3.5.1. Số lƣợng đột biến gen FLT3-ITD trong một mẫu (số đột biến/mẫu)
Quan sát hình ảnh điện di cho thấy, có một số mẫu có một băng duy nhất có kích thước lớn hơn băng thường, nhưng có một số mẫu lại có 2 băng có kích thước lớn hơn băng thường. Điều này cũng đã được khẳng định trong nghiên cứu của Meshinchi và cộng sự năm 2008 [36]. Theo đó, 59/77 mẫu chứa một đột biến ITD chiếm 77%, 16/77 chiếm 21 % chứa 2 đột biến ITD và 2/77 (3%) chứa 3 đột biến ITD[36][37]. Như vậy, trong một mẫu có thể có nhiều hơn một đột biến lặp đoạn cùng xuất hiện.Trong đề tài này, số đột biến FLT3-ITD của một mẫu có thể 1 hoặc 2 đột biến, số mẫu có 1 đột biến ITD là 10/15 chiếm tỉ lệ 77%, số mẫu chứa 2 đột biến ITD chiếm tỉ lệ 5/15 ~33%. Mối tương quan giữa số đột biến lặp đoạn và tiên lượng bệnh cần nghiên cứu sâu hơn trong các đề tài tiếp theo.
Bảng 3.2: Số băng có kích thƣớc lớn hơn băng thƣờng trên mẫu
Mẫu 20 53 54 57 60 62 69 71 88 102 112 124 127 146 160
Số
lượng 1 2 1 1 2 1 1 1 2 1 2 1 2 1 1
Quan sát bản gel điệnhình 3.4, có 5 mẫu (53, 60, 88, 112, 127) có 2 băng kích thước lớn hơn băng thường. Trong đó, mẫu 60, và mẫu 88 đã xác định trình tự thành công của 1 trong 2 băng đó (60d và 88t). Vì 2 băng đột biến thường có kích thước rất gần nhau, nên việc tách riêng 2 băng để đọc trình tự thường gặp khó khăn và cần nhiều thời gian hơn.
3.5.2. Kích thƣớc đột biến
Theo kết quả điện di (Hình 3.4), kích thước các băng có khả năng mang đột biến lặp đoạn (ITD)thường nằm trong khoảng 300 – 400 bp, tuy nhiên rất khác nhau. Mà kích thước các đột biến là một yếu tố ảnh hưởng đến chức năng của gen,
cũng như của protein FLT3. Vì vậy, xác định được kích thước đột biến giúp cho quá trình đưa ra tiên lượng chính xác hơn. Để xác định kích thước tương đối của những băng đó, phần mềm semi-log-plotđược sử dụng dựa trên độ di động (Rf) củacác băng trên bản gel điện dikèm marker 100 bp.
Bảng 3.3: Độ di động của các băng của marker trong điện di
Kích thước băng (bp) Log Độ di động Rf (cm)
100.00 2.00 5.39 200.00 2.30 4.54 300.00 2.48 3.96 400.00 2.60 3.54 500.00 2.70 3.18 600.00 2.78 2.89 700.00 2.85 2.64 800.00 2.90 2.43 900.00 2.95 2.25 1000.00 3.00 2.11
Mối tương quan giữa logarit của kích thước băng của marker100 bp với độ di động (Rf) của chúng được thể hiện qua đường chuẩn (Hình 3.7). Sau khi đường chuẩn được xây dựng, công thức đường chuẩn liên hệ giữa độ di động và logarit của kích thước băng cũng được tìm dựa vào phần mềm excel:
Hình 3.7: Đƣờng chuẩn xác định kích thƣớc băng điện di
Kích thước tương đối của các băng đột biến được tính dựavào độ di động (Rf) của các băng điện di chứa đột biến của các mẫu trong cùng một bản gel đó. Kết quả tính toán thể hiện trong bảng 8 cho thấy kích thước các đột biến FLT3-ITD từ 26-73bp. Như vậy, nhận định các băng điện đi của những đoạn ADN có khả năng chứa đột biến có kích thước từ khoảng 300 bp đến khoảng 400 bp là chính xác.
So sánh với một số mẫu đã xác định được kích thước đột biến chính xác rồi có thể thấy rằng kích thước đột biến xác định được bằng phần mềm semi-log-plot thấp hơn so với kích thước thật của nó. Ví dụ như mẫu 20 có kích thước đột biến là 33 bp, nhưng xác định bằng phần mềm này lại cho kết quả 26 bp; mẫu 57 là 51 bp nhưng tính được là 44 bp,… Dựa vào sự chênh lệch đó ta có thể kết luận là đột biến FLT3-ITD có kích thước từ 33 bp đến khoảng 70-90 bp.
y = -0.2972x + 3.6346 R² = 0.9974 0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50 0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 log (kích thƣớ c b ăn g) Độ di động Rf Đƣờng chuẩn log-plot
Bảng 3.4: Kích thƣớc đột biến FLT3-ITD
Mẫu Rf Log Kích thước
băng (bp) Kích thước đột biến (bp) 20 3.64 2.55 356 26 53t 3.52 2.59 388 58 53d 3.39 2.63 423 93 54 3.55 2.58 379 49 57 3.57 2.57 374 44 60t 3.46 2.61 403 73 60d 3.56 2.58 376 46 62 3.59 2.57 370 40 71 3.64 2.55 356 26 88t 3.54 2.58 384 54 88d 3.63 2.56 361 31 102 3.66 2.55 352 22 112 3.58 2.57 372 42
Kết quả nghiên cứu này có sự thống nhất với các kết quả nghiên cứu trên thế giới. Cụ thể là nghiên cứu của Meshinch và cộng sự năm 2008 đã tìm thấy các đột biến FLT3-ITD với độ dài các đột biến phổ biến nhất nằm trong khoảng từ 15-174 bp, chiếm 52% các mẫu đột biến. Cũng trong nghiên cứu đó, tác giả đưa ra nhận định rằng độ dài đột biến có vai trò quan trọng trong việc tiên lượng bệnh, nếu đột biến càng dài càng gây ảnh hưởng đến nhiều phần chức năng của protein FLT3. Điều này chứng tỏ việc nghiên cứu kích thước đột biến là rất quan trọng [37].
3.5.3. Trình tự đột biến
Sau khi phân tích, so sánh với trình tự của gen FLT3 gốc được cung cấp trên Genbank, trình tự chính xác của các đoạn ADN có kích thước lớn hơn 330 bp xác định được bằng quy trình đều giống với trình tự gen FLT3 gốc, tuy nhiên có thêm những đoạn lặp. Những đoạn ADN lặp đoạn này được chèn vào ngay cạnh đoạn gốc ở trong gen (FLT3-ITD). Các trình tự đó được trình bày trong bảng 3.5.
Bảng 3.5: Trình tự đột biến FLT3-ITD
Mẫu Trình tự đột biến Kích thước
20 CGTTGATTTCAGAGAATATGAATATGATCTCAA 33 bp 57 CTCTGAAATCAGTTTCTCTTGGAAACTCCCATTTGAGATCATAT TCATATT 51 bp 60d TTCTCCTCAGATAATGAGTACTTCTACGTTGATTTCAGAGAATA TGAATATGATCTCAAATGG 63 bp 69 TCATATTCTCTGAAATCAACGTAG 24 bp 71 AGTGATGAACGCACTAGCATATGGAGTTATCG 32 bp 88t CTCTGACACCAAACTCTAAATTTTCTCTTGGAAACTCCCATTTG AGATCATATTCATATT 60 bp
Các trình tự ADN trên được chuyển sang trình tự protein bằng cách sử dụng phần mềm BLAST-online, và được so sánh với trình tự protein gốc (Hình 3.8). Kết quả cho thấy các đột biến thường không làm thay đổi khung đọc mở, không làm thay đổi toàn bộ axit amin được mã hóa của mạch mà thường là lặp lại trọn vẹn một đoạn axit amin và chèn ngay vào cạnh đoạn bị lặp đó. Trong đó, điểm thường xảy ra đột biến nhất là giữa axitamin Leucine (L) và Lysine (K) chiếm 5/7 (71,4%) trong các đột biến xác định được. Riêng với mẫu 71, do đọc trình tự gen trực tiếp từ sản phẩm PCR tinh sạch còn một số Nucleotide chưa chính xác, nên trình tự protein chưa thể đưa ra kết luận chính xác được.
Hình 3.8. Trình tự protein một số mẫu chứa đột biến 3.5.4. Mức độ đột biến
Quan sát các băng điện di hình 3.4 cho thấy cường độ sáng của các băng rất khác nhau. Một số mẫu có băng thường có cường độ sáng cao hơn băng đột biến, trong khi, một số mẫu thì băng thường lại có cường độ sáng bằng hoặc thấp hơn băng đột biến. Điều đó cho thấy mức độ đột biến ở các mẫu rất khác nhau. Trong một số nghiên cứu trước đây, mức độ đột biến được định nghĩa là số lượng tế bào
cứu này, mức độ đột biến được tính toán tương đối dựa trên cường độ sáng của băng đột biến và băng thường trên bản gel điện di, sử dụng phần mềm ImmageJ.Mức độ đột biến được thể hiện bằng tỉ lệ phần trăm % cường độ sáng của băng ADN đột biến trên cường độ sáng tổng số (Bảng 3.6). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng 3.6: Mức độ đột biến trên mẫu (%)
Mẫu 20 53 54 57 60 62 69 71 88 102 112 124 127 146 160
% 50 50 35 33 55 30 50 40 70 45 50 50 25 50 50
Bảng 3.6 cho thấy mức độ đột biến ở các mẫu khác nhau là khác nhau, nằm trong khoảng từ 25 – 70%. Ví dụ như mẫu 127, băng đột biến rất mờ so với băng thường, sau tính toán cho thấy mức độ đột biến của mẫu 127 là 25%. Trong khi đó, mẫu 88 có mức độ đột biến rất cao, đạt 70%, đồng thời, mẫu 88 lại có 2 băng đột biến. Sự khác nhau này sẽ ảnh hưởng rất nhiều đến tiên lượng bệnh cho bệnh nhân trong quá trình điều trị.
KẾT LUẬN
1. Đã thiết lập và tối ưu thành công quy trình phát hiện các đột biến trên gen FLT3gây ung thư bạch cầu cấp dòng tủy (đã được chuyển giao cho cơ sở y tế). 2. Sàng lọc quy mô phòng thí nghiệm cho thấy: tỷ lệ mẫu chứa đột biến gen FLT3- ITD là 15/200 mẫu chiếm 7,5% bệnh nhân AML. Số thứ tự của các mẫu đó là 20, 53, 54, 57, 60, 62, 69, 71, 88, 102, 112, 124, 127, 146, 160.
3. Các đột biến FLT3-ITD có kích thước từ 33 bp đến khoảng 70 -90 bp. Đoạn lặp ITD được chèn vào ngay cạnh đoạn gốc trong gen FLT3. Số lượng đột biến FLT3- ITD trong mỗi mẫu là từ 1-2 đột biến, tỉ lệ mẫu có 2 đột biến là 5/15 (33,3%).Mức độ đột biến ở các mẫu khác nhau là khác nhau, trong khoảng 25 - 70%.
KIẾN NGHỊ
1. Tiếp tục tối ưu quy trình xác định đột biến FLT3 - ITD (độ nhạy, độ chính xác, độ đặc hiệu của PCR...)
2. Tiến hành sàng lọc và phân tích các đột biến FLT3 - ITD trên lượng mẫu lớn hơn nhằm đưa ra con số thống kê có ý nghĩa thực tế hơn.
3. Tối ưu quy trình và sàng lọc các đột biến khác như đột biến FLT3-TKD trên gen FLT3 bằng phương pháp PCR kết hợp với cắt enzyme giới hạn.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Kiều Thị Vân Anh, Vũ Minh Phương, Nguyễn Thiên Lữ, Phạm Quang Vinh
(2012), “Bước đầu nghiên cứu gen NPM1 - muta và FLT3-ITD trên bệnh nhân Lơ xê mi cấp dòng tủy”, Y học Việt Nam, 392, tr.64-68.
2. Trần Thái Bình, Lâm Thị Mỹ (2005). Giá trị phương pháp hình thái học - hoá
tế bào so với phương pháp dấu ấn miễn dịch trong chẩn đoán phân dòng leucemi cấp ở trẻ em. Y học TP. Hồ Chí Minh 9 (Sup.1): 59-64.
3. Nguyễn Phương Liên, Nguyễn Tấn Bỉnh (2007),“Phân loại bệnh bạch cầu cấp
bằng dấu ấn miễn dịch tế bào”,Y học TP. Hồ Chí Minh, 11(1): 34-39
4. Phan Nguyễn Thanh Vân (2013), Ứng dụng kỹ thuật khuếch đại gien khảo sát
các tổ hợp gien thường gặp trong bệnh lý bạch cầu cấp, Luận án tiến sĩ y học, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh.
Tiếng Anh
5. Ammatuna E., Noguera N.I., Zangrilli D., Curzi P., Panetta P., Bencivenga P., Amadori S., Federici G., and Lo-Coco F. (2005), “Rapid detection of nucleophosmin (NPM1) mutations in acute myeloid leukemia by denaturing HPLC”, Clinical chemistry, 51 (11), pp. 2165-2167.
6. Bagrintseva K., Geisenhof S., Kern R., Eichenlaub S., Reindl C., Ellwart J.W., Hiddemann W., and Spiekermann K. (2005), “FLT3-ITD-TKD dual mutants associated with AML confer resistance to FLT3 PTK inhibitors and cytotoxic agents by overexpression of Bcl-x(L)”, Blood, 105 (9), pp. 3679- 3685.
7. Barjesteh Van Waalwijk Van Doorn-Khosrovani S., Erpelinck C., Meijer J.,
D.G., Lowenberg B., and Delwel R. (2003), “Biallelic mutations in the CEBPA gene and low CEBPA expression levels as prognostic markers in intermediate-risk AML”, Hematology Journal 4(1), pp. 31-40.
8. Barry E.V., Clark J.J., Cools J., Roesel J., and Gilliland D.G. (2007), “Uniform sensitivity of FLT3 activation loop mutants to the tyrosine kinase inhibitor midostaurin”, Blood, 110 (13), pp. 4476-4479.
9. Boonthimat C., Identification of NPM1 mutation and its prognostic impact in thai adult acute myeloid leukemia, in Faculty of Graduate Studies. 2008, Mahidol: Mahidol University. p. 133.
10. Busque L. and Gilliland D.G. (1993), “Clonal evolution in acute myeloid leukemia”, Blood, 82 (2), pp. 337-342.
11. Cairoli R., Beghini A., Grillo G., Nadali G., Elice F., Ripamonti C.B., Colapietro P., Nichelatti M., Pezzetti L., Lunghi M., Cuneo A., Viola A., Ferrara F., Lazzarino M., Rodeghiero F., Pizzolo G., Larizza L., and Morra E. (2006), “Prognostic impact of c-KIT mutations in core binding factor leukemias: an Italian retrospective study”, Blood, 107 (9), pp. 3463-3468. 12. Clark J.J., Cools J., Curley D.P., Yu J.C., Lokker N.A., Giese N.A., and (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Gilliland D.G. (2004), “Variable sensitivity of FLT3 activation loop mutations to the small molecule tyrosine kinase inhibitor MLN518”, Blood, 104 (9), pp. 2867-2872.
13. Cools J., Mentens N., Furet P., Fabbro D., Clark J.J., Griffin J.D., Marynen P., and Gilliland D.G. (2004), “Prediction of resistance to small molecule FLT3 inhibitors: implications for molecularly targeted therapy of acute leukemia”, Cancer research, 64 (18), pp. 6385-6389.
14. Dohner K., Schlenk R.F., Habdank M., Scholl C., Rucker F.G., Corbacioglu
A., Bullinger L., Frohling S., and Dohner H. (2005), “Mutant nucleophosmin (NPM1) predicts favorable prognosis in younger adults with acute myeloid leukemia and normal cytogenetics: interaction with other gene mutations”,
15. Falini B., Mecucci C., Tiacci E., Alcalay M., Rosati R., Pasqualucci L., La Starza R., Diverio D., Colombo E., Santucci A., et al. (2005), “Cytoplasmic nucleophosmin in acute myelogenous leukemia with a normal karyotype”,
New England Journal of Medicine, 352 (3), pp. 254-266.
16. Fröhling S., Scholl C., Levine R.L., Loriaux M., Boggon T.J., Bernard O.A., Berger R., Döhner H., Döhner K., Ebert B.L., et al. (2007), “Identification of driver and passenger mutations of FLT3 by high-throughput DNA sequence analysis and functional assessment of candidate alleles”, Cancer cell, 12 (6), pp. 501-513.
17. Gilliland D.G. (2003), “FLT3-activating mutations in acute promyelocytic leukaemia: a rationale for risk-adapted therapy with FLT3 inhibitors”, Best Practice & Research Clinical Haematology, 16 (3), pp. 409-417.
18. Gilliland D.G. and Griffin J.D. (2002), “Role of FLT3 in leukemia”, Current opinion in hematology, 9 (4), pp. 274-281.
19. Gilliland D.G. and Griffin J.D. (2002), “The roles of FLT3 in hematopoiesis and leukemia”, Blood, 100 (5), pp. 1532-1542.
20. Ho P.A., Alonzo T.A., Gerbing R.B., Pollard J., Stirewalt D.L., Hurwitz C., Heerema N.A., Hirsch B., Raimondi S.C., Lange B., Franklin J.L., Radich J.P., and Meshinchi S. (2009), “Prevalence and prognostic implications of CEBPA mutations in pediatric acute myeloid leukemia (AML): a report from the Children's Oncology Group”, Blood, 113 (26), pp. 6558-6566.
21. Jiang J., Paez J.G., Lee J.C., Bo R., Stone R.M., Deangelo D.J., Galinsky I., Wolpin B.M., Jonasova A., Herman P., Fox E.A., Boggon T.J., Eck M.J., Weisberg E., Griffin J.D., Gilliland D.G., Meyerson M., and Sellers W.R. (2004), “Identifying and characterizing a novel activating mutation of the FLT3 tyrosine kinase in AML”, Blood, 104 (6), pp. 1855-1858.
22. Kelly L.M., Yu J.-C., Boulton C.L., Apatira M., Li J., Sullivan C.M., Williams I., Amaral S.M., Curley D.P., Duclos N., Neuberg D., Scarborough R.M., Pandey A., Hollenbach S., Abe K., Lokker N.A., Gilliland D.G., and
Giese N.A. (2002), “CT53518, a novel selective FLT3 antagonist for the treatment of acute myelogenous leukemia (AML)”, Cancer cell, 1 (5), pp. 421-432.
23. Kesarwani M., Huber E., and Azam M. (2013), “Overcoming AC220
resistance of FLT3-ITD by SAR302503”, Blood Cancer Journal, 3, pp. e138.
24. Kim H.-J., Ahn H., Jung C., Moon J., Park C.-H., Lee K.-O., Kim S.-H., Kim
Y.-K., Kim H.-J., Sohn S., Kim S., Lee W., Kim K., Mun Y.-C., Kim H., Park J., Min W.-S., Kim H.-J., and Kim D. (2013), “KIT D816 mutation associates with adverse outcomes in core binding factor acute myeloid
leukemia, especially in the subgroup with RUNX1/RUNX1T1
rearrangement”, Ann Hematol, 92 (2), pp. 163-171.
25. Kim Y.K., Kim H.N., Lee S.R., Ahn J.S., Yang D.H., Lee J.J., Lee I.K., Shin M.G., and Kim H.J. (2010), “Prognostic significance of nucleophosmin mutations and FLT3 internal tandem duplication in adult patients with
cytogenetically normal acute myeloid leukemia”, Korean Journal of
Hematology, 45 (1), pp. 36-45.
26. Kiyoi H., Naoe T., Nakano Y., Yokota S., Minami S., Miyawaki S., Asou N.,
Kuriyama K., Jinnai I., Shimazaki C., Akiyama H., Saito K., Oh H., Motoji T., Omoto E., Saito H., Ohno R., and Ueda R. (1999), “Prognostic implication of FLT3 and N-RAS gene mutations in acute myeloid leukemia”,
Blood, 93 (9), pp. 3074-3080.
27. Kiyoi H., Towatari M., Yokota S., Hamaguchi M., Ohno R., Saito H., and Naoe T. (1998), “Internal tandem duplication of the FLT3 gene is a novel modality of elongation mutation which causes constitutive activation of the product”, Leukemia, 12 (9), pp. 1333-1337.
28. Kohler G. and Milstein C. (1975), “Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity”, Nature, 256 (5517), pp. 495- 497.
29. Kronke J., Bullinger L., Teleanu V., Tschurtz F., Gaidzik V.I., Kuhn M.W., Rucker F.G., Holzmann K., Paschka P., Kapp-Schworer S., et al. (2013), “Clonal evolution in relapsed NPM1-mutated acute myeloid leukemia”,
Blood, 122 (1), pp. 100-108. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
30. Lee B.H., Tothova Z., Levine R.L., Anderson K., Buza-Vidas N., Cullen D.E., Mcdowell E.P., Adelsperger J., Frohling S., Huntly B.J., Beran M., Jacobsen S.E., and Gilliland D.G. (2007), “FLT3 mutations confer enhanced proliferation and survival properties to multipotent progenitors in a murine