. Dựa vào công bố khoa học của House và cộng sự (2003), chúng tôi kế thừa cặp mồi ngoài của phản ứng Nested-MSP, cặp mồi đặc hiệu trên vùng promoter gen APC, bao quanh các vị trí “hot-spot”. SVTT: Lâm Thị Thanh Tâm Trang 38 cung nói riêng được thu thập và thống kê trên nhiều công trình nghiên cứu khoa học trên thế giới, sau khi thống kê chúng tôi dựa trên công trình nghiên cứu của Virmani và cộng sự (2001) ghi nhận được cặp mồi methyl hóa và không methyl hóa.

− Tỷ lệ thành phần các nucleotide A, T, G, C trong trình tự mồi là thông số quan trọng cần phải chú ý khi thiết kế mồi vì ảnh hưởng rất lớn đến phản ứng PCR, nó ảnh hưởng đến nhiệt độ nóng chảy, nhiệt độ bắt cặp của DNA. Điều này cho thấy các thông số của cặp mồi APC-MR và APC-MF, APC-UR và APC-UF hoàn toàn phù hợp với mục tiêu thiết kế cho phản ứng MSP và phù hợp với nội dung nghiên cứu thực nghiệm. SVTT: Lâm Thị Thanh Tâm Trang 43 Chú thích: Màu vàng: vị trí mồi xuôi unmethyl bắt cặp phù hợp với trình tự đích, màu xanh: vị trí mồi ngược unmethyl bắt cặp phù hợp với trình tự đích, màu hồng: vị trí những nucleotide không bắt cặp phù hợp với trình tự đích.

Chúng tôi tiến hành tách chiết DNA từ các bộ mẫu bệnh phẩm dịch phết tế bào (kèm theo các chỉ tiêu lâm sàng) có tính chất nhiễm HPV type nguy cơ cao/nguy cơ thấp hoặc không nhiễm HPV. Bởi vì, chúng tôi không có nguồn DNA chứng, nên chúng tôi sử dụng DNA bộ gen của các mẫu bệnh phẩm này, đây là các mẫu bệnh phẩm đã được xác định tính chất methyl hóa trên gen APC bằng phương pháp MSP với cặp mồi APC-MF, APC-MR và cặp APC-UF, APC-UR (trình ở Bảng 3.8). Với các kết quả nêu trên, chúng tôi ghi nhận bước đầu thành công trong việc thiết lập quy trình Nested-MSP với các cặp mồi APC-Nested F, APC-Nested R; APC-MF, APC-MR và APC-UF, APC-UR trên DNA bộ gen các bộ mẫu có tính chất nhiễm HPV type nguy cơ cao và HPV type nguy cơ thấp.

Dựa vào kết quả phản ứng Nested-MSP trên một số mẫu DNA bộ gen của các mẫu bệnh phẩm HA1, HA2, HA3,…, HA21, HA22, chúng tôi xác định sự tương quan giữa tính chất methyl hóa và tính chất nhiễm HPV/không nhiễm HPV/nhiễm HPV type nguy cơ cao/type nguy cơ thấp. Tuy nhiên, kết quả khảo sát này đã phần nào phản ánh sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về tính chất methyl hóa vượt mức trên gen APC trong bộ mẫu nhiễm HPV type nguy cơ cao, mẫu nhiễm HPV type nguy cơ thấp và mẫu không nhiễm HPV, với p=0,04. Đồng thời, chúng tôi ghi nhận một số dữ kiện phản ánh giữa tính chất methyl hóa vượt mức trên gen APC và tính chất nhiễm HPV (HPV type nguy cơ cao, HPV type nguy cơ thấp và không nhiễm HPV), thông qua chỉ số OR và RR (Bảng 3.10.).

Dựa vào các kết quả nêu trên và tham khảo công bố của Bosch và cộng sự (2002) nêu trên từ đó chúng tôi ghi nhận sự tương quan mạnh giữa tính chất methyl hóa vượt mức trên gen APC và tính chất nhiễm HPV type nguy cơ cao, cho thấy tính chất methyl hóa vượt mức trên gen APC là dấu hiệu đặc trưng cho bệnh ung thư cổ tử cung.