Sàng lọc và phân tích đặc điểm phân tử các đột biến FLT3 xuất hiện trên bệnh nhân mắc bệnh ung thư bạch cầu cấp dòng tủy ở Việt Nam

Luận văn thạc sĩ Đỗ Thị Thanh Trung ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Đỗ Thị Thanh Trung SÀNG LỌC VÀ PHÂN TÍCH ĐẶC ĐIỂM PHÂN TỬ CÁC ĐỘT BIẾN FLT3 XUẤT HIỆN TRÊN BỆNH NHÂN MẮC BỆNH UNG THƢ BẠCH CẦU CẤP DÒNG TỦY Ở VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2014 Luận văn thạc sĩ Đỗ Thị Thanh Trung ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Đỗ Thị Thanh Trung SÀNG LỌC VÀ PHÂN TÍCH ĐẶC ĐIỂM PHÂN TỬ CÁC ĐỘT BIẾN FLT3 XUẤT HIỆN TRÊN BỆNH NHÂN MẮC BỆNH UNG THƢ BẠCH CẦU CẤP DÒNG TỦY Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS PHẠM BẢO YÊN Hà Nội – Năm 2014 Lời cảm ơn Luận văn thạc sĩ Đỗ Thị Thanh Trung Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Phạm Bảo Yên người tận tình hướng dẫn bảo em suốt trình học tập thực luận văn Em xin chân thành cảm ơn thầy cô Bộ môn Sinh lý thực vật Hóa sinh, khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên tạo điều kiện sở vật chất cho em hoàn thành luận văn Em cảm ơn giúp đỡ tạo điều kiện vật chất trang thiết bị từ Phịng Enzym học Phân tích hoạt tính Sinh học, Phịng thí nghiệm Trọng điểm Cơng nghệ protein enzyme Đề tài thực có hỗ trợ kinh phí đề tài: “Thiết lập quy trình phát số đột biến gen FLT3, NPM1 CEBPA gây bệnh ung thư bạch cầu cấp dòng tủy bệnh nhân Việt Nam” mã số KLEPT.12.02 Phịng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệEnzyme Protein, Đại học Quốc gia Hà Nội Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, bạn bè, người thân bên cạnh động viên, chia sẻ giúp đỡ em Em xin chân thành cảm ơn! Học viên Đỗ Thị Thanh Trung Luận văn thạc sĩ Đỗ Thị Thanh Trung MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Bệnh ung thƣ bạch cầu cấp dòng tủy (Acute Myeloid Leukemia-AML) 1.1.1 Thực trạng bệnh ung thư bạch cầu cấp dịng tủy tình hình nghiên cứu giới Việt Nam 1.1.2 Phân loại thể bệnh ung thư bạch cầu cấp dòng tủy 12 1.1.3 Các phương pháp chẩn đoán bệnh AML 13 1.1.4 Hướng điều trị người bệnh ung thư bạch cầu cấp dòng tủy .14 1.2 Gen FLT3 liên quan tới bệnh bạch cầu cấp dòng tủy 19 1.2.1 Cấu trúc chức gen FLT3 19 1.2.2 Các loại đột biến FLT3 20 1.2.3 Mối liên hệ đột biến gen FLT3 bệnh bạch cầu cấp dòng tủy21 1.2.4 Ý nghĩa việc nghiên cứu gen FLT3 chẩn đoán điều trị AML 22 CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 24 2.1 Nguyên liệu 24 2.1.1 Mẫu máu 24 2.1.2 Các hóa chất kit 24 2.1.3 Máy móc thiết bị 25 2.2 Phƣơng pháp 26 2.2.1 Tách DNA tổng số từ mẫu máu 26 2.2.2 Thiết kế cặp mồi đặc hiệu nhân đoạn gen có đột biến 27 i Luận văn thạc sĩ Đỗ Thị Thanh Trung 2.2.3 Nhân đoạn gen FLT3chứa đột biến với cặp mồi đặc hiệu phản ứng chuỗi polymerase (PCR) 27 2.2.4 Điện di agarose acrylamide để phân tích phổ băng đột biến 28 2.2.6 Nhân dịng đoạn gen FLT3 đọc trình tự gen phương pháp Sanger .28 2.2.7 Một số phần mềm sử dụng luận văn .30 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 31 3.1 Thu thập tách chiết ADN hệ gen từ mẫu máu tổng số 31 3.2 Thiết kế tối ƣu quy trình phát đột biến gen FLT3-ITD 32 3.2.1 Thiết kế trình tự mồi .32 3.2.2 Thiết kế tối ưu quy trình phát đột biến FLT3-ITD 33 3.3 Bƣớc đầu sàng lọc quy mơ phịng thí nghiệm 36 3.4 Kết đƣa sản phẩm PCR vào vectơ tái tổ hợp 37 3.5 Phân tích đặc điểm phân tử đột biến gen FLT3-ITD 40 3.5.1 Số lượng đột biến gen FLT3-ITD mẫu (số đột biến/mẫu) 40 3.5.2 Kích thước đột biến 40 3.5.3 Trình tự đột biến .44 3.5.4 Mức độ đột biến .45 KẾT LUẬN 47 KIẾN NGHỊ 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 ii Luận văn thạc sĩ Đỗ Thị Thanh Trung DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU, HÌNH VẼ DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Trang Bảng 1.1 Giá trị phương pháp hình thái học phương pháp 10 hố tế bào chẩn đốn phân dịng bệnh ung thư bạch cầu cấp Bảng 1.2 Các chất ức chế kinase Tyrosine (TKIs) Cục Quản lý thực phẩm Dược phẩm Mỹ (FDA) phê chuẩn 19 Bảng 2.1 Thành phẩn phản ứng PCR đoạn gen FLT3 28 Bảng 3.1 Nồng độ số mẫu ADN tổng số 31 Bảng 3.2 Số băng có kích thước lớn băng thường mẫu 38 Bảng 3.3 Độ di động băng marker điện di 39 Bảng 3.4 Kích thước đột biến FLT3-ITD 40 Bảng 3.5 Trình tự đột biến đột biến FLT3-ITD 41 Bảng 3.6 Mức độ đột biến mẫu (%) 44 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Trang Hình 1.1 Sự phát sinh loại tế bào máu Hình 1.2 Phân loại bệnh ung thư máu theo tế bào học (WHO2008) 11 Hình 1.3 Tỷ lệ đột biến số gen gây bệnh ung thư bạch 12 cầu cấp (WHO, 2008) Hình 1.4 Cấu trúc phân tử protein FLT3 26 Hình 2.1 Chu trình nhiệt phản ứng PCR 27 Hình 3.1 Ảnh điện di ADN tổng số sau tách 36 Hình 3.2 Quy trình phát đột biến gen FLT3-ITD 37 Hình 3.3 Điện di sản phẩm PCR số mẫu máu 38 Hình 3.4 Điện di số mẫu chứa đột biến FLT3-ITD 39 Hình 3.5 Điện di sản phẩm ADN tinh từ gel 40 Hình 3.6 Kiểm tra ADN khuẩn lạc PCR 44 Hình 3.7 Đường chuẩn xác định kích thước băng điện di 45 Hình 3.8 Trình tự protein số mẫu đột biến 46 iii Luận văn thạc sĩ Đỗ Thị Thanh Trung DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu, chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ Nội dung đầy đủ ALL Acute Lymphoid Leukemia Bạch cầu cấp dòng lympho AML Acute Myeloid Leukemia Bạch cầu cấp dòng tủy AML-NK Acute Myeloid Leukemia normal karyotype Bạch cầu cấp dòng tủy – kiểu hình NST bình thường ATP Adenosine triphosphate Phân tử ATP ATRA All-trans retinoic acid Axit all-trans retinoic BAALC Brain and Acute Leukemia,Cytoplasmic Tên gen CBF Core binding factor Yếu tố bám CEBPA CCAAT-enhancer binding protein α Protein bám vào trình tự tăng cường CCAAT α CLL Chronic Lymphoid Leukemia Bạch cầu mãn dòng lympho CML-BC Chronic Myelogenous Leukemia in Blastic Crisis Bệnh mãn tính dịng tủy thời kì phát bệnh ERG V-Ets Avian Erythroblastosis Virus E26 Tên gen French-American-British Hệ thống phân loại bệnh bạch cầu Pháp-Mỹ-Anh Food & Drug Administration Cục Quản lý thực phẩm Dược phẩm Mỹ FLK2 Fetal liver kinase Tên enzyme FLT3 Fms-like tyrosine kinase Tên enzyme IDH Enzyme isocitrate dehydrogenase Tên enzyme ITD Internal tandem duplication Lặp đoạn ngẫu nhiên nội phân tử JM Juxtamembrane Vùng cận màng KIT v-kit Hardy-Zuckerman feline sarcoma viral oncogene homolog Tên gen MLL Mixed lineage leukemia Bạch cầu FAB FDA iv Luận văn thạc sĩ Đỗ Thị Thanh Trung MM Multiple Myeloma Bệnh ung thư đa dòng tủy xương NPM1 Nucleophosmin Tên gen PCR Polymerase Chain Reaction Chuỗi phản ứng polymerase RFLP Restriction fragment length polymorphism Tính đa hình độ dài đoạn cắt nhờ enzyme giới hạn SSCP Single-strand conformational polymorphism Đa hình cấu trúc mạch đơn STI571 Signal transduction inhibitor 571 Chất ức chế dẫn truyền tín hiệu 571 STK1 Stem cell kinase Kinase tế bào nguồn TKD Tyrosine kinase domain Cấu trúc tyrosine kinase TKIs Tyrosine Kinase Inhibitor Các chất ức chế kinase Tyrosine TM Transmembrane Vùng xuyên màng WHO World health organization Tổ chức y tế giới v Luận văn thạc sĩ Đỗ Thị Thanh Trung MỞ ĐẦU Hiện nay, di truyền học nghiên cứu đặc điểm sinh học cấp độ phân tử (gen hệ gen) ngày xem tiêu chuẩn quan trọng chẩn đoán tiên lượng loại bệnh, có bệnh ung thư bạch cầu Ung thư bạch cầu chia làm loại tùy theo tính chất cấp tính hay mạn tính phân loại tế bào dòng tủy hay dòng lympho Và theo thống kê giới, ung thư bạch cầu cấp dịng tủy (AML) loại có mức độ phổ biến cao bộc phát nhanh nên quan tâm Các bác sĩ thường tiến hành xét nghiệm di truyền bệnh nhân ung thư bạch cầu cấp dòng tủy, nhằm định phác đồ điều trị đặc hiệu cho người bệnh để đạt kết tốt Hầu hết bệnh nhân ung thư bạch cầu cấp dòng tủy đạt tỉ lệ lui bệnh 100% sau đợt điều trị công, 75- 80% lui bệnh hoàn toàn năm phần nhiều số coi chữa khỏi Ung thư bạch cầu cấp dịng tủy có đặc điểm tế bào tăng sinh khơng kiểm sốt, chưa biệt hoá, gọi tế bào non, với đặc điểm tế bào dòng tuỷ Tỷ lệ mắc 1/150.000 suốt thời kỳ niên thiếu dậy Thố ng kê cho thấ y , mỗi năm số bê ̣nh nhân vào Viê ̣n Huyế t h ọc Truyền máu trung ương gia tăng , tổ ng số bê ̣nh nhân bi ̣ung thư máu có tới 2/3 bê ̣nh nhân ung thư ba ̣ch cầ u cấ p dòng tủy Hầu hết trường hợp khơng có ngun nhân rõ ràng Tuy nhiên, số nghiên cứu mối liên quan tỷ lệ mắc bệnh yếu tố liên quan nhiễm phóng xạ, tiếp xúc với hóa chất, kèm theo mắc bệnh khác thiếu máu Fanconi hay hội chứng Down Ngoài ra, ung thư bạch cầu cấp dòng tủy phát sinh thay đổi bất thường (đột biến) tế bào gốc tạo bạch cầu gây đời sống cá thể, làm rối loạn trình sản sinh bạch cầu, tạo nhiều tế bào bạch cầu bất thường, dẫn đến chức bảo vệ thể Nếu khơng chẩn đốn, điều trị kịp thời hiệu quả, bệnh nhân AML tử vong bị nhiễm trùng, chảy máu, thiếu máu Những bệnh nhân phát bệnh ung thư bạch cầu cấp thường điều trị ngay, nhằm tiêu diệt tế bào bạch cầu ác tính để tuỷ xương phục hồi Luận văn thạc sĩ Đỗ Thị Thanh Trung trở lại bình thường Điều trị hố chất phương thức điều trị bệnh ung thư bạch cầu cấp Thông thường, kết hợp thuốc hoá chất (các thuốc steroid) sử dụng theo kế hoạch điều trị (thường gọi phác đồ) Điều trị hóa chất chia làm nhiều giai đoạn: điều trị cơng, điều trị dự phịng thâm nhiễm hệ thần kinh trung ương, điều trị trì Ngồi điều trị hóa chất, bệnh nhân AML điều trị theo số phương pháp khác: ghép tuỷ xương, tia xạ khối u Yếu tố tiên lượng yếu tố quan trọng để xây dựng phác đồ điều trị bệnh nhân có kết di truyền tế bào bình thường Một số yếu tố tiên lượng tốt biến đổi mức độ phân tử (gen ADN) thường xuyên xuất bệnh nhân leukemia cấp dòng tủy, như: đột biến gen NPM1 gen CEBPA Tuy nhiên, có mặt đột biến nhân đoạn gen FLT3 yếu tố tiên lượng xấu Chẩn đốn xác đột biến gây bệnh cơng đoạn mang tính chất định việc đưa tiên lượng phác đồ điều trị cho bệnh nhân Đối với bệnh nhân AML, điều góp phần quan trọng để tăng hiệu chữa bệnh khả sống sót Các đột biến gen thường gặp bệnh nhân AML nghiên cứu nhiều giới, Việt Nam chưa có nghiên cứu nàothống kê đầy đủ loại đột biến tỉ lệ đột biến, nghiên cứu đặc điểm phân tử đột biến Đây thiếu sót lớn việc đưa phương pháp điều trị xác kịp thời Chính vậy, tiến hành đề tài nghiên cứu tập trung vào đột biến gen FLT3 có tên:“Sàng lọc phân tích đặc điểm phân tử đột biến FLT3 xuất bệnh nhân mắc bệnh ung thƣ bạch cầu cấp dòng tủy Việt Nam”với mục tiêu: Thiết lập quy trình sàng lọc đột biến FLT3-ITD bệnh nhân ung thư bạch cầu cấp dòng tủy Bước đầu ứng dụng quy trình xây dựng để sàng lọc đột biến FLT3-ITD bệnh nhân ung thư bạch cầu cấp dịng tủy quy mơ phịng thí nghiệm Luận văn thạc sĩ Đỗ Thị Thanh Trung D.G., Lowenberg B., and Delwel R (2003), “Biallelic mutations in the CEBPA gene and low CEBPA expression levels as prognostic markers in intermediate-risk AML”, Hematology Journal 4(1), pp 31-40 Barry E.V., Clark J.J., Cools J., Roesel J., and Gilliland D.G (2007), “Uniform sensitivity of FLT3 activation loop mutants to the tyrosine kinase inhibitor midostaurin”, Blood, 110 (13), pp 4476-4479 Boonthimat C., Identification of NPM1 mutation and its prognostic impact in thai adult acute myeloid leukemia, in Faculty of Graduate Studies 2008, Mahidol: Mahidol University p 133 10 Busque L and Gilliland D.G (1993), “Clonal evolution in acute myeloid leukemia”, Blood, 82 (2), pp 337-342 11 Cairoli R., Beghini A., Grillo G., Nadali G., Elice F., Ripamonti C.B., Colapietro P., Nichelatti M., Pezzetti L., Lunghi M., Cuneo A., Viola A., Ferrara F., Lazzarino M., Rodeghiero F., Pizzolo G., Larizza L., and Morra E (2006), “Prognostic impact of c-KIT mutations in core binding factor leukemias: an Italian retrospective study”, Blood, 107 (9), pp 3463-3468 12 Clark J.J., Cools J., Curley D.P., Yu J.C., Lokker N.A., Giese N.A., and Gilliland D.G (2004), “Variable sensitivity of FLT3 activation loop mutations to the small molecule tyrosine kinase inhibitor MLN518”, Blood, 104 (9), pp 2867-2872 13 Cools J., Mentens N., Furet P., Fabbro D., Clark J.J., Griffin J.D., Marynen P., and Gilliland D.G (2004), “Prediction of resistance to small molecule FLT3 inhibitors: implications for molecularly targeted therapy of acute leukemia”, Cancer research, 64 (18), pp 6385-6389 14 Dohner K., Schlenk R.F., Habdank M., Scholl C., Rucker F.G., Corbacioglu A., Bullinger L., Frohling S., and Dohner H (2005), “Mutant nucleophosmin (NPM1) predicts favorable prognosis in younger adults with acute myeloid leukemia and normal cytogenetics: interaction with other gene mutations”, Blood, 106 (12), pp 3740-3746 49 Luận văn thạc sĩ 15 Đỗ Thị Thanh Trung Falini B., Mecucci C., Tiacci E., Alcalay M., Rosati R., Pasqualucci L., La Starza R., Diverio D., Colombo E., Santucci A., et al (2005), “Cytoplasmic nucleophosmin in acute myelogenous leukemia with a normal karyotype”, New England Journal of Medicine, 352 (3), pp 254-266 16 Fröhling S., Scholl C., Levine R.L., Loriaux M., Boggon T.J., Bernard O.A., Berger R., Döhner H., Döhner K., Ebert B.L., et al (2007), “Identification of driver and passenger mutations of FLT3 by high-throughput DNA sequence analysis and functional assessment of candidate alleles”, Cancer cell, 12 (6), pp 501-513 17 Gilliland D.G (2003), “FLT3-activating mutations in acute promyelocytic leukaemia: a rationale for risk-adapted therapy with FLT3 inhibitors”, Best Practice & Research Clinical Haematology, 16 (3), pp 409-417 18 Gilliland D.G and Griffin J.D (2002), “Role of FLT3 in leukemia”, Current opinion in hematology, (4), pp 274-281 19 Gilliland D.G and Griffin J.D (2002), “The roles of FLT3 in hematopoiesis and leukemia”, Blood, 100 (5), pp 1532-1542 20 Ho P.A., Alonzo T.A., Gerbing R.B., Pollard J., Stirewalt D.L., Hurwitz C., Heerema N.A., Hirsch B., Raimondi S.C., Lange B., Franklin J.L., Radich J.P., and Meshinchi S (2009), “Prevalence and prognostic implications of CEBPA mutations in pediatric acute myeloid leukemia (AML): a report from the Children's Oncology Group”, Blood, 113 (26), pp 6558-6566 21 Jiang J., Paez J.G., Lee J.C., Bo R., Stone R.M., Deangelo D.J., Galinsky I., Wolpin B.M., Jonasova A., Herman P., Fox E.A., Boggon T.J., Eck M.J., Weisberg E., Griffin J.D., Gilliland D.G., Meyerson M., and Sellers W.R (2004), “Identifying and characterizing a novel activating mutation of the FLT3 tyrosine kinase in AML”, Blood, 104 (6), pp 1855-1858 22 Kelly L.M., Yu J.-C., Boulton C.L., Apatira M., Li J., Sullivan C.M., Williams I., Amaral S.M., Curley D.P., Duclos N., Neuberg D., Scarborough R.M., Pandey A., Hollenbach S., Abe K., Lokker N.A., Gilliland D.G., and 50 Luận văn thạc sĩ Đỗ Thị Thanh Trung Giese N.A (2002), “CT53518, a novel selective FLT3 antagonist for the treatment of acute myelogenous leukemia (AML)”, Cancer cell, (5), pp 421-432 23 Kesarwani M., Huber E., and Azam M (2013), “Overcoming AC220 resistance of FLT3-ITD by SAR302503”, Blood Cancer Journal, 3, pp e138 24 Kim H.-J., Ahn H., Jung C., Moon J., Park C.-H., Lee K.-O., Kim S.-H., Kim Y.-K., Kim H.-J., Sohn S., Kim S., Lee W., Kim K., Mun Y.-C., Kim H., Park J., Min W.-S., Kim H.-J., and Kim D (2013), “KIT D816 mutation associates with adverse outcomes in core binding factor acute myeloid leukemia, especially in the subgroup with RUNX1/RUNX1T1 rearrangement”, Ann Hematol, 92 (2), pp 163-171 25 Kim Y.K., Kim H.N., Lee S.R., Ahn J.S., Yang D.H., Lee J.J., Lee I.K., Shin M.G., and Kim H.J (2010), “Prognostic significance of nucleophosmin mutations and FLT3 internal tandem duplication in adult patients with cytogenetically normal acute myeloid leukemia”, Korean Journal of Hematology, 45 (1), pp 36-45 26 Kiyoi H., Naoe T., Nakano Y., Yokota S., Minami S., Miyawaki S., Asou N., Kuriyama K., Jinnai I., Shimazaki C., Akiyama H., Saito K., Oh H., Motoji T., Omoto E., Saito H., Ohno R., and Ueda R (1999), “Prognostic implication of FLT3 and N-RAS gene mutations in acute myeloid leukemia”, Blood, 93 (9), pp 3074-3080 27 Kiyoi H., Towatari M., Yokota S., Hamaguchi M., Ohno R., Saito H., and Naoe T (1998), “Internal tandem duplication of the FLT3 gene is a novel modality of elongation mutation which causes constitutive activation of the product”, Leukemia, 12 (9), pp 1333-1337 28 Kohler G and Milstein C (1975), “Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity”, Nature, 256 (5517), pp 495497 51 Luận văn thạc sĩ 29 Đỗ Thị Thanh Trung Kronke J., Bullinger L., Teleanu V., Tschurtz F., Gaidzik V.I., Kuhn M.W., Rucker F.G., Holzmann K., Paschka P., Kapp-Schworer S., et al (2013), “Clonal evolution in relapsed NPM1-mutated acute myeloid leukemia”, Blood, 122 (1), pp 100-108 30 Lee B.H., Tothova Z., Levine R.L., Anderson K., Buza-Vidas N., Cullen D.E., Mcdowell E.P., Adelsperger J., Frohling S., Huntly B.J., Beran M., Jacobsen S.E., and Gilliland D.G (2007), “FLT3 mutations confer enhanced proliferation and survival properties to multipotent progenitors in a murine model of chronic myelomonocytic leukemia”, Cancer cell, 12 (4), pp 367380 31 Lin L.I., Chen C.Y., Lin D.T., Tsay W., Tang J.L., Yeh Y.C., Shen H.L., Su F.H., Yao M., Huang S.Y., and Tien H.F (2005), “Characterization of CEBPA mutations in acute myeloid leukemia: most patients with CEBPA mutations have biallelic mutations and show a distinct immunophenotype of the leukemic cells”, Clinical Cancer Research, 11 (4), pp 1372-1379 32 Lu C., Ward P.S., Kapoor G.S., Rohle D., Turcan S., Abdel-Wahab O., Edwards C.R., Khanin R., Figueroa M.E., Melnick A., Wellen K.E., O'rourke D.M., Berger S.L., Chan T.A., Levine R.L., Mellinghoff I.K., and Thompson C.B (2012), “IDH mutation impairs histone demethylation and results in a block to cell differentiation”, Nature, 483 (7390), pp 474-478 33 Ly B.T.K., Chi H.T., Yamagishi M., Kano Y., Hara Y., Nakano K., Sato Y., and Watanabe T (2013), “Inhibition of FLT3 expression by green tea catechins in FLT3 mutated-AML cells”, PLoS ONE, (6), pp 1-9 34 Malek S.N., Update on the molecular biology of myelogenous leukemia: clinical implications 2011: American Society of Clinical Oncology p 231236 35 Marcucci G., Maharry K., Wu Y.Z., Radmacher M.D., Mrozek K., Margeson D., Holland K.B., Whitman S.P., Becker H., Schwind S., et al (2010), “IDH1 and IDH2 gene mutations identify novel molecular subsets within de 52 Luận văn thạc sĩ Đỗ Thị Thanh Trung novo cytogenetically normal acute myeloid leukemia: a Cancer and Leukemia Group B study”, Journal of Clinical Oncology, 28 (14), pp 23482355 36 Meshinchi S and Appelbaum F.R (2009), “Structural and functional alterations of FLT3 in acute myeloid leukemia”, Clinical Cancer Research, 15 (13), pp 4263-4269 37 Meshinchi S., Stirewalt D.L., Alonzo T.A., Boggon T.J., Gerbing R.B., Rocnik J.L., Lange B.J., Gilliland D.G., and Radich J.P (2008), “Structural and numerical variation of FLT3/ITD in pediatric AML”, Blood, 111 (10), pp 4930-4933 38 Murphy K.M., Levis M., Hafez M.J., Geiger T., Cooper L.C., Smith B.D., Small D., and Berg K.D (2003), “Detection of FLT3 internal tandem duplication and D835 mutations by a multiplex polymerase chain reaction and capillary electrophoresis assay”, Journal of Molecular Diagnostic, (2), pp 96-102 39 Nadler L.M., Stashenko P., Hardy R., Kaplan W.D., Button L.N., Kufe D.W., Antman K.H., and Schlossman S.F (1980), “Serotherapy of a patient with a monoclonal antibody directed against a human lymphoma-associated antigen”, Cancer research, 40 (9), pp 3147-3154 40 Nakao M., Janssen J.W., Erz D., Seriu T., and Bartram C.R (2000), “Tandem duplication of the FLT3 gene in acute lymphoblastic leukemia: a marker for the monitoring of minimal residual disease”, Leukemia, 14 (3), pp 522-524 41 Noguera N.I., Ammatuna E., Zangrilli D., Lavorgna S., Divona M., Buccisano F., Amadori S., Mecucci C., Falini B., and Lo-Coco F (2005), “Simultaneous detection of NPM1 and FLT3-ITD mutations by capillary electrophoresis in acute myeloid leukemia”, Leukemia, 19 (8), pp 14791482 53 Luận văn thạc sĩ 42 Đỗ Thị Thanh Trung Pressman D and Korngold L (1953), “The in vivo localization of antiWagner-osteogenic-sarcoma antibodies”, Cancer, (3), pp 619-623 43 Ravandi F., Alattar M.L., Grunwald M.R., Rudek M.A., Rajkhowa T., Richie M.A., Pierce S., Daver N., Garcia-Manero G., Faderl S., et al (2013), “Phase study of azacytidine plus sorafenib in patients with acute myeloid leukemia and FLT-3 internal tandem duplication mutation”, Blood, 121 (23), pp 46554662 44 Renneville A., Roumier C., Biggio V., Nibourel O., Boissel N., Fenaux P., and Preudhomme C (2008), “Cooperating gene mutations in acute myeloid leukemia: a review of the literature”, Leukemia, 22 (5), pp 915-931 45 Schnittger S., Schoch C., Dugas M., Kern W., Staib P., Wuchter C., Loffler H., Sauerland C.M., Serve H., Buchner T., Haferlach T., and Hiddemann W (2002), “Analysis of FLT3 length mutations in 1003 patients with acute myeloid leukemia: correlation to cytogenetics, FAB subtype, and prognosis in the AMLCG study and usefulness as a marker for the detection of minimal residual disease”, Blood, 100 (1), pp 59-66 46 Small D (2006), “FLT3 mutations: biology and treatment”, American Society of Hematology, pp 178-184 47 Steudel C., Wermke M., Schaich M., Schäkel U., Illmer T., Ehninger G., and Thiede C (2003), “Comparative analysis of MLL partial tandem duplication and FLT3 internal tandem duplication mutations in 956 adult patients with acute myeloid leukemia”, Genes, Chromosomes and Cancer, 37 (3), pp 237251 48 Stirewalt D.L., Kopecky K.J., Meshinchi S., Appelbaum F.R., Slovak M.L., Willman C.L., and Radich J.P (2001), “FLT3, RAS, and TP53 mutations in elderly patients with acute myeloid leukemia”, Blood, 97 (11), pp 35893595 49 Stirewalt D.L and Radich J.P (2003), “The role of FLT3 in haematopoietic malignancies”, Nature Reviews Cancer, (9), pp 650-665 54 Luận văn thạc sĩ 50 Đỗ Thị Thanh Trung Tallman M.S (2005), “New strategies for the treatment of acute myeloid leukemia including antibodies and other novel agents”, Hematology / the Education Program of the American Society of Hematology American Society of Hematology Education Program, pp 143-150 51 Thiede C., Steudel C., Mohr B., Schaich M., Schakel U., Platzbecker U., Wermke M., Bornhauser M., Ritter M., Neubauer A., Ehninger G., and Illmer T (2002), “Analysis of FLT3-activating mutations in 979 patients with acute myelogenous leukemia: association with FAB subtypes and identification of subgroups with poor prognosis”, Blood, 99 (12), pp 43264335 52 Vardiman J.W., Harris N.L., and Brunning R.D (2002), “The World Health Organization (WHO) classification of the myeloid neoplasms”, Blood, 100 (7), pp 2292-2302 53 Vardiman J.W., Thiele J., Arber D.A., Brunning R.D., Borowitz M.J., Porwit A., Harris N.L., Le Beau M.M., Hellstrom-Lindberg E., Tefferi A., and Bloomfield C.D (2009), “The 2008 revision of the World Health Organization (WHO) classification of myeloid neoplasms and acute leukemia: rationale and important changes”, Blood, 114 (5), pp 937-951 54 Yamamoto Y., Kiyoi H., Nakano Y., Suzuki R., Kodera Y., Miyawaki S., Asou N., Kuriyama K., Yagasaki F., Shimazaki C., et al (2001), “Activating mutation of D835 within the activation loop of FLT3 in human hematologic malignancies”, Blood, 97 (8), pp 2434-2439 Website: 55 https://www.healthbase.com/hb/cm/leukemia-leukaemia-types-acute-chronicsymptoms-treatment-chemotherapy-radiotherapy-immunotherapy-stem-celltransplant-targeted-therapy-cost-abroad-medical-tourism.html 55 Luận văn thạc sĩ 56 Đỗ Thị Thanh Trung http://www.webmd.com/cancer/tc/leukemia-topic-overview 56 Luận văn thạc sĩ Đỗ Thị Thanh Trung PHỤ LỤC ́ KÊT QUẢ ĐO NANODROP AND TỔNG SỐ MẪU 1-36 STT Mẫu 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 Tỷ lệ 260/280 1.91 1.9 1.97 1.54 1.83 2.11 1.91 2.08 1.6 1.7 1.72 1.71 1.51 2.38 1.88 1.8 1.72 1.73 2.2 2.49 1.95 1.79 1.95 1.85 1.95 1.89 1.63 1.9 1.94 1.49 3.28 1.82 2.22 2.12 1.7 1.24 Tỷ lệ 260/230 0.68 0.77 2.12 2.84 2.44 2.73 3.22 2.58 -2.48 0.37 1.81 2.68 0.65 1.35 1.94 2.07 2.11 2.32 1.57 0.9 0.48 4.07 0.84 1.11 2.12 3.5 0.68 2.27 2.2 0.79 2.11 1.96 -7.47 1.1 0.93 0.84 Nồng độ ng/µL 39.5 54 14.5 4.9 9.7 9.8 9.6 1.9 5.7 12.4 5.5 2.9 4.1 33.2 26 8.9 6.9 7.3 3.6 13.3 7.2 29 15.7 51.4 6.9 3.9 14.1 20.7 4.6 3.3 17.2 4.2 7.2 1.8 0.9 Luận văn thạc sĩ Đỗ Thị Thanh Trung PHỤ LỤC ́ KÊT QUẢ ĐO NANODROP AND TỔNG SỐ MẪU 37-123 STT Mẫu 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 Lần 163.1 156.5 80.5 98.1 96.1 102.9 11.5 84 23.8 123.2 28.2 151.7 121.8 120.2 130 114.9 121.5 128.3 122.5 7.9 117.5 160.1 147.2 151.9 127.3 124.7 149.7 144.7 132.1 119.6 5.6 1.9 206.4 194.1 109.3 170 131.1 Lần 160.7 154.4 78.5 103.9 114.7 125.8 9.2 84.3 24.5 123.9 30.3 150.6 133.8 121.9 126.6 124.9 114.1 136.1 130.7 3.3 123.1 158.6 134.5 154.8 121 116.1 137.5 142.7 122.6 110.2 2.2 -0.3 207.1 184.7 109.6 157.2 141.3 Nồng độ ng/µL 161.9 155.45 79.5 101 105.4 114.35 10.35 84.15 24.15 123.55 29.25 151.15 127.8 121.05 128.3 119.9 117.8 132.2 126.6 5.6 120.3 159.35 140.85 153.35 124.15 120.4 143.6 143.7 127.35 114.9 3.9 0.8 206.75 189.4 109.45 163.6 136.2 Luận văn thạc sĩ 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 Đỗ Thị Thanh Trung 105.8 119.5 158.2 99.5 7.5 114 102.9 100.8 110.1 35.5 92.9 128.3 89.3 122 124.1 49.3 49.9 32.1 48.9 32.5 64.8 83.1 75.1 54.5 50.6 55.4 65.6 46 43.3 31.9 37.6 47.5 60.1 38 69.7 73.7 46.4 34.9 35.2 32.8 61.7 40.2 105.2 114 158.3 100.8 6.4 111.6 101 96.2 100.9 34.9 88.7 115.6 98.3 111.5 124.6 50.4 45.3 32.4 50.4 33.2 62.5 90.5 84.3 56 53.5 54.6 72.3 44.5 47.9 33.8 36.2 46.6 53.3 40.4 67.7 78 41.5 39.4 35.1 31.5 63.8 39.3 105.5 116.75 158.25 100.15 6.95 112.8 101.95 98.5 105.5 35.2 90.8 121.95 93.8 116.75 124.35 49.85 47.6 32.25 49.65 32.85 63.65 86.8 79.7 55.25 52.05 55 68.95 45.25 45.6 32.85 36.9 47.05 56.7 39.2 68.7 75.85 43.95 37.15 35.15 32.15 62.75 39.75 Luận văn thạc sĩ 116 117 118 119 120 121 122 123 Đỗ Thị Thanh Trung 52.6 31.5 31.7 51.5 34.6 33.1 34.9 44 57.8 32.7 35.1 49.5 35.1 33.6 33.2 47.1 55.2 32.1 33.4 50.5 34.85 33.35 34.05 45.55 Luận văn thạc sĩ Đỗ Thị Thanh Trung PHỤ LỤC ́ KÊT QUẢ ĐO NANODROP AND TỔNG SỐ MẪU 124-208 Mẫu 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 Lần 28.60 55.20 113.00 52.50 61.20 77.00 71.10 72.30 57.70 43.60 34.40 49.10 41.70 55.00 53.30 57.00 59.30 41.50 51.10 42.30 45.40 53.10 89.90 54.30 49.80 55.70 114.10 52.70 54.30 54.20 85.00 51.30 52.50 75.60 60.70 149.80 138.60 Lần 32.20 54.20 108.80 57.00 61.20 79.10 77.20 71.10 57.10 41.40 34.70 47.70 42.10 58.10 56.90 58.40 57.90 45.60 47.80 41.90 43.50 54.00 88.00 53.80 46.40 58.80 110.40 52.70 52.40 48.70 77.50 50.10 51.10 74.10 64.20 143.80 140.20 Lần 31.50 51.70 110.80 51.70 62.40 77.90 69.40 70.90 58.10 42.60 31.80 49.20 43.00 56.50 57.40 63.00 59.60 44.70 50.90 42.70 44.70 58.10 90.80 54.00 48.30 57.70 116.60 45.60 52.20 53.00 79.80 50.70 53.60 71.10 64.00 140.40 140.90 Nồng độ ng/µL 30.77 53.70 110.87 53.73 61.60 78.00 72.57 71.43 57.63 42.53 33.63 48.67 42.27 56.53 55.87 59.47 58.93 43.93 49.93 42.30 44.53 55.07 89.57 54.03 48.17 57.40 113.70 50.33 52.97 51.97 80.77 50.70 52.40 73.60 62.97 144.67 139.90 Luận văn thạc sĩ 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 Đỗ Thị Thanh Trung 138.00 56.00 55.60 57.90 71.90 62.60 61.90 55.60 66.40 86.90 65.50 91.80 76.50 24.49 50.30 45.24 54.64 37.74 53.54 33.79 59.50 35.76 68.72 37.44 21.10 31.38 156.44 55.83 38.94 51.38 51.34 60.22 54.59 35.94 29.28 54.56 91.22 80.96 41.03 51.06 136.20 47.79 137.10 55.00 60.90 56.90 68.20 65.60 62.60 57.10 65.00 91.20 67.50 94.20 81.10 29.73 53.88 44.24 53.72 33.59 51.91 35.95 63.10 40.48 75.15 35.73 13.13 28.02 157.66 55.66 43.65 50.67 58.38 61.56 54.91 34.48 33.75 55.93 103.13 79.17 42.30 60.23 140.69 46.74 149.00 56.80 64.70 60.70 68.70 67.90 64.50 66.20 63.70 91.00 64.70 95.40 79.90 24.12 53.36 42.45 67.01 31.89 52.51 37.43 64.25 41.97 63.82 37.22 16.00 27.22 153.63 55.98 32.01 41.87 52.10 62.15 58.03 38.53 32.11 47.27 98.67 79.07 34.28 45.72 132.82 52.17 141.37 55.93 60.40 58.50 69.60 65.37 63.00 59.63 65.03 89.70 65.90 93.80 79.17 26.11 52.51 43.98 58.46 34.41 52.65 35.72 62.28 39.40 69.23 36.80 16.74 28.87 155.91 55.82 38.20 47.97 53.94 61.31 55.84 36.32 31.71 52.59 97.67 79.73 39.20 52.34 136.57 48.90 Luận văn thạc sĩ 203 204 205 206 207 208 Đỗ Thị Thanh Trung 40.92 64.99 75.22 52.90 60.32 69.02 39.60 58.20 73.17 51.92 67.45 72.38 37.09 49.51 71.62 44.37 63.68 67.51 39.20 57.57 73.34 49.73 63.82 69.64 ... phân tử đột biến FLT3 xuất bệnh nhân mắc bệnh ung thƣ bạch cầu cấp dòng tủy Việt Nam? ??với mục tiêu: Thiết lập quy trình sàng lọc đột biến FLT3- ITD bệnh nhân ung thư bạch cầu cấp dịng tủy Bước... thư bạch cầu chia làm bốn loại chính: bệnh ung thư bạch cầu cấp dòng tủy (AML), bệnh ung thư bạch cầu cấp dòng lympho (ALL), bệnh ung thư bạch cầu mãn tính dịng lympho (CLL) ,bệnh ung thư bạch cầu. .. trình xây dựng để sàng lọc đột biến FLT3- ITD bệnh nhân ung thư bạch cầu cấp dòng tủy quy mơ phịng thí nghiệm Luận văn thạc sĩ Đỗ Thị Thanh Trung Phân tích đặc điểm phân tử đột biến FLT3- ITD tìm CHƢƠNG