Sàng lọc tính chất đột biến điểm nổi trội trên gen low density lipoprotein receptor (ldlr), gen apolipoprotein b – 100 (apob – 100) và gen proprotein convertase subtilisin

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN Tên đề tài : Sàng lọc tính chất đột biến điểm trội gen Low Density Lipoprotein Receptor (LDLR), gen Apolipoprotein B–100 (ApoB–100) gen Proprotein Convertase Subtilisin/Kexin (PCSK9) số mẫu bệnh phẩm có biểu cao cholesterol máu Thành phố Hồ Chí Minh, Tháng Năm 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN Sàng lọc tính chất đột biến điểm trội gen Low Density Lipoprotein Receptor (LDLR), gen Apolipoprotein B–100 (ApoB–100) gen Proprotein Convertase Subtilisin /Kexin (PCSK9) số mẫu bệnh phẩm có biểu cao cholesterol máu Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Mai Phƣơng Khoa: Công nghệ Sinh học Các thành viên: Nguyễn Thị Thùy Vi Đỗ Thị Xuân Trúc Lâm Thị Ngọc Phan Thị Trúc Ly Ngƣời hƣớng dẫn: ThS Trƣơng Kim Phƣợng Thành phố Hồ Chí Minh, Tháng Năm 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI Thông tin chung - Tên đề tài: Sàng lọc tính chất đột biến điểm trội gen Low Density Lipoprotein Receptor (LDLR), Apolipoprotein B–100 (ApoB–100), Proprotein Convertase Subtilisin/ Kexin (PCSK9) số mẫu bệnh phẩm có biểu cao cholesterol máu - Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Mai Phƣơng - Lớp: DH14VS41 Năm thứ: Khoa: Công nghệ Sinh học Số năm đào tạo: - Ngƣời hƣớng dẫn: ThS Trƣơng Kim Phƣợng Mục tiêu đề tài Ứng dụng công cụ tin sinh học công cụ sinh học phân tử (PCR-giải trình tự) xác định tính chất đột biến điểm trội gen LDLR, gen ApoB–100 gen PCSK9 nhằm phản ánh đặc điểm phân tử ngƣời bệnh cao cholesterol máu Việt Nam Cơng trình nghiên cứu tảng phát triển hƣớng tiên lƣợng chẩn đoán sớm bệnh lý cao cholesterol máu có tính chất gia đình ngƣời bệnh Việt Nam Tính sáng tạo - Khảo sát tƣơng quan tính chất đột biến điểm trội gen LDLR, gen ApoB– 100, gen PCSK9 bệnh cao cholesterol máu có tính chất gia đình (Familial Hypercholesterolemia-FH) giới - Bƣớc đầu xây dựng quy trình sinh học phân tử (PCR – giải trình tự) xác định tính chất đột biến điểm trội gen LDLR, gen ApoB–100, gen PCSK9 khả mắc bệnh cao cholesterol máu có tính chất gia đình ngƣời Việt Nam Kết nghiên cứu - Phân tích tổng hợp tính chất đột biến gen LDLR, ApoB–100 PCSK9 xuất bệnh nhân cao cholesterol máu dựa vào liệu khoa học đƣợc công bố giới lần lƣợt 20, 17 12 báo - Bƣớc đầu thực quy trình PCR khuếch đại trình tự exon gen LDLR, exon 26 gen ApoB exon gen PCSK9 số mẫu bệnh phẩm có số cao cholesterol máu đƣợc thu thập số bệnh viện Thành phố Hồ Chí Minh Đóng góp mặt kinh tế - xã hội, giáo dục đào tạo, an ninh, quốc phòng khả áp dụng đề tài Mơ tả tính chất đột biến điểm trội tập trung gen LDLR, gen ApoB–100 gen PCSK9 đặc trƣng quần thể ngƣời Việt Nam có ý nghĩa khoa học thực tiễn, ứng dụng để phát triển công cụ sinh học phân tử phù hợp nhằm tiên lƣợng chẩn đoán sớm bệnh FH ngƣời bệnh Việt Nam Công bố khoa học sinh viên từ kết nghiên cứu đề tài (ghi rõ tên tạp chí có) nhận xét, đánh giá sở áp dụng kết nghiên cứu (nếu có): Ngày tháng năm Sinh viên chịu trách nhiệm thực đề tài (ký, họ tên) Nguyễn Thị Mai Phƣơng Nhận xét ngƣời hƣớng dẫn đóng góp khoa học sinh viên thực đề tài (phần người hướng dẫn ghi): Xác nhận đơn vị (ký tên đóng dấu) Ngày tháng năm Ngƣời hƣớng dẫn (ký, họ tên) Trƣơng Kim Phƣợng BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CỘNG HỒ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc THƠNG TIN VỀ SINH VIÊN CHỊU TRÁCH NHIỆM CHÍNH THỰC HIỆN ĐỀ TÀI I SƠ LƢỢC VỀ SINH VIÊN: Ảnh 4x6 Họ tên: Nguyễn Thị Mai Phƣơng Sinh ngày: 24 tháng 06 năm 1996 Nơi sinh: Thành phố Hồ Chí Minh Lớp: DH14VS41 Khóa: 2014 - 2018 Khoa: Cơng nghệ Sinh học Địa liên hệ: 178/23/15 Huỳnh Văn Lũy, phƣờng Phú Lợi, thành phố Thủ Dầu Một, tỉnh Bình Dƣơng II Q TRÌNH HỌC TẬP (kê khai thành tích sinh viên từ năm thứ đến năm học): * Năm thứ 1: Ngành học: Công nghệ Sinh học Khoa: Công nghệ Sinh học Kết xếp loại học tập: Khá Sơ lƣợc thành tích: Điểm trung bình tích lũy: 7,14 * Năm thứ 2: Ngành học: Công nghệ Sinh học Khoa: Công nghệ Sinh học Kết xếp loại học tập: Khá Sơ lƣợc thành tích: Điểm trung bình tích lũy: 6,84 * Năm thứ 3: Ngành học: Công nghệ Sinh học Khoa: Công nghệ Sinh học Kết xếp loại học tập: Khá Sơ lƣợc thành tích: Điểm trung bình tích lũy: 7,11 * Năm thứ 4: Ngành học: Công nghệ Sinh học Khoa: Công nghệ Sinh học Kết xếp loại học tập: Khá Sơ lƣợc thành tích: Điểm trung bình tích lũy: 7,2 Xác nhận đơn vị (ký tên đóng dấu) Ngày tháng năm Sinh viên chịu trách nhiệm thực đề tài (ký, họ tên) Nguyễn Thị Mai Phƣơng MỤC LỤC DANH MỤC VIẾT TẮT i DANH MỤC BẢNG ii DANH MỤC HÌNH ii ĐẶT VẤN ĐỀ PHẦN 1: TỔNG QUAN 1.1 Bệnh cao cholesterol máu có tính chất gia đình (Familial Hypercholesterolemia - FH) 1.1.1 Tổng quan bệnh cao cholesterol máu có tính chất gia đình 1.1.2 Tiêu chí chẩn đốn bệnh FH 1.2 Tổng quan gen mục tiêu 1.2.1 Gen Low Density Lipoprotein Receptor (LDLR) 1.2.2 Gen Apolipoprotein B (ApoB) 1.2.3 Gen Proprotein Convertase Subtilisin/Kexin-9 (PCSK9) 1.3 Tình hình nghiên cứu tính chất đột biến điểm gen LDLR, gen ApoB gen PCSK9 liên quan đến bệnh cao cholesterol máu có tính chất gia đình 1.3.1 Gen LDLR 1.3.2 Gen ApoB 1.3.3 Gen PCSK9 1.4 Phƣơng pháp xác định tính chất đột biến điểm gen LDLR, gen ApoB gen PCSK9 PHẦN 2: VẬT LIỆU 10 2.1 Các công cụ Tin Sinh học 10 2.2 Các công cụ trực tuyến 10 2.3 Bộ mẫu bệnh phẩm 10 PHẦN 3: PHƢƠNG PHÁP 11 3.1 Khai thác liệu (Data- mining) 11 3.2 Phân tích tổng hợp (Meta - analysis) 11 3.3 Khảo sát thực nghiệm 12 3.3.1 Tách chiết DNA gen mẫu bệnh phẩm (mẫu máu) phƣơng pháp Phenol/Chloroform (Chomczynski & Sacchi, 1987) 12 3.3.2 Xác định chất lƣợng DNA gen phƣơng pháp đo quang phổ: Hàm lƣợng DNA xác định đƣợc nhờ hấp thụ mạnh ánh sáng bƣớc sóng 260nm 12 3.3.3 Thực PCR khuếch đại vùng gen mục tiêu 13 3.3.4 Phƣơng pháp điện di gel agarose 1,5% 13 3.3.5 Giải trình tự 13 PHẦN 4: KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 14 4.1 Kết phân tích tổng hợp tính chất đột biến điểm gen mục tiêu 14 4.1.1 Phân tích tổng hợp tỷ lệ xuất đột biến điểm gen LDLR bệnh cao cholesterol máu có tính chất gia đình 14 4.1.2 Phân tích tổng hợp tỷ lệ xuất đột biến điểm gen ApoB bệnh cao cholesterol máu có tính chất gia đình 17 4.1.3 Phân tích tổng hợp tỷ lệ xuất đột biến điểm gen PCSK9 bệnh cao cholesterol máu có tính chất gia đình 20 4.2 Kết khảo sát thực nghiệm phân tích tính chất đột biến điểm gen LDLR, gen ApoB gen PCSK9 23 4.2.1 Kết tách chiết DNA 23 4.2.2 Kết phản ứng PCR khuếch đại vùng gen mục tiêu: LDLR, ApoB, PCSK9 24 4.2.3 Kết giải trình tự 25 PHẦN KẾT LUẬN - ĐỀ NGHỊ 28 5.1 Kết luận 28 5.1.1 Khai thác liệu 28 5.1.2 Phân tích tổng hợp 28 5.1.3 Kết khảo sát thực nghiệm 29 5.2 Đề nghị 29 DANH MỤC VIẾT TẮT ADH Autosomal Dominant Hypercholesterolemia APOB Apolipoprotein B APOC3 Apolipoprotein C3 ARH Autosomal Recessive Hypercholesterolemia AS-PCR Allele Specific PCR CVD Cardiovascular disease CAD Coronary Artery Disease CHD Coronary Heart Disease DGGE Denaturing Gradient Gel Electrophoresis DLCN Dutch Lipid Clinic Network DNA Deoxyribonucleic Acid FDB Familial Defective Apolipoprotein B FH Familial Hypercholesterolemia HeFH Heterozygous Familial Hypercholesterolemia HoFH Homozygous Familial Hypercholesterolemia LDL Low Density Lipoprotein LDLR Low Density Lipoprotein Receptor LDLRAP1 Low Density Lipoprotein Receptor Adapter Protein MLPA Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification NARC-1 Neural Apoptosis-Regulated Convertase NCBI National Center for Biotechnology Information NIH National Institutes of Health PCR Polymerase Chain Reaction PCSK9 Proprotein Convertase Subtilisin/Kexin PNPLA5 Patatin Like Phospholipase Domain Containing RFLP Retriction Fragment Length Polymorphism RT-PCR Reverse Transcript PCR SSCP Single Strand Conformation Polymorphism WHO World Health Organization i DANH MỤC BẢNG Bảng 4.1 Kết phân tích tính chất đột biến điểm gen LDLR từ cơng trình nghiên cứu đồn hệ Bảng 4.2 Kết phân tích tính chất đột biến điểm số exon thuộc gen LDLR Bảng 4.3 Kết phân tích tƣơng quan tỷ lệ đột biến gen ApoB bệnh FH từ công bố khoa học đoàn hệ Bảng 4.4 Kết phân tích tính chất đột biến điểm gen PCSK9 12 cơng trình nghiên cứu Bảng 4.5 Kết xác định số Proportion phản ánh tỷ lệ đột biến exon thuộc gen PCSK9 Bảng 4.6 Thông tin mồi khuếch đại vùng gen mục tiêu: LDLR, ApoB, PCSK9 Bảng 4.7 Kết xác định vị trí biến thể xuất số mẫu bệnh phẩm DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Gen LDLR định vị nhiễm sắc thể 19 Hình 1.2 Gen ApoB định vị nhiễm sắc thể Hình 1.3 Gen PCSK9 định vị nhiễm sắc thể số Hình 4.1 Kết phân tích tính chất đột biến gen LDLR theo mơ hình phân tích ảnh hƣởng ngẫu nhiên Hình 4.2 Đồ thị ―Funnel plot‖ đánh giá tính thiên vị liệu đồn hệ phân tích tỷ lệ đột biến gen LDLR mẫu bệnh phẩm FH Hình 4.3 Đồ thị ―Forest plot‖ biểu thị tỷ lệ đột biến gen ApoB mẫu bệnh FH Hình 4.4 Đồ thị ―Funnel plot‖ đánh giá tính bất đồng liệu đoàn hệ phân tích tỷ lệ đột biến gen ApoB mẫu bệnh phẩm FH Hình 4.5 Đồ thị Forest plot biểu thị tỷ lệ đột biến gen PCSK9 mẫu bệnh FH Hình 4.6 Đồ thị ―Funnel plot‖ đánh giá tính bất đồng liệu đồn hệ phân tích tỷ lệ đột biến gen PCSK9 mẫu bệnh phẩm ii 75 Yang K C., Su Y N., Shew J Y., Yang K Y., Tseng W K., Wu C C., … & Lee Y T (2007) LDLR and ApoB are major genetic causes of autosomal dominant hypercholesterolemia in a Taiwanese population Journal of the Formosan Medical Association, 106(10), pp 799-807 Taiwan 76 Zwahlen M., Renehan A., … & Egger M (2008, June) Meta-analysis in medical research: potentials and limitations In Urologic Oncology: Seminars and Original Investigations (Vol 26, No 3, pp 320-329) Elsevier PHỤ LỤC Phụ lục 1.1 Tiêu chí chẩn đốn bệnh FH tổ chức DLCN (Nordestgaard et al., 2013) Nhóm Nhóm 1: Tiểu sử gia đình Nhóm 2: Tiền sử lâm sàng Nhóm 3: Kiểm tra thể chất Nhóm 4: Các kết kiểm tra sinh hóa (Nồng độ cholesterol LDL) Nhóm 5: Xét nghiệm di truyền phân tử (phân tích DNA) Tiêu chí Ngƣời có quan hệ huyết thống mắc bệnh tim mạch vành sớm (nam dƣới 55 tuổi, nữ dƣới 69 tuổi) Ngƣời có quan hệ huyết thống có nồng độ cholesterol LDL máu cao 95% theo độ tuổi giới tính quốc gia Ngƣời có quan hệ huyết thống có xuất xanthoma gân và/hoặc cung giác mạc Trẻ em dƣới 18 tuổi có nồng độ cholesterol LDL máu cao 95% theo độ tuổi giới tính quốc gia Đối tƣợng mắc bệnh tim mạch vành sớm (nam dƣới 55 tuổi, nữ dƣới 60 tuổi) Đối tƣợng mắc bệnh động mạch máu não động mạch ngoại vi sớm (nam dƣới 55 tuổi, nữ dƣới 60 tuổi) Xuất xanthoma gân Xuất xanthoma cung giác mạc ngƣời dƣới 45 tuổi Nồng độ cholesterol LDL* >8,5 mmol/L (>325 mg/dL) 6,5-8,4 mmol/L (251-325 mg/dL) 5,0-6,4 mmol/L (191-259 mg/dL) 4,0-4,9 mmol/L (155-190 mg/dL) Xuất đột biến gây bệnh FH gen LDLR, ApoB hay PCSK9 Dựa vào bảng tiêu chí nêu trên, thang điểm xác định bệnh FH DLCN: - Xác định mắc bệnh FH: >8 điểm - Có nguy mắc bệnh FH: 6-8 điểm - Có thể mắc bệnh FH: 3-5 điểm - Khơng mắc bệnh FH: Từ 0-2 điểm Điểm 1 2 8 Phụ lục 1.2 Tiêu chí chẩn đốn bệnh FH Simon Broome (Henderson et al., 2016) Tiêu chí Simon Broome Register Diagnostic Tiêu chí Mơ tả Nồng độ tổng cholesterol 7,5 mmol/L hay nồng độ LDL – C 4,9 mmol/L ngƣời trƣởng thành Nồng độ tổng cholesterol 6,7 mmol/L hay nồng độ LDL – C mmol/L trẻ em dƣới 16 tuổi Xuất xanthomas gan bệnh nhân hay hệ thứ thứ hai gia đình ngƣời bệnh Bằng chứng dựa DNA đột biến gen LDLR hay APOB, PCSK9 Tiền sử gia đình có ngƣời bị nhồi máu tim (MI) trƣớc tuổi 50 hệ thứ hay trƣớc tuổi 60 hệ thứ Tiền sử gia đình có ngƣời có nồng độ tổng cholesterol 7,5 mmol/L hệ thứ thứ hai, hay 6,7 mmol/L trẻ em anh (chị, em) ruột dƣới 16 tuổi Khẳng định FH Thỏa mãn tiêu chí: 1+2 1+3 Có thể mắc bệnh FH Thỏa mãn tiêu chí: 1+4 1+5 Phụ lục 1.3 Tiêu chí chẩn đốn bệnh FH MEDPED (Pecin et al., 2017) Nồng độ Cholesterol tổng ( mmol/L) Tuổi (năm) Thế hệ thứ Thế hệ thứ hai Thế hệ thứ ba bị bị FH bị FH FH