Nghiên cứu chế tạo đột biến điểm nhằm sàng lọc đột biến ở gen ND6 và MTTK liên quan đến bệnh ty thể

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN VÕ THỊ PHƢƠNG NGHIÊN CỨU TẠO ĐỘT BIẾN ĐIỂM NHẰM SÀNG LỌC ĐỘT BIẾN Ở GEN ND6 VÀ MT-TK LIÊN QUAN ĐẾN BỆNH TY THỂ LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN VÕ THỊ PHƢƠNG NGHIÊN CỨU TẠO ĐỘT BIẾN ĐIỂM NHẰM SÀNG LỌC ĐỘT BIẾN Ở GEN ND6 VÀ MT-TK LIÊN QUAN ĐẾN BỆNH TY THỂ Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60 42 01 21 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS TS Nguyễn Thị Hồng Vân Hà Nội – 2015 LỜI CẢM ƠN Với lòng kính trọng biết ơn sâu sắc, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS TS Nguyễn Thị Hồng Vân, người thầy tâm huyết, tận tình dìu dắt, hướng dẫn, khích lệ từ ngày bắt đầu làm quen với khoa học Cô tạo điều kiện tốt giúp hoàn thành luận văn này, dành nhiều thời gian trao đổi chia sẻ với kiến thức, kinh nghiệm nhờ trưởng thành nhiều Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ThS Trần Thị Thùy Anh, người thầy đồng hành, sát cánh suốt trình thực đề tài, đồng thời chia sẻ với nhiều kinh nghiệm quý báu trình học tập sống Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành đến thầy, cô giáo Bộ môn Di truyền học – Trường Đại học Khoa học tự nhiên – ĐHQGHN dạy dỗ, bảo suốt trình học tập làm việc nghiên cứu môn, giúp tiếp cận nhiều kiến thức kĩ thuật Tôi xin gửi lời cảm ơn tới phòng thí nghiệm thuộc Bộ môn Di truyền học, phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme Protein, Trung tâm nghiên cứu Khoa học sống tạo điều kiện trang thiết bị vật chất cho hoàn thành luận văn Cuối cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, anh chị em phòng thí nghiệm môn Di truyền học, giúp đỡ, khích lệ, động viên để có ngày hôm Tôi xin chân thành cảm ơn! Học viên Võ Thị Phƣơng MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH v DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT viii MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1- TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cấu trúc chức ty thể người 1.1.1 Cấu trúc ty thể 1.1.2 Chức ty thể 1.2 Hệ gen ty thể chế di truyền gen ty thể 1.2.1 Hệ gen ty thể 1.2.2 Cơ chế di truyền theo dòng mẹ gen ty thể 10 1.2.3 Heteroplasmy homoplasmy 12 1.3 Đột biến gen ty thể bệnh liên quan 13 1.3.1 Đột biến gen ty thể 13 1.3.2 Một số hội chứng phổ biến đột biến gen ty thể gây 15 1.3.2.1 Hội chứng LHON (Leber’s hereditary optic neuropathy – hội chứng liệt thần kinh thị giác di truyền Leber) 15 1.3.2.2 Hội chứng MERRF (Myoclonic Epilepsy and Ragged Red Fibers – bệnh động kinh co giật với sợi đỏ rải rác) 15 1.3.2.3 Hội chứng MELAS (Mitochodrial encephalomyopathy lactic acidosis and stroke-like episodes – bệnh viêm não giật có tăng axit lactic máu giả tai biến mạch)………………………………………………………………………………16 1.3.2.4 Hội chứng Leigh (Leigh syndrome – bệnh viêm não tủy cấp di truyền theo Leigh)………………………………………………………………………………16 1.4 Gen MT-TK đột biến A8344G, T8356C, G8363A 16 1.4.1 Gen MT-TK 16 1.4.2 Đột biến A8344G, T8356C, G8363A 17 1.5 Gen ND6 đột biến T14484C 18 1.5.1 Gen ND6 18 i 1.5.2 Đột biến T14484C 19 1.6 Một số phương pháp tạo đột biến điểm định hướng 20 1.6.1 Phương pháp Kunkel 20 1.6.2 Tạo đột biến điểm định hướng phương pháp thiết kế vector tái tổ hợp 20 1.6.3 Tạo đột biến điểm định hướng phương pháp PCR 21 1.6.3.1 Sử dụng PCR truyền thống 21 1.6.3.2 Sử dụng Primer extention 21 1.6.3.3 Sử dụng PCR đảo (Inverse PCR) 22 1.7 Một số phương pháp phát đột biến điểm 23 1.7.1 Phát đột biến điểm ADN ty thể PCR- RFLP 23 1.7.2 Phát đột biến điểm ty thể xác định trình tự gen 24 1.7.3 Phát đột biến điểm ty thể phương pháp SSCP (Single-stranded conformational polymorphism) 25 1.8 Tình hình nghiên cứu đột biến ADN ty thể Việt Nam 25 1.9 Mục tiêu nội dung nghiên cứu đề tài 26 1.9.1 Mục tiêu 26 1.9.2 Nội dung nghiên cứu 26 CHƢƠNG – VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1 Đối tượng nghiên cứu 27 2.1.1 Mẫu bệnh phẩm 27 2.1.2 Hóa chất, dụng cụ địa điểm nghiên cứu 27 2.2 Phương pháp nghiên cứu 28 2.2.1 Tách chiết ADN tổng số 28 2.2.1.1 Quy trình tách chiết 28 2.2.1.2 Kiểm tra định lượng ADN tách chiết 29 2.2.2 Nhân đoạn gen từ nucleotide 14455-14578, 8155-8366, 8166-8385, 8342-8582 kĩ thuật PCR (polymerase chain reaction) 29 2.2.3 Kỹ thuật đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn (RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism) 32 ii 2.2.4 Nhân dòng sản phẩm PCR từ khuôn ADN bình thường (không chứa đột biến quan tâm) 34 2.2.4.1 Chuẩn bị tế bào khả biến E.coli DH5α 34 2.2.4.2 Phản ứng gắn đoạn ADN nhân PCR vào vector PTZ57R/T 34 2.2.4.3 Biến nạp phương pháp sốc nhiệt vào tế bào E coli khả biến 35 2.2.4.5 Tách chiết plasmid 38 2.2.4.6 Giải trình tự plasmid nhân dòng 38 2.2.5 Thiết kế đối chứng dương cho phản ứng sàng lọc 38 2.2.5.1 Thiết kế mồi tạo đột biến điểm định hướng 39 2.2.5.2 PCR plasmid chứa đoạn gen 14455-14578; 8155-8366; 8166-8385; 8342-8582 với cặp mồi chứa vị trí đột biến tương ứng 40 2.2.5.3 Đóng vòng sản phẩm PCR sử dụng T4-ligase 42 2.2.5.4 Biến nạp plasmid đóng vòng vào tế bào khả biến E coli DH5α tách chiết plasmid từ khuẩn lạc mang đoạn gen đột biến 42 2.2.6 Sàng lọc kiểm tra có mặt đột biến T14484C, A8344G, T8356C, G8363A 128 mẫu bệnh phẩm 42 2.2.7 Điện di gel agarose 43 2.2.8 Điện di gel polyacrylamide 43 2.2.9 Giải trình tự 44 CHƢƠNG – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45 3.1 Kiểm tra ADN tổng số mẫu bệnh phẩm 45 3.2 Kết nhân PCR đoạn gen từ nucleotide 14455-14578, 81558366, 8166-8385, 8342-8582 45 3.3 Nhân dòng đoạn gen 14455-14578, 8155-8366, 8166-8385, 8342-8582 không chứa đột biến vào vector PTZ57R/T 47 3.3.1 Kiểm tra khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp PCR trực tiếp 47 3.3.2 Tách kiểm tra plasmid mang đoạn gen nhân dòng 49 3.3.3 Giải trình tự đoạn gen 14455-14578, 8155-8366, 8166-8385, 8342-8582 nhân dòng 51 iii 3.3.3.1 Trình tự đoạn gen 14455-14578 51 3.3.3.2 Trình tự đoạn gen 8155-8366 51 3.3.3.3 Trình tự đoạn gen 8166-8385 ngẫu nhiên phát đột biến 9bp gen MT-TK 52 3.3.3.4 Trình tự đoạn gen 8342-8582 54 3.4 Tạo đột biến điểm nhân tạo A8344G, T8356C, G8363A, T14484C 55 3.4.1 PCR plasmid chứa đoạn gen 14455-14578, 8155-8366, 8166-8385, 83428582 với cặp mồi chứa điểm đột biến tương ứng 55 3.4.2 Đóng vòng plasmid dạng thẳng kiểm tra kết biến nạp 56 3.4.3 Kết điện di cắt enzyme giới hạn sản phẩm PCR trực tiếp từ khuẩn lạc 58 3.4.4 Tách kiểm tra plasmid chứa đoạn gen mang đột biến 59 3.4.4.1 Tách plasmid chứa đoạn gen mang đột biến 59 3.4.4.2 Kiểm tra plasmid chứa đoạn gen mang đột biến 60 3.4.5 Giải trình tự plasmid chứa đoạn gen mang đột biến 61 3.4.5.1 Trình tự đoạn gen 14455-14578 có chứa vị trí đột biến T14484C 62 3.4.5.2 Trình tự đoạn gen 8155-8366 có chứa vị trí đột biến A8344G 63 3.4.5.3 Trình tự đoạn gen 8166-8385 có chứa vị trí đột biến T8356C 64 3.4.5.4 Trình tự đoạn gen 8342-8582 có chứa vị trí đột biến G8363A 66 3.5 Khẳng định có mặt đột biến A8344G, T8356C, G8353A, T14484C PCR-RFLP 67 3.5.1 Sàng lọc đột biến T14484C 68 3.5.2 Sàng lọc đột biến A8344G 69 3.5.3 Sàng lọc đột biến T8356C 70 3.5.4 Sàng lọc đột biến G8363A 71 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 73 TÀI LIỆU THAM KHẢO 74 iv DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc ty thể Hình 1.2 Cấu trúc màng ty thể Hình 1.3 Ty thể trình trao đổi lượng tế bào Hình 1.4 Hệ gen ty thể người Hình 1.5 Thuyết nút cổ chai di truyền 12 Hình 1.6 Sơ đồ đột biến gen ty thể liên quan đến số bệnh phổ biến 14 Hình 1.7 Tạo đột biến điểm (thay thế) định hướng sử dụng PCR truyền thống 21 Hình 1.8 Tạo đột biến điểm định hướng sử dụng PCR primer extention 22 Hình 1.9 Tạo đột biến điểm định hướng sử dụng PCR đảo 22 Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu sàng lọc số đột biến gen ND6 MT-TK liên quan đến bệnh đột biến gen ty thể 28 Hình 2.2 Bản đồ vector PTZ57R/T vị trí đa điểm cắt 35 Hình 2.3 Quy trình tạo đột biến điểm định hướng 39 Hình 2.4 PCR plasmid đích với cặp mồi đột biến nối đầu sản phẩm PCR 39 Hình 3.1 Điện di sản phẩm ADN tổng số từ mẫu máu bệnh nhân 45 Hình 3.2 Kết điện di sản phẩm PCR đoạn gen 14455-14578, 8155-8366, 81668385, 8342-8582 46 Hình 3.3 Khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp chứa đoạn gen 14455-14578, 81558366, 8166-8385 8342-8582 47 Hình 3.4 Điện di sản phẩm PCR với cặp mồi đoạn chèn cặp mồi vector 49 Hình 3.5 Kết tách chiết plasmid nhân dòng 50 Hình 3.6 So sánh trình tự đoạn gen 14455-14578 nhân dòng với trình tự gen chuẩn51 Hình 3.7 So sánh trình tự đoạn gen 8155-8366 với trình tự gen chuẩn 52 Hình 3.8 So sánh trình tự đoạn gen 8166-8385 với trình tự gen chuẩn 53 Hình 3.9 So sánh trình tự đoạn gen 8342-8582 với trình tự gen chuẩn 54 Hình 3.10 Kết điện di sản phẩm PCR plasmid đích với cặp mồi tạo đột biến 55 Hình 3.11 Kết điện di sản phẩm PCR trực tiếp kiểm tra khuẩn lạc 57 Hình 3.12 Kết điện di cắt enzyme giới hạn sản phẩm PCR trực tiếp kiểm tra khuẩn lạc với mồi LHTC (A), MRAG (B), MRTC (C), MRGA (D) 59 v Hình 3.13 Kết tách plasmid mang đoạn gen 14455-14578 (A), 8166-8385 (B), 8155-8366 (C), 8342-8582 (D) chứa vị trí đột biến T14484C, A8344G, T8356C, G8363A 60 Hình 3.14 Kết điện di sản phẩm PCR plasmid tách chiết với cặp mồi LHTC, MRTC, MRAG, MRGA M13 61 Hình 3.15 Kết so sánh trình tự plasmid chứa đoạn gen 14455-14578 sau tạo đột biến với trình tự plamid trước tạo đột biến trình tự gen tham chiếu NC_012920.1 62 Hình 3.16 Một phần trình tự tạo đột biến T14484C 63 Hình 3.17 Kết so sánh trình tự plasmid chứa đoạn gen 8155-8366 sau tạo đột biến với trình tự plamid trước tạo đột biến trình tự gen tham chiếu NC_012920.1 63 Hình 3.18 Một phần trình tự tạo đột biến A8344G 64 Hình 3.19 Kết so sánh trình tự plasmid chứa đoạn gen 8166-8385 sau tạo đột biến với trình tự plamid trước tạo đột biến trình tự gen tham chiếu NC_012920.1 65 Hình 3.20 Một phần trình tự tạo đột biến T8356C 65 Hình 3.21 Kết so sánh trình tự plasmid chứa đoạn gen 8342-8582 sau tạo đột biến với trình tự plamid trước tạo đột biến trình tự gen tham chiếu NC_012920.1 66 Hình 3.22 Một phần trình tự tạo đột biến G8363A 67 Hình 3.23 Kết PCR-RFLP mẫu đối chứng âm đối chứng dương đột biến T14484C 68 Hình 3.24 Kết PCR-RFLP mẫu đối chứng âm đối chứng dương đột biến A8344G 69 Hình 3.25 Kết PCR-RFLP mẫu đối chứng âm đối chứng dương đột biến T8356C 70 Hình 3.26 Kết PCR-RFLP mẫu đối chứng âm đối chứng dương đột biến G8363A 71 vi DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các gen hệ gen ty thể Bảng 2.1 Trình tự cặp mồi đặc hiệu cho PCR nhân đoạn ADN gen ND6 MT-TK 30 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR nhân đoạn gen 14455-14578, 81558366, 8166-8385, 8342-8582 31 Bảng 2.3 Chu trình nhiệt kích thước phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu cho đoạn gen 31 Bảng 2.4 Dự đoán sản phẩm phản ứng cắt đoạn ADN với enzyme giới hạn 32 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng cắt enzyme giới hạn 33 Bảng 2.6 Thành phần phản ứng ligase 35 Bảng 2.7 Trình tự mồi M13 36 Bảng 2.8 Thành phần phản ứng PCR với mồi M13 37 Bảng 2.9 Chu trình nhiệt phản ứng PCR với mồi M13 37 Bảng 2.10 Kích thước sản phẩm PCR trực tiếp từ khuẩn lạc với mồi đoạn chèn mồi vector M13 loại đột biến 37 Bảng 2.11 Trình tự mồi oligonucleotide cho PCR tạo đột biến định hướng 40 Bảng 2.12 Thành phần phản ứng PCR plasmid nhân dòng với mồi chứa vị trí đột biến 41 Bảng 2.13 Chu trình nhiệt phản ứng PCR với loại mồi chứa vị trí đột biến 41 Bảng 2.14 Thành phần phản ứng đóng vòng sản phẩm PCR 42 Bảng 2.15 Thành phần gel polyacrylamide 44 vii Bằng phương pháp này, tiền hành kiểm tra sàng lọc có mặt đột biến A8344G 128 mẫu ADN từ bệnh nhân bệnh viện Nhi Trung ương, nhiên không phát mẫu mang đột biến 3.5.3 Sàng lọc đột biến T8356C Mẫu ADN mang đột biến T8356C vị trí nhận biết enzyme giới hạn DraI, không bị cắt enzyme này, giữ nguyên kích thước sản phẩm PCR 220bp Với mẫu không mang đột biến T8356C, enzyme giới hạn DraI nhận biết cắt sản phẩm PCR thành băng có kích thước 192bp 28bp Sản phẩm PCR-RFLP điện di gel agarose 2% để phát có mặt đột biến T8356C phổ băng ADN ánh sáng tia tử ngoại (hình 3.26) Kết điện di hình 3.26 cho thấy, đối chứng dương (mang đột biến T8356C nhân tạo) không bị cắt enzyme giới hạn DraI, có kích thước 220bp Với mẫu ADN không mang đột biến T8356C, sản phẩm PCR bị cắt thành băng có kích thước 192bp 28bp, tính toán lí thuyết Điều cho thấy, điều kiện tối ưu hóa sử dụng phương pháp để sàng lọc đột biến T8356C hệ gen ty thể Hình 3.25 Kết điện di sản phẩm PCR-RFLP từ đoạn gen 8166-8385 mẫu bệnh phẩm M: marker 100bp, ĐC: mẫu đối chứng dương, 1,2,3,4,5,6,7,8: sản phẩm PCR-RFLP từ mẫu ADN bệnh nhân 70 Chúng tiến hành kiểm tra có mặt đột biến T8356C 128 mẫu ADN từ bệnh nhân nghi mắc bệnh ty thể viện Nhi Trung ương, nhiên không phát đột biến 3.5.4 Sàng lọc đột biến G8363A Sự có mặt đột biến G8363A làm vị trí nhận biết enzyme NlaIII, mẫu ADN mang đột biến không bị cắt enzyme giới hạn NlaIII, cho kích thước kích thước sản phẩm PCR, 241bp Với mẫu ADN không mang đột biến này, NlaIII nhận biết cắt thành băng có kích thước 219bp 22bp Sản phẩm PCR-RFLP điện di kiểm tra gel agarose 2% phát đột biến G8363A dựa phổ băng ADN ánh sáng tia tử ngoại Hình 3.26 Kết điện di sản phẩm PCR-RFLP đoạn gen 8342-8582 từ mẫu bệnh phẩm M: marker 100bp, ĐC: mẫu đối chứng dương, 1,2,3,4,5,6,7,8: sản phẩm PCR-RFLP từ mẫu ADN bệnh nhân Kết điện di hình 3.27 cho thấy, đối chứng dương (mang đột biến G8363A nhân tạo) không bị cắt enzyme giới hạn NlaIII, có kích thước 241bp Với mẫu ADN không mang đột biến G8363A, sản phẩm PCR bị cắt thành băng có kích thước 219bp 22bp, tính toán lí thuyết Điều cho thấy, 71 điều kiện tối ưu hóa sử dụng phương pháp để sàng lọc đột biến G8363A hệ gen ty thể Chúng tiến hành sàng lọc đột biến G8363A 128 mẫu ADN từ bệnh nhân nghi mắc bệnh ty thể bệnh viện Nhi Trung ương Tuy nhiên, chưa phát mẫu mang đột biến Kết luận, 128 mẫu ADN tách từ máu ngoại vi bệnh nhân nghi mắc bệnh ty thể kiểm tra có mặt đột biến T14484C, A8344G, T8356C, G8363A phương pháp PCR-RFLP tối ưu hóa điều kiện, nhiên chưa phát đột biến từ mẫu 72 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Đã nhân thành công đoạn gen đích chứa vị trí đột biến quan tâm từ hệ gen ty thể Đã nhân dòng thành công plasmid mang đoạn ADN ty thể bình thường plasmid mangcác vị trí đột biến T14484C, A8344G, T8356C, G8363A Đã khẳng định vị trí đột biến cần tạo PCR-RFLP giải trình tự Đã ứng dụng đột biến tạo vào sàng lọc đột biến Đã phát số đột biến/đa hình trình tự ADN gen MT-TK bao gồm: + đoạn nucleotit (ACCCCCTCT): 9bp (del.8704-8712) gen MT-TK + đa hình gen MT-TK vị trí 8183, T thay A Kiến nghị Sử dụng mẫu mang đột biến nhân tạo T14484C, A8344G, T8356C, G8363A để làm đối chứng dương sàng lọc mẫu bệnh nghi ngờ mang đột biến kỹ thuật PCR-RFLP 73 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Trương Thị Huệ, Phạm Minh Huệ, Lê Ngọc Yến, Phạm Thị Vân Anh, Ngô Diễm Ngọc, Phan Tuấn Nghĩa (2012), “Phát đoạn bp hệ gen ty thể số bệnh nhân nghi hội chứng não”, Tạp chí Sinh học 34 (2), tr 246-252 Trương Thị Huệ, Nguyễn Văn Liệu, Phạm Vân Anh, Nguyễn Thị Vân Anh, Phan Tuấn Nghĩa (2012), “Phát định lượng đột biến A3243G hệ gen ty thể hội chứng MELAS”, Tạp chí Công nghệ Sinh học 10 (3), tr 421-427 Lê Thị Bích Thảo, Đỗ Quỳnh Hoa, Nguyễn Bích Nhi, Nông Văn Hải, Phan Văn Chi, Phạm Thị Vân Anh, Ninh Thị Ứng (2004), “Xác định đột biến A3243G gen tARNLeu ty thể từ bệnh nhân mắc bệnh ty thể”, Báo cáo khoa học Hội nghị khoa học toàn quốc Những vấn đề nghiên cứu khoa học sống, tr 463-465 Phạm Hùng Vân, Hoàng Hiếu Ngọc Võ Quang Hồng Điểm (2010), "Các trường hợp bệnh lý thần kinh nhãn cầu Leber xác định kỹ thuật giải trình tự ADN ty thể tách chiết từ bạch cầu bệnh nhân để phát đột biến gây bệnh", Kỷ yếu hội nghị Sinh học phân tử hóa sinh y học, tr 285-289 Tài liệu tiếng Anh Anderson S., Bankier A.T., Barrell B.G., deBruijin M.H., Coulson A.R., Drouin J., Eperon I.C., Nierlich D.P., Rose B.A., Sanger F., Schreier P.H., Smith A.J.H., Staden R., Young I G (1981), “Sequence and organization of the human mitochondrial genome”, Nature 290, pp 457-465 Ballana E, Govea N, de Cid R, Garcia C, Arribas C, Rosell J and Estivill X (2008), “Detection of unrecognized low-level ADN ty thể heteroplasmy may explain the variable phenotypic expressivity of apparently homoplasmic ADN ty thể mutations”, Human Mutation, 29(2), pp.248-257 Bai R.K., Wong L.J.C (2004), “Detection and quantification of heteroplasmic mutant mitochondrial ADN by real-time amplification refractory mutation system quantitative PCR analysis: A single-step approach”, Clin Chem 50, pp 996–100 Berdanier C D (2005), Mitochondria in healthy and disease, 619 pp Taylor and Francis CRC Press, Boca Raton 74 Chen G, W Li, WD DU, HM Cao, HY Tang, XF Tang, ZW Sun, H Zhao, QH Jin, JL Zhao and XJ Zhang (2008), “Development of a DNA biochip for detection of known mtDNA mutations associated with MELAS and MERRF syndromes”, Yi Chuan, 30(10):1279-86 10 Chinnery P.F (2006) “Mitochondrial ADN in Homo Sapiens”, Nucleic Acids Mol Biol 18, pp 3-11 11 Chinnery P.F., Brown D.T., Andrew R.m., Singh- Kler R, Riordan- Eva P, Lindley J, Applegarth D.A., Turnbull D.M., Howell N (2001), “The mitochondrial ND6 gene is a hot spot for mutations that cause Leber's hereditary optic neuropathy”, Brain, 124(1), pp 209-218 12 Cleveland C H (2010), “Mutation”, Encyclopedia of Earth, National Council for Science and the Environment, Washington DC, 290, 457-65 13 Fawcett D.W (1981), The Cell, W B Saunders Company, NewYork 14 Finnila S, S Tuisku, R Herva, K Majamaa (2001), “A novel mitochondrial DNA mutation and a mutation in the Notch3 gene in a patient with myopathy and CADASIL”, J Mol Med 79, 641-647 15 Genetics Home Reference, National Institute of Health, Retrieved 16 October 2013 16 Giles R.E, H Blanc, H M Cann and D.C Wallace (1980), “Maternal inheritance of human mitochondrial DNA”, Proc Natl Acad Sci USA, 77, 6715–6719 17 Gropman A.L (2004), “The neurological presentations of childhood and adult mitochondrial disease: established syndromes and phenotypic variations”, Mitochondrion 4, pp 503–520 18 Guan M.X (2011), “Mitochondrial 12S rARN mutations associated with aminoglycoside ototoxicity”, Mitochondrion 11, pp 237–245 19 Gvozdjáková A (2008), Mitochondrial medicine, Springer Science + Business Media B.V 20 Helen AL Tuppen, L Emma, Blakely, M Douglass, Turnbull, W Robert W and Taylor (2009), “Mitochondrial ADN mutations and human disease, Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Bioenergetics, Volume 1797, Issue 2, Pages 113–128 21 Ho SN, Hunt HD, Horton RM, et al (1989) Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction Gene, 77(1):51–59 75 22 Ivanova R, A strinidis, V Lepage, S Djoulah, E Wijnen, Vu Trieu An, J Hors and D Charron (1999),“Mitochondrial DNA polymorphism in the Vietnamese population”, J Eur Immunogenet, 26, 417-422 23 Kirby D.M., Milovac T., Thorburn D.R (1998), “A failse -positive diagnosis for the common MELAS (A3243G) mutation caused a novel variant (A3426G) in the ND1 gene mitochondria ADN”, Mol Diagn 3, pp 211-216 24 Klopstock T., P P Yu-Wai-Man, K Dimitriadis, J Rouleau, S Heck, M Bailie, A Atawan, S Chattopadhyay, M Schubert, A Garip, M Kernt, D Petraki, C Rummey, M Leinonen, G Metz, P P G Griffiths, T Meier, P F Chinnery (25 July 2011), “A randomized placebo-controlled trial of idebenone in Leber's hereditary optic neuropathy”, Brain, 134 (9), pp.2677 25 Koga Y., Y Akita, J Nishioka, et al (2007), “MELAS and L-arginine therapy”, Mitochondrion 7, pp 133–139 26 Kunkel T A (1985), “Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection", Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 82 (2), pp.488-492 27 Liu C S., W L Cheng, Y Y Chen, Y.S Ma, C Y Pang and Y H Wei (2005), “High prevalence of the COII/tRNALys intergenic 9-bp deletion in mitochondrial DNA of Taiwanese patients with MELAS or MERRF syndrome”, Ann N.Y Acad Sci., 1042: 82-87 28 Lu C.Y., Tso D.J, Yang T., Jong Y.J., Wei Y.H (2002),“Detection of DNA mutations associated with mitochondrial diseases by Agilent 2100 bioanalyzer”, Clin Chimica Acta 318, pp 97-105 29 Man P Y., D.M Turnbull and P.F Chinnery (2002), “Leber hereditary optic neuropathy”, J Med.Genet, 39, pp.162–169 30 Mingkun Li, Anna Schönberg, Michael Schaefer, Roland Schroeder, Ivane Nasidze and Mark Stoneking (2010), “DetectingHeteroplasmy from HighThroughput Sequencing of Complete Human Mitochondrial DNA Genomes”, The American JouARNl of Human Genetics, 87(2), pp.237–249 76 31 Muyrers J P., Y Zhang and A F StewarT (2001), “Recombinogenic engineering-new options for cloning and manipulating ADN”, Trends Biochem Sci, 26, pp.325-331 32 Naviaux R K (2000), “Mitochondrial ADN disorders” Eur J Pediatr, 159 Suppl 3, S 219-26 33 Nelson D.L., Cox M.M (2008), Lehninger principles of biochemistry, Worth publishers, Inc 34 Nikoskelainen E K., K Huopnen, V Juvonen, et al (1996), “Ophthalmoscopic findings in Leber hereditary optic neuropathy, with special reference to ADN ty thể mutations”, Ophthalmology,103, pp.504-514 35 Ochman H, Gerber AS, and Hartl DL (1988) Genetic applications of an inverse polymerase chain reaction Genetics, 120(3): 621–623 36 Ogle R F., J Christodoulou, E Fagan, et al (1997), “Mitochondrial myopathy with tARN (Leu(UUR)) mutation and complex I deficiency responsive to riboflavin”, J Pediatr 130, pp 138-145 37 Ojala D., Montoya J., Attardi G (1981), “tARN punctuation model of ARN processing in human mitichonria”, Nature 290, pp 470-474 38 Orita, M., Iwahana H., Kanazawa H., Hayashi K., and Sekiya T (1989), “Detection of polymorphisms of human ADN by gel electrophoresis as singlestrand conformation polymorphisms”, Proceedings of the National Academy of Sciences, 86 (8), pp 2766-2770 39 Pavlakis S G., P C Phillips, S DiMauro, D C De Vivo and L P.Rowland (1984), “Mitochondrial myopathy, encephalopathy, lactic acidosis, and strokelike episodes: a distinctive clinical syndrome”, Ann Neurol, 16 (4), pp.481-488 40 Poulton J., Macaulay V., Marchington D.R (1998), “Mitochondrial Genetics 98 is the bottleneck cracked”, Am J Hum Genet 62, pp 752-757 41 Reikofski J and Tao BY (1992),“Polymerase chain reaction (PCR) techniques for site-directed mutagenesis”,Biotechnol Adv, 10(4), pp 535–547 42 Roberta Virgilio, Dario Ronchi, Andreina Bordoni, Elisa Fassone, Sara Bonato, Chiara Donadoni, Giuseppe Torgano, Maurizio Moggio, Stefania Corti, Nereo Bresolin, Giacomo P Comi (2009), “Mitochondrial ADN G8363A mutation in the 77 tARNLys gen: Clinical, biochemical and pathological study”, JouARNl of the Neurological Sciences Volume 281, 85–92 43 Robert W Taylor, Doug M Turnbull (2007), “Mitochondrial ADN mutations in human disease”, Nature Reviews Genetics, 6(5), pp.389-402 44 Rodriguez M C , J R MacDonald, D J Mahoney, G Parise, M F Beal, M A Tarnopolsky (2007), “Beneficial effects of creatine, CoQ10, and lipoic acid in mitochondrial disorders”, Muscle Nerve 35(2), pp 235-42 45 Sambrook J and Rusel D.W (2001), Molecular Cloning: A laboratory manual, 3rd edition, Vol 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press 46 Salvatore Dimauro & Guido Davidzon (2005), “Mitochondrial ADN and disease”, Annals of Medicine, 37: 222–232 47 Schneider A., Marechal-Drouard L (2000) “Mitochondrial tARN import: are there distinct mechanisms?”, Cell Biol 10, pp 509-513 48 Shanskea S., Wong L.J.C.(2004), “Molecular analysis for mitochondrial ADN disorders”, Mitochondrion 4, pp 403-415 49 Shoffner, J M., Wallace, D C (1992), “Mitochondrial genetics: principles and practice” (Editorial) Am J Hum Genet, 51: 1179-1186 50 Tajima H., Sueoka K., Moon S.Y., Nakabayashi A Sakurai T., Murakoshi Y., Watanabe H., Iwata S., Hashiba T., Kato S., Goto Y., Yoshimura Y (2007), “The development of novel quantification assay for mitochondrial DNA heteroplasmy aimed at preimplantation genetic diagnosis of Leigh encephalopathy”, J Assist Reprod Genet 24, pp 227-232 51 Tuppen H A L et al (2010), “Mitochondrial DNA mutations and human disease”, Biochimica et Biophysica Acta1797, pp.113–128 52 Varlamov, D.A., A.P Kudin, S.Vielhaber, et al (2002), “Metabolic consequences of a novel missense mutation of the mtDNA CO I gene”, Hum Mol Genet, 11:1797–1805 53 Wallace DC (1999), “Mitochondrial Diseases in Man and Mouse”, Science, 283: 1482-1488 78 54 Wallace D C., G Singh, M.T Lott, J.A Hodge, T.G Schurr, A.M Lezza, L.J Elsas II and E.K Nikoskelainen (1988), “Mitochondrial ADN mutation associated with Leber's hereditary optic neuropathy”, Science, 242, pp.1427–1430 55 Wong L.J (2007), “Diagnostic challenges of mitochondrial ADN disorders”, Mitochondrion, 7, pp 45–52 56 Wrischnik L.A., R.G Higuchi, M Stoneking, et al (1987), “Length mutations in human mitochondrial DNA: direct sequencing of enzymatically amplified DNA”, Nucleic Acids Res, 15:529–542 57 Yao Y G., W S Watkins and Y P Zhang (2000), “Evolutionary history of the mtDNA 9-bp deletion in Chinese populations and its relevance to the peopling of east and south east Asia”, Hum Genet, 107: 504-512 58 Zhuo G., G Feng, J Leng, L Yu and Y Jiang (2010),“A 9-bp deletion homoplasmy in women with polycystic ovary syndrome revealed by mitochondrial genome-mutation screen”, Biochem Genet, 48: 157-163 Trang web: 59 http://www.med.miami.edu/news/view.asp?id=1098 60 http://www.ifond.org/projects.php3 61 http://cronodon.com/BioTech/Respiration.html 62 http://www.nature.com/scitable/content/a-schematic-illustration-of-the-basicstructural-61487 63 http://www.nature.com/scitable/content/the-mitochondrial-genetic-bottleneck-7260 79 PHỤ LỤC Lí lịch mẫu nghiên cứu Số mẫu STT ID Ngày ng/µl 260/280 260/230 thí nghiệm 121107 2/25/2013 20 120721 20 120905 20 120503 20 121111 20 121123 20 120427 20 120632 20 120616 20 10 WBDNA120419 11 3/12/2013 13.3 1.73 1.09 10 WBDNA120421 13.3 1.77 0.94 11 12 WBDNA120423 13.3 1.85 1.65 12 13 WBDNA120426 13.3 1.77 2.26 13 14 WBDNA120501 13.3 1.89 2.23 14 15 WBDNA120501M 13.3 1.91 2.77 15 16 WBDNA120605 13.3 1.77 1.11 16 17 WBDNA120606 13.3 1.79 1.06 17 18 WBDNA120606F 13.3 1.45 0.57 18 19 WBDNA120606M 13.3 1.73 0.84 19 20 WBDNA120707 13.3 1.85 1.86 20 21 WBDNA120722 13.3 1.9 1.31 21 22 WBDNA120820 13.3 1.86 1.87 22 23 130308 3/22/2013 20 2.03 2.1 23 24 130212 3/22/2013 20 2.05 1.79 24 80 25 121110 3/22/2013 20 1.93 2.64 25 26 130214 3/22/2013 20 1.91 2.02 26 27 130119 3/22/2013 20 1.93 2.03 27 28 130125 3/22/2013 20 1.9 1.89 28 29 130211 3/22/2013 20 1.93 1.95 29 30 130210 3/22/2013 20 1.92 1.96 30 31 130120 3/22/2013 20 1.97 2.17 31 32 130122 3/22/2013 20 1.88 1.93 32 33 130202 3/22/2013 20 1.93 2.23 33 34 130206 3/22/2013 20 1.97 2.5 34 35 130213 3/22/2013 20 1.93 2.12 35 36 130216 3/22/2013 20 1.95 2.09 36 37 130219 3/22/2013 20 1.94 2.04 37 38 130220 3/22/2013 20 1.95 2.34 38 39 130225 3/22/2013 20 1.9 2.13 39 40 130302 3/22/2013 20 1.92 2.12 40 41 130307 3/22/2013 20 1.9 1.91 41 42 130314 3/22/2013 20 1.92 2.13 42 43 130316 3/22/2013 20 1.93 2.3 43 44 130317 3/22/2013 20 1.89 1.82 44 45 130318 3/22/2013 20 1.91 2.39 45 46 130320 3/22/2013 20 1.94 2.12 46 47 130106 3/22/2013 20 1.95 2.57 47 48 130441 5/7/2013 134.66 48 49 121206 4/3/2013 54.2 49 50 130408 5/7/2013 89.17 50 51 120432 4/3/2013 42.49 51 52 120428 4/3/2013 43.86 52 53 130421 5/7/2013 83.49 53 81 54 120504 4/3/2013 83.8 54 55 121124 4/3/2013 101.61 55 56 121226 4/3/2013 108.62 56 57 120517 4/3/2013 66.84 57 58 130406 5/7/2013 94.10 58 59 130331 4/3/2013 78.22 59 60 121220 4/3/2013 68.7 60 61 121224 4/3/2013 86.58 61 62 130330 4/3/2013 87.25 62 63 121229 4/3/2013 67.27 63 64 120433 4/3/2013 59.78 64 65 121205 4/3/2013 48.92 65 66 130409 5/7/2013 89.43 66 67 121006 4/3/2013 62.64 67 68 130321 4/3/2013 60.07 68 69 130430 5/7/2013 42.98 69 70 130418 5/7/2013 38.12 70 71 130306 4/3/2013 57.53 71 72 130335 5/7/2013 85.12 72 73 130324 4/3/2013 59.1 73 74 121121 4/3/2013 122.53 74 75 130338 5/7/2013 120.84 75 76 130413 5/7/2013 112.97 76 77 121010 4/3/2013 125.89 77 78 130328 4/3/2013 42.82 78 79 130337 5/7/2013 106.00 79 80 130436 6/10/2013 21.34 1.69 80 81 130435 6/10/2013 39.38 1.75 81 82 130434 6/10/2013 46.3 1.85 82 82 83 130503 6/10/2013 37.36 1.84 83 84 130437 6/10/2013 19.99 1.72 84 85 130506 6/10/2013 33.29 1.91 85 86 130505 6/10/2013 33.93 1.82 86 87 130512 6/10/2013 24.84 1.9 87 88 130509 6/10/2013 28.92 1.86 88 89 130516 6/10/2013 11.34 1.8 89 90 130513 6/10/2013 53.95 1.86 90 91 130410 5/7/2013 73.45 91 92 121225 4/3/2013 71.02 92 93 120502 4/3/2013 88.42 93 94 130325 4/3/2013 77.48 94 95 130402 5/7/2013 74.30 95 96 121008 4/3/2013 98.85 96 97 130327 4/3/2013 57.79 97 98 130532 5/7/2013 90.66 98 99 13214175 99 100 100 101 5111987 101 102 13007724 102 103 13131416 103 104 12928760 104 105 6089426 105 106 11348906 106 107 13864434 107 108 8230008 108 109 12217400 109 110 13013814 110 111 13120056 111 83 112 13387882 15/2/2014 147 113 13059179 148 114 12087196 149 115 13418080 150 116 10159291 151 117 13434355 152 118 12013516 153 119 13338541 154 120 13070802 155 121 5109798 156 122 12372083 157 123 13867853 158 124 13430825 159 125 13211187 160 126 13954656 161 127 12171769 162 128 13122405 163 84