khảo sát tính chất methyl hóa bất thường và đột biến điểm trên một số gen liên quan đến bệnh ung thư vú

Trương Kim Phượng Học viên thực hiện: Nguyễn Thị Lệ Lớp: DH16YD01 Tên đề tài: Khảo sát tính chất methyl hóa bất thường và đột biến điểm trên một số gen liên quan đến bệnh ung thư vúÝ kiế

TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU

Khái quát

1.1.1 Tình hình bệnh ung thư vú

Theo báo cáo của WHO, ung thư là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên thế giới Theo thống kê của Globocan năm 2018, số ca ung thư mắc mới trên thế giới ước tính có khoảng 18 triệu ca, trong đó tổng số ca tử vong khoảng 9,6 triệu ca (hình 1.1) [1]

Hình 1.1 Tình hình ung thư trên thế giới

Theo số liệu thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization – WHO, 2018), ung thư vú xếp vị trí thứ hai trong nhóm bệnh lý ung thư thường gặp và gây tử vong cao trên thế giới [1] Theo công bố của WHO (2018), tổng số trường hợp mắc ung thư vú là 2,1 triệu người trong đó số ca tử vong là 626.679 ca (30%) Ở Việt Nam, số ca mắc ung thư mới đã tăng lên 165.000 ca trong đó có khoảng 15.229 ca mắc ung thư vú mới được phát hiện (WHO, 2018)

Theo WHO (2018), ung thư là thuật ngữ chung đề cập đến nhóm bệnh lý liên quan đến sự phân chia tế bào một cách bất thường và mất kiểm soát Các tế bào ung thư có khả năng di chuyển, xâm lấn đến các cơ quan khác dựa vào cơ chế sinh mạch (hệ bạch huyết và mạch máu), tiến trình này gọi là di căn [21] Ung thư vú là tình trạng tăng trưởng thất thường và tăng sinh của các tế bào có nguồn gốc từ mô vú, khởi phát

5 từ sự tăng trưởng mất kiểm soát của tế bào biểu mô thuộc ống dẫn sữa hoặc các thùy tuyến vú [22].

Phân loại ung thư vú

Các dạng ung thư vú hiện nay bao gồm: ung thư vú không xâm lấn (Non - Invasive Breast Cancer) trong đó có ung thư biểu mô tiểu thùy tại chỗ (Lobular carcinoma in situ - LCIS) và ung thư biểu mô ống tại chỗ (Ductal carcinoma in situ - DCIS); ung thư vú xâm lấn (Invasive Breast Cancer); ung thư biểu mô tiểu thùy xâm lấn (Invasive Lobular Carcinoma - ILC); ung thư biểu mô ống xâm lấn (Infiltrating ductal carcinoma - IDC) [22] Ngoài ra, một số dạng ung thư hiếm gặp như là ung thư biểu mô tủy (Medullary carcinoma), ung thư biểu mô đột biến (Mutinous carcinoma), ung thư biểu mô ống (Tubular carcinoma), ung thư vú dạng viêm (Inflammatory breast cancer), bệnh Paget của núm vú (Paget’s disease of the nipple), bướu diệp thể vú (Phyllodes tumor) [22]

Trong các dạng ung thư kể trên, ung thư biểu mô ống tại chỗ (Ductal carcinoma in situ - DCIS) và ung thư biểu mô tiểu thùy tại chỗ (Lobular carcinoma in situ - LCIS) là các dạng ung thư vú thường gặp [22, 23] Các yếu tố tiên lượng bệnh thường được xét đến khi đánh giá loại ung thư này là độ tuổi, tình trạng di căn hạch bạch huyết, kích thước khối u, đặc tính mô học, tình trạng thụ thể hormon và tình trạng HER2 (Human Epidermal growth factor Receptor 2) [23, 24]

Do một số hạn chế của các công cụ phân loại ung thư vú hiện có, trong hơn một thập kỉ qua các nhà khoa học đã và đang tiếp cận hướng nghiên cứu phát triển công cụ phát hiện, chẩn đoán, đánh giá tình trạng bệnh, phân loại bệnh [23, 25] Điển hình là hướng phát triển công cụ sinh học phân tử trên nền tảng về mức độ biểu hiện gen [23, 25] Năm 2011, tại hội nghị quốc tế “St Gallen” về ung thư vú, các chuyên gia đã đưa ra quyết định phân loại ung thư vú theo phương pháp phân loại phân tử dựa trên biểu hiện gen, ung thư vú được chia thành các nhóm: nhóm Luminal A với dấu hiệu lâm sàng là ER+ và/hoặc PR+, HER2-, mức độ biểu hiện Ki67 thấp (14%) và ER+ và/hoặc PR+, HER2+, bất kể mức độ biểu hiện Ki67 như thế nào; nhóm HER2 biểu hiện quá mức với dấu hiệu lâm sàng ER- và PR-, HER2+; nhóm Basal-like với dấu hiệu lâm sàng ER- và PR-, HER2- [23, 26].

Nguyên nhân và các yếu tố nguy cơ

Nhiều yếu tố nguy cơ dẫn đến ung thư vú đã được ghi nhận: những biến đổi bất thường về di truyền, rối loạn về nội tiết tố, yếu tố môi trường hoặc do các thói quen sống và chế độ ăn uống không lành mạnh: lối sống ít vận động, chế độ ăn uống mất cân bằng dinh dưỡng, sử dụng thực phẩm nhiều chất béo, đồ uống có cồn [22, 27, 28]

Sự thay đổi trong di truyền đóng một vai trò quan trọng trong sự khởi đầu và tiến triển của bệnh ung thư [29] Các yếu tố di truyền gồm: epigenetics, đột biến và tính đa hình nucleotide đơn (SNP) [29].

Epigenetics

Epigenetics là thuật ngữ chỉ những biến đổi trong cơ chế di truyền, liên quan đến sự biểu hiện gen mà không làm thay đổi trình tự DNA của bộ gen và dẫn đến sự sửa đổi có thể được truyền đến các thế hệ tế bào con [30] Epigenetics gồm các cơ chế sinh học như sau: methyl hóa DNA (DNA methylation), biến đổi histone, sắp xếp lại/tái cấu trúc nucleosome và RNA không mã hóa cụ thể là microRNA [31, 32] Các cơ chế này tương tác với nhau và tuân theo sự phối hợp phân tử chính xác để duy trì hoặc thay đổi các dấu hiệu epigenetics trong bộ gen Đây là mấu chốt để duy trì sự biệt hóa, tăng trưởng và cân bằng tế bào [33] Các cơ chế này liên quan đến sự bất hoạt hoặc kích hoạt sự phiên mã gen chức năng hoặc phóng bế sự sinh tổng hợp protein, [34]

Hiện nay, đã có một số dẫn chứng khoa học về mối liên kết giữa epigegetics và một loạt các loại bệnh lý ở người: ung thư, các bệnh về hô hấp, tim mạch, sinh sản, tự miễn và bệnh thần kinh [30] Nguyên nhân được biết đến hoặc nghi ngờ (ẩn đằng sau) sự rối loạn hoạt động của gen, cụ thể là các dạng rối loạn epigenetics bao gồm: kim loại nặng, thuốc trừ sâu, khí thải diesel, khói thuốc lá, hydrocacrbon thơm đa vòng, hormone, phóng xạ, virus, vi khuẩn, [30]

Sự methyl hóa DNA (DNA methylation)

Hình 1.2 Sự methyl hóa DNA [35]

Sự methyl hóa DNA là một cơ chế thuộc quá trình biến đổi epigenetics, thường xảy ra trên đảo CpG thuộc vùng promoter các gen trong bộ nhiễm sắc thể tế bào Eukaryote [36, 37] Sự methyl hóa DNA là phản ứng hóa học bổ sung một nhóm methyl (CH3) vào vị trí C5 của cytosine để tạo thành 5-methylcytosine (5Mc) [35, 36] Sự methyl hóa DNA được xúc tác bởi enzyme DNA methltransferases (DNMTs) bao gồm DNMT1, DNMT2, DNMT3A, DNMT3B, giúp chuyển nhóm methyl từ S-adenyl methionine (SAM) thành S-adenosylhomocysteine (SAH) [35, 36]

1.5.2 Vai trò của sự methyl hóa trong tế bào bình thường

Sự methyl hóa DNA giữ vai trò kiểm soát sự biểu hiện gen và cấu trúc nhiễm sắc thể trong các tế bào Eukaryote [37] Trong các mô bình thường, sự methyl hóa các đảo CpG ở vùng promoter dẫn đến hai cơ chế điều hòa biểu hiện gene: (1) ức chế các yếu tố điều hòa biểu hiện gene gắn vào vùng khởi động do gốc CH3 gắn vào Cytosin (2) sự gắn đặc hiệu các protein vào các vị trí CpG bị methyl hóa dẫn đến biến đổi histon (mất acetyl) và làm cấu trúc sợi chromatin co lại, cuối cùng dẫn đến các yếu tố phiên mã không gắn được vào vùng đó của DNA [38] Ngoài ra, quá trình methyl hóa DNA còn liên quan đến các quá trình sinh lý khác nhau, chẳng hạn như biệt hóa tế bào, bất hoạt nhiễm sắc thể X, in dấu gen và ổn định gen [38]

1.5.3 Sự methyl hóa bất thường

Sự methyl hóa DNA bất thường là nguyên nhân gây cản trở sự phiên mã của các gen giữ chức năng quan trọng, điển hình là các gen ức chế khối u trong một số bệnh lý ung thư [39, 40, 41] Sự methyl hóa vượt mức tại các vùng promoter trên các gen đặc biệt là chìa khóa mở ra con đường sinh ung trong việc hình thành và tiến triển của bệnh ung thư vú [42]

Tính chất methyl hóa bất thường gồm có dạng cao vượt mức (Hypermethylation) và giảm (hoặc còn được gọi là giải) methyl hóa (Hypomerthylation) [41, 42, 43] Tính chất methyl hóa cao vượt mức liên quan đến sự rối loạn cơ chế điều hòa biểu hiện các gen ức chế khối u, gây nên sự bất hoạt các gen này Tính chất giải methyl liên quan đến cơ chế kích hoạt các gen tiền sinh ung (proto oncogene) biến đổi thành các gen sinh ung (oncogene), tạo thành các oncoprotein gây nên hiện tượng “mở” con đường sinh ung [44]

Công bố khoa học của Huang và cộng sự (1990), Duffy và cộng sự (2009), Jin và cộng sự (2011) xác định tình trạng methyl hóa bất thường trên vùng promoter của các gen chức năng (điều hòa chu trình tế bào, kiểm soát sự phân bào, ) là nhóm dấu chứng sinh học tiềm năng trong tiên lượng, chẩn đoán sớm và dự đoán đáp ứng điều trị các bệnh lý ung thư, trong đó có ung thư vú xảy ra trải dài trên toàn bộ nhiễm sắc thể hoặc chỉ xuất hiện cục bộ trên vùng đảo CpG (CpG island) [41, 42, 43]

Hình 1.3 Sự methyl hóa DNA và sự biểu hiện gen [35]

Đảo CpG

Đảo CpG là chuỗi DNA có chiều dài từ 300 bp đến 3000 bp Đảo CpG có tỷ lệ dinucleotide CpG lớn hơn 50% và tỷ lệ cặp dinucleotide CpG/GpC ≥ 0,6 [45, 46]

Các cặp CpG được hình thành bởi liên kết phosphodiester giữa cytosine và guanine [45, 46] Trên bộ gen người, ước tính có khoảng 29.000 đảo CpG và phân bố không đều, thường tập trung trên vùng promoter gen giữ nhà (Housekeeping gene) hoặc một số gen giữ vai trò điều hòa hoạt động tế bào [47, 48] Sự methyl hóa DNA diễn ra trên đảo CpG thuộc vùng promoter các gen đè nén ung, dẫn đến bất hoạt gen, thúc đẩy cơ chế sinh ung [49].

Đột biến điểm – Tính đa hình gen

Theo Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute - NIH), đột biến điểm là những biến đổi rất nhỏ trên một đoạn phân tử DNA thường liên quan đến một nucleotide hay một cặp nucleotide

Xét về mức độ phân tử DNA, đột biến điểm gồm có dạng: đột biến thay thế cặp base (Base substitution) và đột biến thêm hoặc bớt cặp base (Base-pair insertition/deletion)

- Đột biến thay thế cặp base gồm hai dạng

+ Đột biến đồng hoán (Transition mutation): là sự thay thế purine này bằng một purine khác, một pyrimidine này bằng một pyridine khác

+ Đột biến dị hoán (Transversion mutation): là sự thay thế purine này bằng một pyrimidine khác hoặc thay thế một pyrimide này bằng một purine khác

Hình 1.4 Đột biến đồng hoán – dị hoán

- Đột biến thêm/bớt cặp base là dạng đột biến liên quan đến sự thêm vào/mất đi một hay một vài cặp base trên đoạn phân tử DNA hay còn được gọi là đột biến thêm/mất một vài cặp nucleotide

Hình 1.5 Đột biến thêm/mất cặp base 1.7.2 Tính đa hình gen

Tính đa hình là sự xuất hiện hai hay nhiều biến thể hoặc các hình thức khác nhau được gọi là kiểu hình thay thế trong một quần thể loài [106] Có 3 dạng: đa hình cân bằng (balanced polymorphism), đa hình di truyền (genetic polymorphism), đa hình đơn nucleotide (single nucleotide polymorphism – SNP [106]

Theo Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute – NIH), SNP là sự thay đổi của một nucleotide ở một vị trí xác định trên trình tự bộ gene SNP là loại biến thể di truyền phổ biến nhất ở người Mỗi SNP đại diện cho một sự khác biệt trong từng cấu tử của DNA, được gọi là nucleotide Trong một quần thể, số cá thể mang biến thể này lớn hơn 1% tổng số cá thể

Hình 1.6 Dạng biến thể - SNP: thay thế G-C thành A-T

Theo Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (NIH), SNP được ứng dụng trong y học hiện đại nhằm xác định mức độ tương đồng hoặc khác nhau giữa các vùng gen thuộc hệ gen giữa nhóm người bệnh và nhóm người lành Các nghiên cứu phân tích biến thể

(SNP, đột biến điểm) có ý nghĩa khoa học thực tiễn trong hướng y học cá thể, nhằm xác định một số đặc điểm phân tử gắn chặt nguy cơ dẫn đến các bệnh lý ung thư của từng bệnh nhân.

Dấu chứng sinh học (Biomarker)

Dấu chứng sinh học là các yếu tố thuộc cấp độ tế bào, phân tử hoặc các quá trình sinh hóa [50, 51] Dấu chứng sinh học được tìm thấy trong máu, thể dịch trong các cơ thể khác nhau hoặc các mô, được sử dụng để nhận diện hoặc theo dõi trạng thái sinh học (bình thường/bất thường) [50, 51] Có rất nhiều loại dấu ấn sinh học bao gồm: protein, axit nucleic, kháng thể, peptide, hoặc cũng có thể là một tập hợp các thay đổi chẳng hạn như biểu hiện gen, [50, 51]

Dấu chứng sinh học có thể được sử dụng trong chẩn đoán lâm sàng nhằm: tiên đoán nguy cơ mắc bệnh, sàng lọc ung thư nguyên phát, phân biệt u lành tính với u ác tính, tiên lượng và dự đoán ca mắc mới hoặc tái phát, xác định đáp ứng điều trị hoặc tiến triển với trị liệu [50].

Tổng quan về các gen mục tiêu

1.9.1 Nhóm gen ức chế khối u

Hình 1.7 Định vị gen CCND2 trên nhiễm sắc thể số 12

(https://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?geneD2&keywordsD2) Gen CCND2 (Cyclin D2) là gen ức chế khối u nằm trên nhiễm sắc thể 12p13.32, gồm

5 exon, có chiều dài 32.941 bp (GeneCards, NCBI) Gen CCND2 mã hóa protein cyclin D2, có chức năng điều tiết các kinase CDK [8]

Protein CCND2 liên kết với CDK4 hoặc CDK6 tạo thành một phức hợp và hoạt động như một tiểu đơn vị điều tiết của phức hợp, có hoạt động cần thiết cho quá trình chuyển đổi G1/S của chu trình tế bào [8] Protein này đã được chứng minh là tương tác và tham gia vào quá trình phosphoryl hóa protein ức chế khối u RB

1.9.1.2 Gen CDKN2A (Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A, p16 INK4a )

Hình 1.8 Định vị gen CDKN2A trên nhiễm sắc thể số 9

(https://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?geneN2A&keywordsN2A) Gen CDKN2A (Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A, p16 INK4a ) là gen ức chế khối u, nằm trên nhiễm sắc thể 9p21.3, gồm 8 exon, có chiều dài 27.572 bp (GeneCards, NCBI) Gen CDKN2A mã hóa protein p16 INK4a tham gia vào cơ chế kiểm soát chu trình tế bào tại giai đoạn chuyển pha G1 đến pha S [10] CDKN2A liên kết với CDK4 hoặc CDK6 tạo thành phức hợp xúc tác dẫn đến sự phosphoryl hóa RB và dẫn đến bất hoạt chức năng RB [10]

1.9.1.3 Con đường truyền tín hiệu cyclin D - CDK4/6 - INK4 - Rb

Chu kỳ tế bào quan trọng thiết yếu cho sự tăng sinh, tăng trưởng và phân chia tế bào [52, 53] Chu kỳ tế bào chia thành 4 pha: G1, S, G2 và M [52, 53] Để thông tin di truyền được truyền đi chính xác thì thứ tự và thời gian của chu kỳ tế bào rất quan trọng, do đó, các con đường tín hiệu diễn ra trong các giai đoạn chuyển tiếp giữa pha G1 – S, G2 – M, , nhằm đảm bảo, duy trì sự ổn định của bộ gen, lưu trữ và cũng như biểu hiện chính xác thông tin được mã hóa [52, 53] “Checkpoint” là thuật ngữ đề cập đến việc dừng, kiểm soát chu kỳ tế bào tại các thời điểm chuyển tiếp giữa các pha [52]

Trong hầu hết các mô trưởng thành, các tế bào biệt hóa luôn được duy trì trong pha G0, các tế bào này được cho là không hoạt động và chờ đợi để vào chu kỳ tế bào [53] Các yếu tố tăng trưởng và kích thích tố có thể kích hoạt chu kỳ tế bào và gây ra sự chuyển pha từ G0/G1 sang pha S [52, 53] Cyclin loại D và kinase phụ thuộc cyclin (CDK 4/6) đóng vai trò quan trọng trong chu kỳ tế bào CDK4 và CDK6 là serine/threonine kinase, và là protein CDK điển hình được kích hoạt khi có liên kết với cyclin Cyclin là một họ protein rất đa dạng, có kích thước từ khoảng 35 đến 90

13 kDa [52, 53] Khi các tế bào đã sẵn sàng để bắt đầu tổng hợp DNA (pha S) trong các tế bào động vật có vú, phức hợp CDK4/6 liên kết với các cyclin loại D (cyclin D1, cyclin D2 và cyclin D3) và điều hòa, thúc đẩy chu kỳ tế bào vượt qua pha G1 để đến pha S [52, 53]

Hoạt tính kinase của CDK4/6 được quy định chặt chẽ bởi rất nhiều chất ức chế CDK (CDKi), có tác dụng ức chế sự phát triển của chu kỳ tế bào trong điều kiện bất lợi [52, 53] Các thành viên của gia đình INK4: p16 INK4a (CDKN2A), p15 INK4b (CDKN2B), p18 INK4c (CDKN2C) và p19 INK4d (CDKN2D), các protein này hoạt động trên “phân tử đích” là CDK4 và CKD6 [52, 53] Các protein INK4 làm suy yếu sự liên kết của các cyclin loại D với CDK4/6 và tương tác với miền xúc tác của CDK4/6 để ngăn chặn mạnh mẽ hoạt động kinase [52, 53] Trong số 4 protein INK4, p16 INK4A dường như đóng vai trò quan trọng trong sự lão hóa và ức chế khối u trong tế bào người [52, 53] Ngược lại các thành viên gia đình Cip/Kip: p21 Cip1 (CDKN1A), p27 Kip1 (CDKN1B) và p57 Kip2 (CDKN1C) làm bất hoạt các phức hợp cyclin B, CDK2, cyclin A và CDK1 [52, 53] Phân tích cấu trúc/chức năng của protein p21 và p27 cho thấy N-termini của chúng chứa 2 miền chính, một miền cần cho liên kết cyclin và một miền khác được yêu cầu để liên kết với tiểu đơn vị CDK [52, 53]

Khi các tế bào vượt qua pha G1, cyclin D - CDK4/6 là phức hợp đầu tiên hoạt động trong pha G1, dẫn đến sự phosphoryl hóa mục tiêu hạ lưu của chúng là protein liên quan đến Retinoblastoma (pRb) [52, 53] Rb là một chất ức chế khối u điều chỉnh nhiều hoạt động quan trọng của tế bào, bao gồm điểm hạn chế pha G1 muộn, điểm kiểm tra phản ứng hủy hoại DNA, thoát khỏi chu kỳ tế bào và biệt hóa [52, 53] Họ retinoblastoma bao gồm ba thành viên (Rb/p105, p107 và Rb2/p130), Rb ức chế sự biểu hiện của nhiều gen liên quan đến kiểm soát chu kỳ tế bào, tiến trình phân bào và sinh tổng hợp Dntp [52, 53] Sự tăng phospho của Rb làm giảm ái lực với E2F, do đó có thể kích hoạt và phiên mã các gen mục tiêu của E2F cần thiết cho sự phân chia tế bào [52, 53] Khi tế bào thực hiện bước chuyển đổi từ pha G1 sang pha S, cyclin E/CDK2 phosphoryl hóa các dư lượng còn lại trên các protein thuộc họ Rb để kích hoạt E2F, hệ quả là E2F và các nhân tố phiên mã khác cho phép tế bào chuyển sang pha S và bắt đầu sao chép DNA trong giai đoạn cuối pha G1 [52, 53] E2F và các nhân tố phiên mã khác cho phép tế bào thực hiện phiên mã các gen có chức năng trong quá trình sao chép DNA [52, 53] Trong các cơ chế này hoạt động của phức hợp Cyclin A/CDK2 thúc đẩy tế bào vượt đến pha G2, trước khi cấu thành phức hợp cylin B/CDK1 và bắt đầu quá trình nguyên phân [52, 53]

Con đường cyclin D - CDK4/6 - INK4 - Rb bị rối loạn được ghi nhận trong nhiều loại ung thư ở người như: sarcoma, u thần kinh đệm, u vú, u lympho, ung thư bạch cầu, ung thư vú và u ác tính [53]

Hình 1.9 Con đường truyền tín hiệu cyclin D - CDK4/6 - INK4 – Rb [53]

1.9.2 Nhóm gen ApoB và MTHFR

Gen ApoB (Apolipoprotein B) định vị trên nhiễm sắc thể người tại 2p24.1, thuộc vị trí 20.999.218 - 21.044.073 (GRCh38/hg38), 21.224.301 - 21.266.945 (GRCh37/hg19) Gen ApoB có chiều dài khoảng 42.645 bp, gồm 29 exon (GeneCards, NCBI) Gen ApoB mã hóa glycoprotein có chức năng chính trong quá trình chuyển hóa lipoprotein ở người với trọng lượng khoảng 515 kDa và 4563 amino acid (GeneCards; NCBI) [54]

Hình 1.10 Định vị gen ApoB trên nhiễm sắc thể 2

(https://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=APOB&keywords=APOB)

Protein ApoB đóng một vai trò đặc biệt quan trọng trong việc vận chuyển lipoprotein, là thành phần cấu trúc thiết yếu của các hạt lipoprotein giàu TGs (triglyceride) và đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì cân bằng nội mô cholesterol [6] Một số báo cáo khoa học đã chỉ ra rằng ApoB có liên quan đến viêm, nhiễm virus, phát triển khối u và di căn [55, 56, 57, 58, 59] ApoB huyết thanh đã hoạt động như một dấu hiệu tiềm năng để chẩn đoán và tiên lượng bệnh ung thư buồng trứng, túi mật và ung thư vú [60, 61]

Protein Apo liên kết với lipid để tạo thành lipoprotein bằng cách hoạt động như chất mang lipid, Apo đóng vai trò là phối tử cho các thụ thể màng tế bào, đồng yếu tố của enzyme và các thành phần cấu trúc của lipoprotein [62] Apo có vai trò trong cơ chế chuyển hóa lipid, cholesterol trong máu [62] Họ gen Apo trên bộ gen người bao gồm

22 thành viên: ApoA1, ApoA2, ApoA4, ApoA5, ApoB 48, ApoB-100, ApoC1, ApoC2,

ApoC3, ApoC4, ApoD, ApoE, ApoH, ApoL1, ApoL2, ApoL3, ApoL4, ApoL5, ApoL6, ApoM, ApoO và ApoJ [63] Các APO khác nhau liên kết lipid để tạo thành lipoprotein có mật độ khác nhau và lipoprotein có thể được chia thành nhiều loại theo mật độ của chúng: chylomicron (CM), lipoprotein mật độ rất thấp (VLDL), lipoprotein mật độ thấp (LDL), lipoprotein mật độ trung gian (IDL) và lipoprotein mật độ cao (HDL) [64] Apo chủ yếu được tổng hợp ở gan và ruột [65] Ở gan, sự tổng hợp Apo bị ảnh hưởng bởi việc sử dụng các chất: rượu, thuốc hạ lipid, niacin và chế độ dinh dưỡng, đồng thời chịu ảnh hưởng bởi lượng estrogen, androgen, insulin, glucagon và thyroxin [65] Trong ruột, sự tổng hợp apolipoprotein chủ yếu được kiểm soát bởi hàm lượng lipid trong chế độ ăn uống [65]

⮚ Mối liên quan giữa rối loạn chuyển hóa lipid và các bệnh lý ở người

Lipid máu và protein từ rất lâu đã được quan tâm vì mối quan hệ chặt chẽ với các bệnh tim mạch, tuy nhiên nhiều nghiên cứu dịch tễ học gần đây đã chỉ ra mối liên hệ giữa bệnh béo phì và ung thư vú [13, 66, 67] Chuyển hóa lipid được cho là có vai trò trong sự phát triển của ung thư vú [13, 66, 67] Một số thí nghiệm trên động vật đã chứng minh rằng apolipoprotein có ảnh hướng đến sự phát triển của khối u thông qua điều tiết chức năng miễn dịch tế bào [68] Sự tổng hợp axit béo xuất hiện sớm trong quá trình sinh ung mở rộng khi các tế bào trở nên ác tính, thúc đẩy quá trình chuyển từ nguy cơ cao sang ung thư xâm lấn và có thể chiếm >90% triglyceride (TGs) trong các tế bào khối u [13] Đã có những nghiên cứu đưa ra bằng chứng cho mối liên quan giữa các TGs và nguy cơ ung thư vú [69, 70] Nồng độ lipid lưu hành của một người có thể bị ảnh hưởng bởi đặc điểm di truyền của chính người bệnh đó Một số đa hình đơn nucleotide (SNP) liên quan đến nồng độ lipid trong máu đã được ghi nhận trong các nghiên cứu phân tích đặc điểm tổng thể của bộ gen người (Genome – wide association study, GWAS) [71, 72]

SNP rs1042031 (G12699A, trong exon 29), thay đổi trình tự axit amin của protein ApoB bằng cách thay thế axit glutamic thành lysine và được biết đến rất quan trọng để điều chỉnh sự gắn kết của apolipoprotein B với thụ thể cholesterol lipoprotein mật độ thấp (LDL) [73] SNP rs693 ( C7673T, trong exon 26), nằm trong vùng mã hóa của gen APOB , được liên kết với mức LDL-C và TGs trong các mô hình di truyền khác nhau [74] Các dạng biến thể rs1042031 và rs693 trong gen APOB đóng vai trò kiểm soát âm và nghịch đảo về mức độ cholesterol và ApoB, và có liên quan đến nguy cơ ung thư túi mật, hẹp động mạch chủ và đột quỵ do thiếu máu cục bộ [75, 76, 77]

Gen MTHFR (Methylenetetrahydrofolate reductase) định vị trên nhiễm sắc thể người tại 1p36.22, thuộc vị trí 11.785.723 – 11.806.103 (GRCh38/hg38), 11.845.787 – 11.866.160 (GRCh37/hg19) có chiều dài 20.381 bp, gồm 12 exon Gen MTHFR mã

17 hóa enzyme MTHFR với trọng lượng khoảng 70 kDa và 656 amino acid (GeneCards, NCBI)

Hình 1.11 Định vị gen MTHFR trên nhiễm sắc thể số 1

(https://www.genecards.org/cgibin/carddisp.pl?gene=MTHFR&keywords=MTHFR)

MTHFR là một enzyme quan trọng trong con đường chuyển hóa folate và điều chỉnh nhóm folate nội bào để tổng hợp và methyl hóa DNA [78, 79] Folate tham gia vào quá trình methyl hóa, tổng hợp và sửa chữa DNA, lượng folate thấp có thể làm tăng nguy cơ mắc một số bệnh ung thư, bao gồm ung thư vú [80, 81] Enzyme MTHFR đóng vai trò quan trọng trong các quá trình chuyển hóa nội bào: tổng hợp nucleotide, homocysteine, methyl hóa nội bào, bằng cách xúc tác chuyển đổi 5,10 – methylenetetrahydrofolate thành 5 – methyltetrahydrofolate sử dụng cho việc tái tạo vitamin B, vitamin D12 - homocysteine thành methionine, tham gia quá trình sinh tổng hợp purine, DNA và RNA [7, 82]

Tình hình nghiên cứu các gen mục tiêu trên bệnh ung thư vú

Cho đến nay, có rất ít nghiên cứu về tính chất methyl hóa trên gen CCND2, CDKN2A ở Việt Nam Công trình nghiên cứu của Truong và cộng sự (2015), nghiên cứu về sự methyl hóa trên gen CCND2 trên mẫu bệnh phẩm ung thư vú của người Việt Nam dựa vào phương pháp MSP, xác định tỷ lệ methyl hóa bất thường trên gen CCND2 là 62% trên tổng số 95 mẫu bệnh phẩm và 10% trên 20 mẫu chứng [9] Tiếp đến năm

2018, Salta và cộng sự dựa vào phương pháp QMSP xác định tính chất methyl hóa vượt mức gen CCND2 trên 137 mẫu bệnh phẩm ung thư vú và 28 mẫu chứng của người Bồ Đào Nha [86] Salta và cộng sự ghi nhận tỷ lệ methyl hóa vượt mức trên gen CCND2 là 72% trên tổng số 137 mẫu bệnh phẩm ung thư vú và 7% trên tổng số

Công trình nghiên cứu của Vallian và cộng sự (2008), nghiên cứu về sự methyl hóa trên gen CDKN2A trên mẫu bệnh phẩm ung thư vú của người Iran dựa vào phương pháp MSP, xác định tỷ lệ methyl hóa bất thường trên gen CDKN2A là 36% trên tổng số 70 mẫu bệnh phẩm và 0% trên 70 mẫu chứng [87] Tiếp đến, năm 2016 Wu và cộng sự dựa vào phương pháp MSP xác định tính chất methyl hóa vượt mức gen

CDKN2A trên 70 mẫu bệnh phẩm ung thư vú và 20 mẫu chứng của người Trung Quốc

[12] Wu và cộng sự ghi nhận tỷ lệ methyl hóa vượt mức trên gen CDKN2A là 40% trên tổng số 70 mẫu bệnh phẩm ung thư vú và 20% trên tổng số 20 mẫu chứng

1.10.2 Nghiên cứu trên các gen ApoB và MTHFR

Hệ thống tổng hợp dữ liệu biến thể (đột biến) trên gen ApoB và gen MTHFR chưa được thiết lập đối với bệnh lý ung thư vú Việc nghiên cứu tính chất đột biến điểm của gen ApoB và MTHFR là một hướng đi mới trong việc phân tích tính chất đột biến

19 điểm trên bộ gen người Tới nay, vẫn chưa có công trình nào công bố về tính chất đột biến điểm trên gen ApoB và MTHFR tại Việt Nam Vì vậy, hướng nghiên cứu tính chất đột biến điểm trên gen ApoB và MTHFR mở ra tầm nhìn về sự đa dạng của toàn bộ gene người

Các công trình nghiên cứu về tính đa hình trên gen ApoB còn hạn chế Tính đa hình trên gen ApoB lần đầu tiên được đề cập trong nghiên cứu của Liu và cộng sự (2013) [6] Trong nghiên cứu này Liu và cộng sự đã sử dụng phương pháp RFLP – PCR, nhóm tác giả đã phát hiện được hai vị trí SNP trên gen ApoB tại locus 12669 (G → A) và 7673 (C → T) được xác định có mối tương quan đáng kể với nguy cơ ung thư vú cao trên 675 mẫu ung thư vú và 712 mẫu chứng của người Trung Quốc [6] Kết quả nghiên cứu biểu thị tần số xuất hiện tính biến thể G12669A trên gen ApoB là 53,8% ở mẫu ung thư vú và 29,8% ở mẫu lành; tần số xuất hiện tính biến thể C7673T trên gen ApoB là 63% ở mẫu ung thư vú và 44% ở mẫu chứng [6]

Tính đa hình của gen MTHFR lần đầu tiên được đề cập trong nghiên cứu của Sharp và cộng sự (2002) [88] Trong nghiên cứu này, Sharp và cộng sự đã sử dụng phương pháp PCR-RFLP; nhóm tác giả đã phát hiện được hai vị trí SNPs trên gen MTHFR tại locus 1298 (A → C) và 677 (C → T) được xác định có mối tương quan đáng kể với nguy cơ ung thư vú cao trên 55 mẫu ung thư vú và 60 mẫu chứng của người Anh [88] Trong nghiên cứu về tính đa hình gen MTHFR trên 919 trường hợp (315 mẫu bệnh và

604 mẫu chứng) của Akilzhanova và cộng sự (2013), biến thể SNP A1298C đã được phát hiện [89] Ngoài ra, nhóm tác giả đã so sánh kiểu gene và sự phân bố tần số alen giữa nhóm bệnh và chứng, cho thấy tần số alen C trong nhóm bệnh cao hơn đáng kể so với nhóm chứng (33,7% so với 27,3%) [89] Tần số của kiểu gen CC trong nhóm bệnh so với nhóm chứng là cao hơn và khác biệt đáng kể (11,1% so với 7,3%) [89]

Tuy nhiên, các đặc điểm phân tử (biến thể, SNP, đột biến điểm) trên gen ApoB và MTHFR có liên quan như thế nào đến sự hình thành và phát triển của ung thư vú cần được làm rõ trên người bệnh ung thư vú cũng như người lành ở nhiều nước khác nhau, trong đó có Việt Nam Trên cơ sở khoa học này, đề tài nghiên cứu này được thực hiện để bước đầu phản ánh đặc điểm phân tử trên gen ApoB và MTHFR, tập trung ở một số exon có các biến thể nổi trội liên quan đến bệnh lý ung thư vú.

Phương pháp phân tích tổng hợp (Meta-analysis)

Phân tích tổng hợp là một công cụ định lượng và thống kê, được sử dụng để tổng hợp các kết quả, kết luận của các nghiên cứu độc lập nhằm mục đích đánh giá, xác định hiệu quả điều trị tạo cơ sở cho việc phát triển các phác đồ điều trị hoặc đánh giá một cách có hệ thống các kết quả nghiên cứu trước đó để đưa ra các kết luận về bản chất của nghiên cứu [90, 91] Phân tích tổng hợp là phương pháp quan trọng để khai thác các tài liệu có sẵn, đóng vai trò trung tâm trong y học thực chứng [90, 91] Trong phân tích tổng hợp, bước trích xuất dữ liệu trên các tiêu chuẩn, điều kiện định sẵn là bước tiên quyết, phải đảm bảo kết quả chính xác với độ tin cậy cao (confidence intervals-Cis: 95%) [91]

Phân tích tổng hợp được sử dụng nhằm: giải quyết các vấn đề đang tranh cãi hoặc mâu thuẫn về kết quả của các nghiên cứu hoặc chưa có câu trả lời dứt khoát; xác định giả thuyết mới cho các vấn đề đã và đang được nghiên cứu rộng rãi hoặc chưa đủ/thiếu bằng chứng/minh chứng thích hợp [92]

Phân tích tổng hợp theo phương pháp thống kê trên mô hình phân tích tổng hợp ảnh hưởng bất biến (Fixed effects meta analysis - F) hoặc mô hình phân tích tổng hợp ảnh hưởng ngẫu nhiên (Random effects meta analysis - R) cho một tiêu chí nhị phân với khoảng tin cậy 95% (CI) [107] Tiêu chí lựa chọn mô hình phân tích tổng hợp dựa vào chỉ số I 2 phản ánh tính bất đồng nhất về biến số khảo sát trong bộ dữ liệu [107]:

- Khi I 2 < 50% và P ≥ 0,1: phân tích tổng hợp hướng theo mô hình ảnh hưởng bất biến (Fixed-effects models)

- Khi I 2 > 50% và P < 0,1: phân tích tổng hợp hướng theo phân tích tổng hợp ảnh hưởng ngẫu nhiên (Random effects models)

Trong quá trình phân tích tổng hợp, một số bước cơ bản cần được thực hiện như sau [92, 93]:

Bước 1: Đặt nghi vấn (câu hỏi, từ khóa) giúp giải quyết các vấn đề phân tích tổng

21 hợp (dựa theo PICO (Participant-Intervention-Comparator-Outcomes);

- P (Participant): độ tuổi, giới tính, chủng tộc, quốc tịch,

- I (Intervention): ước số cần phân tích

- C (Comparator): phương pháp nghiên cứu,

- O (Outcomes): hướng tiếp cận giải quyết để xuất kết quả

Bước 2: Tìm kiếm công bố khoa học dựa trên các cơ sở dữ liệu: Pubmed/Medline, Google Scholar, NCBI, ;

Bước 3: Chọn lọc dữ liệu để phân tích tổng hợp bằng cách đọc tóm tắt và tiêu đề của các công bố khoa học;

Trước hết, thiết lập một sơ đồ quyết định cho việc chọn và bỏ các bài viết để thực hiện phù hợp cho việc phân tích tổng hợp Thiết lập một sơ đồ gồm có:

- Dữ liệu (báo cáo khoa học) có/không liên quan đến câu hỏi nghiên cứu

- Dữ liệu có/không có đối tượng/quần thể liên quan

- Dữ liệu có/không có sự liên quan đến nghiên cứu

- Dữ liệu có/không có nhóm so sánh, thuộc nhóm nghiên cứu ca chứng/đoàn hệ,

- Dữ liệu có/không thảo luận về kết quả của nghiên cứu

- Dữ liệu có/không được xuất bản ở định dạng chuẩn và phù hợp để trích xuất dữ liệu

- Dữ liệu được xuất bản bằng ngôn ngữ gì, có phù hợp để trích xuất dữ liệu?

- Dữ liệu có/không có tính trùng lặp (cùng một ấn phẩm được xuất bản hai lần)

Bước 4: Chọn lọc và trích xuất dữ liệu của các công bố khoa học dựa trên nội dung toàn văn;

- Tên tác giả, năm bài báo được xuất bản

- Cỡ mẫu/Loại mẫu, quần thể người bệnh, được thực hiện nghiên cứu

- Loại nghiên cứu, đối tượng nghiên cứu, phương pháp nghiên cứu, kết quả là gì và được xác định bằng phương pháp gì, kết quả như thế nào?

- Tổng mẫu khảo sát, tổng mẫu đối chứng

- Kết quả nghiên cứu theo thang đo liên tục hoặc thang đo nhị phân

Bước 5: Đánh giá biến số dựa vào phương pháp thống kê với chỉ số tỷ suất chênh Odds ratio (OR), sử dụng mô hình ảnh hưởng bất biến “Fixed effects model” hoặc mô hình ảnh hưởng ngẫu nhiên “Random effects model” và xây dựng đồ thị “Forest plot”;

Bước 6: Xác định tính thiên vị của bộ dữ liệu đưa vào phân tích tổng hợp thông qua đồ thị “Funnel plot”;

Bước 7: Tiến hành chia nhóm phân tích và kiểm tra kết quả phân tích tổng hợp.

Phương pháp phân tích tính chất methyl hóa DNA

1.12.1 Phương pháp BSP (Bisulfite sequencing - PCR)

Bisulfite sequencing - PCR (BSP) được thiết lập đầu tiên bởi Frommer và cộng sự (1992) Đối với phương pháp BSP, đầu tiên DNA phải được biến đổi bisulfite để chuyển đổi tất cả Cytosine thành Uracil ngoại trừ các Cytosine đã bị methyl hóa, sau đó thực hiện PCR để tiến hành khuếch đại DNA đã biến đổi bisulfite [94]

Trong phương pháp BSP, một cặp mồi đặc hiệu được sử dụng để khuếch đại vùng gen khảo sát, đặc điểm quan trọng trong việc thiết kế cặp mồi này là không chứa bất kì vị trí CpG nào trên trình tự của chúng để có thể khuếch đại cả allele methyl và allele unmethyl trên DNA đã biến đổi bisulfite và sau đó tiến hành giải trình tự để kiểm tra tính đặc hiệu của quy trình, xác định vị trí CpG bị methyl hóa thuộc các gene mục tiêu [94]

1.12.2 Phương pháp MSP (Methylation-Specific PCR)

Phương pháp MSP (Methylation-Specific PCR) được Herman và cộng sự xây dựng vào năm 1996, MSP là phương pháp đơn giản với độ nhạy cao và độ đặc hiệu giúp xác định tình trạng methyl hóa ở hầu hết các đảo CpG thuộc vùng promoter [95] Bản chất của MSP là phương pháp PCR khuếch đại vùng gen mục tiêu sau khi đã được biến đổi bằng sodium bisulfite [95] Thành phần phản ứng gồm có: DNA polymerase, trình tự DNA đã được biến đổi bisulfite và bộ mồi đặc hiệu với trạng thái allele methyl hóa và trạng thái allele không methyl hóa [95]

Tiếp theo, phương pháp MSP gồm hai phản ứng PCR riêng biệt:

- Phản ứng thứ nhất với cặp mồi đặc hiệu với trạng thái allele methyl hóa

- Phản ứng thứ hai với cặp mồi đặc hiệu với trạng thái allele không methyl hóa

Phương pháp Nested - MSP được Divine và cộng sự thiết lập vào năm 2006 Thực chất Nested - MSP là phương pháp MSP cải tiến và cũng được thực hiện trên DNA bộ gen đã được biển đổi bisulfite Nested - MSP là phương pháp cho phép phát hiện tình trạng methyl hóa chính xác và có độ nhạy cao hơn hẳn so với phương pháp MSP truyền thống [96] Một quy trình Nested - MSP gồm ba phản ứng PCR riêng biệt [97]:

- Phản ứng thứ nhất sử dụng một cặp mồi thứ nhất có tính phổ quát trên vùng trình tự mục tiêu Sản phẩm PCR lần thứ nhất là mạch khuôn cho hai phản ứng PCR riêng biệt, diễn ra song song

- Phản ứng thứ hai với cặp mồi đặc hiệu với trạng thái allele methyl hóa

- Phản ứng thứ ba với cặp mồi đặc hiệu với trạng thái allele không methyl hóa.

Phương pháp xác định tính chất đột biến điểm

Theo công bố khoa học của Van der Put và cộng sự (1998), Gaughan và cộng sự (2001) có nhiều phương pháp sinh học phân tử phù hợp để xác định trình tự nucleotide, gồm có: PCR kết hợp giải trình tự (PCR - Sequencing), Retriction Fragment Length Polymorphism (RFLP), Multiplex PCR, Nested PCR, Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) [98, 99] Trong đó, phương pháp PCR kết hợp giải trình tự (PCR - Sequencing) là phương pháp cho phép phân tích chính xác trình tự nucleotide trên gen mục tiêu, giúp phát hiện và xác định bản chất các dạng đột biến điểm - là nguyên nhân dẫn đến một số bệnh di truyền thuộc nhóm rối loạn chuyển hóa [100]

PCR (Polymerase Chain Reaction) được phát triển bởi Kary Mullis năm 1984 [101] Nguyên tắc của phương pháp PCR là khuếch đại lượng lớn bản sao từ các chuỗi DNA khuôn, dựa trên sự hoạt động của DNA polymerase để tổng hợp các chuỗi bản sao theo nguyên tắc bán bảo tồn và bắt cặp bổ sung [102] Enzyme DNA polymerase xúc tác phản ứng tổng hợp mạch DNA mới từ mạch khuôn với sự hiện diện của mồi chuyên biệt Đó là đoạn oligonucleotide ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với DNA mạch khuôn PCR là phản ứng chuỗi bao gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba bước:

- Bước 1: biến tính ở nhiệt độ khoảng 90 - 95℃ Trong quá trình biến tính, mạch đôi DNA trở thành mạch đơn và toàn bộ phản ứng enzyme dừng lại

- Bước 2: bắt cặp ở nhiệt độ trong khoản 40 - 70℃, thấp hơn nhiệt độ Tm của mồi

- Bước 3: tổng hợp ở nhiệt độ 72℃, là nhiệt độ hoạt động tối ưu của DNA polymerase chịu nhiệt, thực hiện quá trình tổng hợp mạch DNA mới theo nguyên tắc bổ sung với trình tự mạch đích

Phương pháp giải trình tự cho phép xác định trình tự nucleic acid đã được xử lý hóa học để làm biến đổi đặc hiệu một hoặc hai loại base của nucleotide trên đoạn DNA, thường dựa vào phương pháp của Frederick Sanger và cộng sự (1977) Đây là phương pháp được Sanger sử dụng để xác định trình tự DNA ty thể (16.569 bp) và bộ gen của thực khuẩn thể pha (48.502 bp) Nguyên tắc của phương pháp Sanger là sử dụng các dideoxyribonucleotide triphosphate (ddNTP) để dừng phản ứng kéo dài mạch của DNA polymerase vì ddNTP không chứa nhóm 3’- OH dùng để tạo liên kết với nucleotide kế tiếp [103] Phản ứng khuếch đại DNA mạch đôi, gồm có các thành phần: DNA polymerase, trình tự DNA mạch khuôn (ở trạng thái mạch đơn), bốn loại dNTP thông thường và một lượng nhất định ddNTP được đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ hoặc chất phát màu huỳnh quang khác nhau [103].

VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Công cụ tin sinh học

- NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)

- GeneCards (http://www.genecards.org/)

- Google (https://www.google.com.vn/)

- BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)

- MethPrimer (http://www urogene.org/methprimer/)

- IDT (http//sg.idtdna.com/calc/analyzer)

- LOVD (https://databases.lovd.nl/shared/genes)

- ClinVar (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/)

Sử dụng 20 mẫu bệnh phẩm ung thư vú được khẳng định bằng phương pháp chẩn đoán lâm sàng kết hợp cận lâm sàng (phân tích hóa mô miễn dịch, nhuộm mô) được đúc trong paraffin cung cấp từ Bệnh viện Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Tất cả các mẫu nghiên cứu đều được sự đồng ý cho phép từ Hội Đồng Y Đức Bệnh viện Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh và sự đồng ý của bệnh nhân tham gia nghiên cứu

2.1.3 Dụng cụ - thiết bị - hóa chất

Kẹp lấy mẫu, đèn cồn, eppendorf, micropipette, đầu tip, ống đong, erlen, …

Máy vortex, máy ly tâm, bộ điện di DNA, cân kỹ thuật, tủ hút khí độc, máy quang phổ kế, máy luân nhiệt, máy chụp ảnh gel, lò vì sóng, máy PCR,

2.1.3.3 Hóa chất a) Hóa chất tách chiết DNA bộ gen

Xylene, Ethanol 99%, Ethanol 70%, Ethanol 50%, bộ kit Toppure ® DNA Genome Extraction (Cat# HI-112) a) Hóa chất biến đổi DNA bằng sodium bisulfite

Bộ kit EZ DNA Methylation – Gold TM (Cat# D5005 & D5006) b) Hóa chất phản ứng PCR

- Master Mix (2X) (Cat# BIO-25041), mồi xuôi, mồi ngược, nước cất hai lần vô trùng

- Hóa chất điện di DNA trên gel agarose: 6X GelRed TM Loading Buffer with Tricolor (Cat# DD-012), 5X Loading Buffer Tricolor (Cat# BIO-37070), agarose (Cat# BIO-41025), TBE 10X (Cat# DD-033), thang chuẩn 50bp (Cat# BIO-33054), nước cất hai lần vô trùng.

Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Khai thác dữ liệu (Data mining)

Khai thác, tìm kiếm, thu nhập dữ liệu khoa học (bài báo khoa học) trên nguồn cơ sở dữ liệu của PubMed, PubMed Central (National Central for Biotechnology Information – NCBI), Google, … với một số từ khóa: CCND2, CDKN2A, DNA methylation, breast cancer, … để thu nhập các bài báo khoa học đề cập đến một số nội dung trọng tâm: nguyên nhân, tình hình ung thư vú trên thế giới và tại Việt Nam, tính chất methyl hóa vượt mức trên gen CCND2 và CDKN2A liên quan đến bệnh ung thư vú được xác định bằng phương pháp sinh học phân tử phổ biến: phương pháp MSP (Methylation- specific PCR), Nested - MSP (Nested Methylation- specific PCR), …

Trong quá trình tự hiện khai thác dữ liệu, các từ khóa được sử dụng: ApoB, MTHFR, SNP, breast cancer, polymorphism, nhằm thu thập các bài báo khoa học đề cập đến một số nội dung trọng tâm: tính chất đột biến điểm, tính đa hình trên các gen ApoB,

MTHFR liên quan đến bệnh ung thư vú

2.2.2 Phân tích tổng hợp (Meta - analysis)

Phân tích tổng hợp xác định sự tương quan giữa tính chất methyl hóa vượt mức, tính chất đột biến điểm trên gen CCND2, CDKN2A, ApoB, MTHFR và bệnh ung thư vú, dựa vào tham số định lượng: tỷ lệ methyl hóa trên gen CCND2 và CDKN2A và tỷ lệ đột biến điểm trên gen ApoB và MTHFR trên bộ mẫu ung thư vú/bộ mẫu của người khỏe mạnh (mẫu chứng); chỉ số tỷ suất chênh (Odds ratio-OR), … với khoảng tin cậy 95% (Confidence intervals-Cis)

- Công cụ phân tích thống kê: Phần mềm Medcalc v19.1.3

- Tiêu chuẩn chọn lọc các công bố khoa học:

• Nghiên cứu ca - chứng (case - control study) trong khảo sát tính tương quan giữa methyl hóa vượt mức trên vùng promoter gen CCND2 và

CDKN2A và trong khảo sát tính tương quan giữa tính chất đột biến điểm trên gen ApoB và MTHFR

• Các công bố khoa học được viết bằng tiếng Anh

- Trích xuất dữ liệu chi tiết: Trong bước trích xuất dữ liệu, tập trung các tiêu chí nhằm khai thác thông tin về tính chất methyl hóa trên vùng promoter gen mục tiêu CCND2 và CDKN2A, thông tin về tính chất đột biến trên gen ApoB và MTHFR trên bộ mẫu ung thư vú/bộ mẫu lành trên thế giới; phương pháp sinh học phân tử phù hợp để xác định sự methyl hóa của gen CCND2 và CDKN2A, tính chất đột biến điểm trên gen ApoB và MTHFR trên quần thể người bệnh ung thư vú, cụ thể như sau:

• Gen mục tiêu: CCND2, CDKN2A, ApoB, MTHFR;

• Số lượng mẫu bệnh phẩm; Số lượng mẫu đối chứng;

• Số mẫu bệnh phẩm hoặc mẫu đối chứng xuất hiện sự methyl hóa gen mục tiêu; đột biến điểm

• Tỷ lệ xuất hiện tính chất methyl hóa trên gen mục tiêu: CCND2, CDKN2A, tỷ lệ xuất hiện đột biến điểm trên gen ApoB, MTHFR;

• Chỉ số tỷ suất chênh (Odds ratio - OR), chỉ số nguy cơ (Relative Risk - RR), … với khoảng tin cậy 95% (confidence intervals - Cis);

• Thông tin mẫu bệnh phẩm: loại mẫu (blood, tissue, …);

• Thông tin bệnh nhân: độ tuổi, quốc tịch, chủng tộc; Đặc điểm bệnh học ung thư vú: giai đoạn bệnh (stage), phân độ mô học (grade), kích thước khối u (tumor size), … Bộ dữ liệu khoa học được đưa vào chọn lọc, trích xuất theo tiến trình như đã đề cập ở sơ đồ Prisma (hình 2.1)

Hình 2.1 Quy trình chọn lọc bài báo trong phân tích tổng hợp

Phương pháp phân tích tổng hợp áp dụng thuật toán Chi bình phương và xác định chỉ số OR (Odds ratio: chỉ số độ chênh) trên mô hình phân tích tổng hợp ảnh hưởng bất biến (Fixed-effects meta- analysis) hoặc mô hình phân tích tổng hợp ảnh hưởng ngẫu nhiên (Random effects meta-analysis) cho một tiêu chí nhị phân (A dichotomous outcome) với khoảng tin cậy 95% (CI) Chỉ số OR phản ánh sự tương quan giữa tính chất methyl hóa vượt mức trên gen CCND2 và CDKN2A và tính chất đột biến điểm trên gen ApoB và MTHFR cụ thể là độ chênh về mức độ methyl hóa, tỷ lệ đột biến trên các gen mục tiêu trên bộ mẫu bệnh ung thư vú và trên bộ mẫu lành Đồng thời, phân tích tổng hợp có thể tiến hành phân tích trên một số đặc điểm bệnh học lâm sàng: phân độ mô học (stage), giai đoạn bệnh (grade), ER (Estrogen receptor), PR (Progesterone receptor), HER2/Neu (Human Epidermal growth factor Receptor),

Sự bất đồng nhất về mức độ methyl hóa và tỷ lệ xuất hiện biến thể (đột biến) gen mục tiêu xét theo từng nghiên cứu thuộc bộ dữ liệu, được biểu thị qua giá trị chỉ số I 2 (Inconsistency, Index of heterogeneity):

Cách xác định chỉ số OR:

Nếu bộ mẫu bệnh phẩm gồm có số mẫu bị methyl hóa/đột biến là a; mẫu không bị methyl hóa/đột biến là b; bộ mẫu chứng (bộ mẫu lành) gồm có số mẫu bị methyl hóa/đột biến là c; mẫu chứng không bị methyl hóa/đột biến d là mẫu thì chỉ số tỷ suất chênh (OR) được xác định theo công thức sau:

Khảo sát trên máy tính (In insilico) gen mục tiêu

Nghiên cứu tập trung thu thập trình tự gen CCND2, CDKN2A, promoter, vị trí các đảo CpG, trên các công trình nghiên cứu trên thế giới: châu Á, châu Âu, châu Mỹ,

… và Việt Nam Đồng thời, dựa vào một số công cụ tin sinh học để cập nhật, tái kiểm tra các thông số của bộ mồi phù hợp với phương pháp Nested - MSP nhằm phân tích tính chất methyl hóa trên vùng promoter gen CCND2 và CDKN2A đối với bệnh ung thư vú

Song song đó thu nhập trình tự exon 26 gen ApoB và exon 8 gen MTHFR trên các công trình nghiên cứu trên thế giới: châu Á, châu Âu, châu Mỹ, …và Việt Nam Đồng thời, dựa vào một số công cụ tin sinh học để cập nhật, tái kiểm tra các thông số của bộ mồi phù hợp với phương pháp PCR nhằm phân tích tính chất đột biến điểm trên gen ApoB và MTHFR đối với bệnh ung thư vú

Khảo sát thực nghiệm

Hình 2.2 Quy trình khảo sát thực nghiệm 2.4.1 Tách chiết DNA bộ gen

Bộ kit Toppure ® DNA Genome Extraction được sử dụng để tách chiết DNA bộ gen người từ các mẫu sinh thiết mô ung thư vú đúc paraffin (danh sách mẫu phụ lục 1) a) Quy trình loại paraffin đối với mẫu mô ung thư vú

Bước 1: Dùng kéo (vô trùng) cắt một phần mô nhỏ, cho mẫu mô vào eppendorf sạch cắt nhuyễn mẫu mô

Bước 2: Bổ sung 500 àl xylene, vortex đều và ly tõm ở 13.000 vũng/1 phỳt Sau đú thu cặn, bỏ dịch nổi

Bước 3: Bổ sung 500 àl xylene và 500 àl Ethanol 99%, vortex đều và ly tõm ở 13.000 vòng/1 phút Sau đó thu cặn, bỏ dịch nổi

Bước 4: Bổ sung 500 àl Ethanol 99%, vortex đều và ly tõm ở 13.000 vũng/1 phỳt Sau đó thu cặn, bỏ dịch nổi

Bước 5: Bổ sung 500 àl Ethanol 70%, vortex đều và ly tõm ở 13.000 vũng/1 phỳt Sau đó thu cặn, bỏ dịch nổi

Bước 7: Bổ sung 500 àl Ethanol 50%, vortex đều và ly tõm ở 13.000 vũng/1 phỳt Sau đó thu cặn, bỏ dịch nổi Để khô trong 30 phút b) Quy trình tách chiết DNA

Bước 1: Mẫu mụ đó đuổi paraffin được bổ sung 200 àl TL buffer và 20 àl dung dịch Proteinase K Vortex đều và ủ ở 60℃ cho đến khi thấy mẫu ly giải hoàn toàn (vortex thường xuyên trong suốt quá trình ủ)

Bước 2: Thờm 200 àl CL buffer, vortex đều và ủ khoảng 10 phỳt ở 60℃

Bước 3: Thờm 200 àl Ethanol (96-100%), trộn đều và chuyển hỗn hợp sang cột silica đặt sẵn trong tube 2 ml Ly tâm ở tốc độ 13.000 vòng/1 phút Giữ lại cột và loại bỏ phần chất lỏng bên dưới

Bước 4: Đặt lại cột vào tube 2 ml cũ Thờm 500 àl WB1 buffer và ly tõm ở tốc độ 13.000 vòng /1 phút Giữ lại cột và loại bỏ phần chất lỏng bên dưới

Bước 5: Đặt lại cột vào tube 2 ml cũ Thờm 500 àl WB2 buffer và ly tõm ở tốc độ 13.000 vòng /1 phút Giữ lại cột và loại bỏ phần chất lỏng bên dưới

Bước 6: Đặt lại cột vào tube 2 ml cũ Làm khô cột bằng cách ly tâm ở tốc độ 13.000 vòng /1 phút

Bước 7: Chuyển cột sang tube 1,5ml mới Thờm 50 àl EB buffer và ủ một phỳt ở nhiệt độ phòng Ly tâm ở tốc độ 13.000 vòng /1 phút, thu phần dịch chứa DNA bên dưới

Bước 8: DNA thu được sử dụng ngay hoặc bảo quản ở -20℃

2.4.2 Kiểm tra chất lượng DNA bộ gen bằng phương pháp đo quang phổ

- Hàm lượng, nồng độ DNA có thể xác định được nhờ sự hấp thu mạnh ánh sáng ở bước sóng 260 nm, thông qua độ hấp thụ (Absorbance) A260 = OD = 50 àg/ml DNA sợi đụi [105] Protein hấp thu ỏnh sỏng mạnh ở bước súng 280 nm, vì vậy tiến hành đo OD ở các bước sóng 260 nm và 280 nm để đánh giá độ tinh sạch của DNA

- Độ tinh sạch của DNA được đánh giá thông qua tỷ lệ A260/A280, dung dịch DNA sạch, không nhiễm protein thường có tỷ lệ A260/A280 =1,8 – 2

- Cụng thức xỏc định nồng độ DNA: C (àg/ml) = 50 x A260 x d

Chú thích: A 260 : độ hấp thụ của dung dịch DNA ở bước sóng 260 nm; A 280 : độ hấp thụ của dung dịch DNA ở bước sóng 280 nm; d: độ pha loãng

Quy trình thực hiện: DNA sau tách chiết được pha loãng bằng nước cất hai lần với tỷ lệ 3 àl DNA với 77 àl nước cất hai lần Sau đú, chuyển tất cả dung dịch vào cuvette và đo nồng độ DNA ở các bước sóng 260 nm và 280 nm

2.4.3 Biến đổi DNA bằng sodium bisulfite với bộ kit EZ DNA Methylation – Gold TM

- Chuẩn bị dung dịch biến đổi EZ1: bổ sung 900 àl dung dịch nước cất 2 lần,

300 àl dung dịch EZ2 và 50 àl dung dịch EZ3 vào ống CT Conversion Reagent, trộn đều trong 10 phút

- Bổ sung 130 àl dung dịch CT Conversion Reagent (EZ1) vào 20 àl dung dịch DNA đó hỳt vào eppendorf 250 àl, trộn đều Sau đú đưa vào chu trỡnh luõn nhiệt như sau: 98 0 C: 10 phút, 64 0 C: 2,5 giờ, 4 0 C: ∞

- Bổ sung 600 àl EZ4 vào cột Zymo-spinTMIC (C1), sau đú thờm dung dịch DNA (đã chạy chu trình nhiệt) vào cột C1, đảo trộn thật đều Sau đó, ly tâm 13.000 vòng/ phút trong 30 giây, ở nhiệt độ phòng Đổ bỏ dung dịch sau ly tâm

- Bổ sung 100 àl EZ5 vào cột C1, ly tõm 13.000 vũng/phỳt trong 30 giõy, ở nhiệt độ phòng Đổ bỏ dung dịch sau ly tâm

- Bổ sung 200 àl EZ6 vào cột C1, để nhiệt độ phũng 15-20 phỳt, ly tõm 13.000 vòng/ phút trong 30 giây Đổ bỏ dung dịch sau ly tâm

- Bổ sung 200 àl EZ5 vào cột C1, ly tõm 13.000 vũng/phỳt trong 30 giõy, ở nhiệt độ phòng (lặp lại 2 lần)

- Đặt cột C1 vào Eppendorf 1,5 ml, thờm 10 àl EZ7, ly tõm 13.000 vũng/phỳt trong 30 giây, ở nhiệt độ phòng

- Thu dung dịch DNA đã được biến đổi bisulfite, bảo quản ở -20 0 C

Nguyên tắc: Phương pháp Nested - MSP, gồm ba phản ứng PCR riêng biệt:

- Phản ứng thứ nhất sử dụng một cặp mồi thứ nhất có tính phổ quát trên vùng trình tự mục tiêu bao quanh các vị trí “hot spot” Sản phẩm PCR lần thứ nhất là mạch khuôn cho hai phản ứng PCR riêng biệt, diễn ra song song

- Phản ứng thứ hai với cặp mồi đặc hiệu với trạng thái allele methyl hóa

- Phản ứng thứ ba với cặp mồi đặc hiệu với trạng thái allele không methyl hóa

Các bước tiến hành: Thực hiện phản ứng PCR với tổng thể tích 50 μl với bộ mồi

Nested - MSP nhằm khuếch đại vùng trình tự promoter gen mục tiêu Thành phần và phản ứng PCR thể hiện trong bảng 2.1

Bảng 2.1 Thành phần phản ứng PCR với bộ mồi Nested - MSP nhằm xác định tính chất methyl hóa trên gen mục tiêu

Chú thích : X: thể tích DNA phù hợp; Y = 50-(25+0,5+0,5+X)

Mồi xuôi (10 μM) 2 Mồi ngược (10 μM) 2 DNA (10 - 100 ng/μl) X Nước cất hai lần Y Tổng thể tích (50μl) 50

Hình 2.3 Chu trình luân nhiệt cho phản ứng Nested – MSP

Chú thích : Ta: nhiệt độ lai tối ưu; x: số chu trình luân nhiệt; NC (Numbers of Cycle): số chu kỳ luân nhiệt

2.4.5 Phản ứng PCR khuếch đai trình tự gen mục tiêu

Nguyên tắc: khuếch đại lượng lớn bản sao từ các chuỗi DNA khuôn, dựa trên sự hoạt động của DNA polymerase để tổng hợp các chuỗi bản sao theo nguyên tắc bán bảo tồn và bắt cặp bổ sung

Các bước tiến hành: Thực hiện phản ứng PCR với tổng thể tích 50 μl với bộ mồi F,

R nhằm khuếch đại vùng trình tự gen mục tiêu Thành phần và phản ứng PCR thể hiện trong bảng 2.2

Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR với bộ mồi F, R nhằm xác định tính chất đột biến điểm trên gen mục tiêu

Chú thích: X: thể tích DNA phù hợp; Y = 50-(25+0,5+0,5+X)

Mồi xuôi (10 μM) 2 Mồi ngược (10 μM) 2 DNA (10 - 100 ng/μl) X Nước cất hai lần Y Tổng thể tích (50μl) 50

Hình 2.4 Chu trình luân nhiệt cho phản ứng PCR

Chú thích : Ta: nhiệt độ lai tối ưu; x: số chu trình luân nhiệt; NC (Numbers of Cycle): số chu kỳ luân nhiệt

Nguyên tắc: Nucleic acid là các phân tử tích điện âm, do đó có khả năng di chuyển về phía cực dương của điện trường Tốc độ di chuyển phụ thuộc vào khối lượng và cấu trúc, sự tích điện của phân tử DNA Các phân tử nucleic acid hiện diện trong bản gel agarose sẽ được ghi lại dưới tia tử ngoại (UV) nhờ chất nhuộm GelRed Kích thước của các phân tử DNA nucleic acid được xác định dựa vào kích thước đã biết trước của thang chuẩn [104]

Các bước tiến hành: Sử dụng khoảng 5 - 10 μl sản phẩm PCR hoặc DNA bộ gen sau tách chiết tiến hành điện di với gel agarose 1,5% ở hiệu điện thế 100 volt trong

30 phút Sau đó, đặt bản gel agarose vào bàn đọc gel Kết quả điện di hiển thị thành các băng sản phẩm sáng trên bản gel với tác động tia UV lên chất nhuộm (GelRed)

Sản phẩm PCR được kiểm tra dựa vào thang chuẩn 50 bp Xem xét băng kích thước sáng rõ, kích thước có đúng với kết quả đã khảo sát Sau đó, sản phẩm khuếch đại được gửi giải trình tự tại công ty trách nhiệm hữu hạn Nam Khoa Biotek Kết quả sau khi giải trình tự được tiến hành so sánh với ngân hàng dữ liệu GenBank

2.4.7 Xác định các dạng biến thể xuất hiện trên vùng trình tự exon 26 gen ApoB và exon 8 gen MTHFR thuộc một số mẫu bệnh phẩm

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

Phân tích tổng hợp về tính chất methyl hóa trên vùng promoter gen CCND2 và CDKN2A, đối với bệnh ung thư vú

CCND2 và CDKN2A, đối với bệnh ung thư vú

Dựa vào nguồn dữ liệu của National Center for Biotechnology Information – NCBI (PubMed, PubMed Central, …), Google scholar, Google, … và sử dụng các từ khóa:

CCND2, CDKN2A, DNA methylation, breast cancer, … được cập nhật đến tháng 07 năm 2020, nghiên cứu này thực hiện việc thu thập và chọn lọc bộ dữ liệu công trình nghiên cứu liên quan đến tính chất methyl hóa vùng promoter gen CCND2 và

CDKN2A Bộ dữ liệu khoa học được đưa vào chọn lọc, trích xuất theo tiến trình như đã đề cập ở sơ đồ Prisma (hình 2.1, bảng 3.1)

Bảng 3.1 Bộ dữ liệu khoa học phân tích tính chất methyl hóa đối với bệnh ung thư vú

Cập nhật đến tháng 07/2020, bộ dữ liệu khoa học về tính chất methyl hóa vùng promoter gen CCND2 và CDKN2A được đưa vào phân tích tổng hợp, bao gồm các công bố khoa học chọn lọc theo các tiêu chí trích xuất dữ liệu (hình 2.1) Trong nội dung phân tích tổng hợp, mô hình phân tích được xác định theo mô hình ảnh hưởng cố định (bất biến) (Fixed effects model, F) hoặc mô hình phân tích ảnh hưởng ngẫu nhiên (Random effects model, R) với khoảng tin cậy 95%CI phù hợp (khoảng giá trị

CI xấp xỉ ≥1) Tiêu chí lựa chọn mô hình dựa vào chỉ số bất đồng nhất (I 2 , Index of Heterogeneity)

Bộ dữ liệu khoa học được đưa vào phân tích tổng hợp gồm có:

Tổng số công bố khoa học

Số lượng công bố/bước thu thập dữ liệu (hình 2.1) a b c d e f g h i

Bộ dữ liệu gen CCND2 37 6 31 5 26 2 24 7 17

Bộ dữ liệu gen CDKN2A 30 6 24 5 19 3 16 2 14

(1) Trong 17 công bố khoa học ca - chứng về gen CCND2 (bảng 3.3), tổng số mẫu bệnh ung thư vú là 1525 mẫu (356 mẫu máu, 1169 mẫu mô) và tổng số mẫu chứng là 573 mẫu (263 mẫu máu, 310 mẫu mô)

(2) Trong 14 công bố khoa học ca chứng về gen CDKN2A (bảng 3.6), tổng số mẫu bệnh ung thư vú là 1361 mẫu (286 mẫu máu, 1075 mẫu mô) và tổng số mẫu chứng là 851 mẫu (349 mẫu máu, 502 mẫu mô)

3.1.1 Tỷ lệ methyl hóa gen mục tiêu trong bộ mẫu ung thư vú và bộ mẫu chứng

Dựa vào giá trị chỉ số bất đồng nhất (I 2 , Index of heterogeneity) biểu thị mức độ khác biệt về tham số được phân tích trong bộ dữ liệu gen CCND2 và CDKN2A là tiêu chí lựa chọn mô hình phân tích tổng hợp Bộ dữ liệu gen CCND2 và CDKN2A thuộc lần lượt 17 và 14 công bố khoa học phản ánh chỉ số bất đồng nhất rất cao (I 2 > 75% và có ý nghĩa thống kê; P < 0,0001), kết quả trình bày phụ lục 2 - phụ lục 13) Do đó, mô hình phân tích ảnh hưởng ngẫu nhiên (Random effects model - R) được áp dụng để xác định chỉ số Proportion nhằm phản ánh tỷ lệ methyl hóa DNA trên từng gen mục tiêu, kết quả thể hiện ở bảng 3.2

Kết quả phân tích chỉ số Proportion nhằm phản ánh tỷ lệ methyl hóa DNA trên gen

CCND2 và CDKN2A cho thấy:

(1) Chỉ số Proportion biểu thị tỷ lệ methyl hóa gen CCND2 trong bộ mẫu ung thư vú và bộ mẫu chứng lần lượt là 51,79% (95%CIA,03 - 62,47; P