Nghiên cứu mới đây của Neil Shal và cộng sự từ chương trình Bệnh máu ác tính ở trung tâm ung thư Henlen Diller Family Comprehensive thuộc UCSF[23], thực hiện trên 8 bệnh nhân bạch cầu được chẩn đoán lâm sàng liên quan đến hợp chất AC220, là chất ức chế FLT3 đầu tiên nghiên cứu. Tất cả 8 bệnh nhân sau lần đầu tiên sử dụng thuốc với AC220 đã lui bệnh. Các nhà nghiên cứu đã phát hiện một hoặc nhiều hơn những đột biến FLT3 phát triển khi xuất hiện sự kháng AC220 trên cả 8 bệnh nhân. Ngày nay, người ta đã tìm thấy nhiều hợp chất có thể điều trị nhắm đích cấu trúc kháng AC220 của FLT3 nhằm tiêu diệt những tế bào ung thư
bạch cầu chứa đột biến[50]. Những kết quả của nghiên cứu này cũng khẳng định những đột biến kháng thuốc ở FLT3 tiêu biểu cho việc điều trị nhắm đích mang lại giá trị cao cho sự phát triển thuốc điểu trị bệnh ung thư bạch cầu cấp dòng tủy trong tương lai.
Đột biến nội lặp đoạn (ITD) của gen FLT3 được tìm thấy từ 3-400bp ở exon 14-15 mã hóa cho vùng cận màng của FLT3[45]. Đột biến điểm của FLT3 xảy ra ở chuỗi nặng ngoài tế bào của vùng tyrosine kinase (TKD), tương đồng với đột biến điểm được tìm thấy ở RTKs khác như c-KIT và FMS[11]. Nhiều nghiên cứu cho thấy đột biến FLT3 là tổn thương di truyền thường gặp nhất ở bệnh nhân AML. Tần số của FLT3/ITD là 15-35%, thêm khoảng 5-10% bệnh nhân mang đột biến điểm FLT3/TKD[16]. Cả 2 loại đột biến FLT3 này gây nên sự hoạt hóa phân tử ligand độc lập của thụ thể và hoạt hóa con đường tín hiệu xuôi dòng. Sự có mặt của đột biến FLT3/ITD liên quan tới hậu quả lâm sàng xấu ở cả bệnh nhân AML trẻ em và người lớn. Đột biến ITD được chỉ ra có liên quan đến 5-10% bệnh nhân mắc hội chứng tăng sinh quá mức tế bào bạch cầu (MDS), vài trường hợp bệnh ALL, trình tự đoạn lặp thuộc exon 14 và đôi khi liên quan đến intron 14 và exon 15[40].
1.2.4. Ý nghĩa của việc nghiên cứu gen FLT3 trong chẩn đoán và điều trị AML
Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã cho thấy, việc xuất hiện đột biến gen FLT3 có khả năng gây ra những phản ứng kháng thuốc, nhằm tự bảo vệ tế bào ung thư chứa các đột biến này[22]. Điều đó làm giảm hiệu quả của việc điều trị cho các bệnh nhân mắc bệnh ung thư bạch cầu, đặc biệt là bệnh AML. Hơn nữa, đối với mỗi loại đột biến gen FLT3 lại có những cơ chế phản ứng lại với thuốc khác nhau. Vì vậy, việc nghiên cứu và tìm ra đột biến gen FLT3 sẽ giúp bác sĩ có những tiên lượng chính xác, và xây dựng phác đồ điều trị phù hợp, mang lại hiệu quả chữa trị tốt nhất cho bệnh nhân[46]. Đồng thời, nhiều loại thuốc tiềm năng ứng dụng trong lâm sàng điều trị bệnh AML liên quan đến đột biến gen FLT3 cũng có thể được phát triển. Tuy nhiên, việc nghiên cứu về đột biến trên gen FLT3 ở bệnh nhân ung thư bạch cầu cấp dòng tủy (AML) chưa có một quy trình chuẩn nào được xây dựng và thử nghiệm với quy mô lớn nhằm đưa ra một con số thống kê về tỉ lệ bệnh có ý
nghĩa, cũng như chưa có một nghiên cứu nào đi sâu vào nghiên cứu các đặc điểm phân tử của các đột biến đó.
CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1. Nguyên liệu
2.1.1. Mẫu máu
* Số lƣợng, phƣơng thức lấy mẫu:
Chọn lọc mẫu : 208 mẫu máu, trong đó có 8 mẫu máu của người thường không mang bệnh (mẫu 37, 38, 39 và mẫu 204 đến 208) và 200 mẫu máu của bệnh nhân đươ ̣c chẩn đoán AML ta ̣i Viê ̣n Huyết ho ̣ c và Truyền máu Trung ương . Tiêu chuẩn chẩn đoán AML: blast trong máu hoă ̣c tủy > 20%, hình thái học và hóa học tế bào thuộc AML (M0-M7 theo tiêu chuẩn FAB ), quần thể blast mang c ác marker dòng tủy. Tiêu chuẩn cho ̣n mẫu: 1-2 ml di ̣ch tủy hoă ̣c máu lấy từ bê ̣nh nhân đã được
chẩn đoánAML. Mẫu máu sau khi lấy về được chia vào các ống eppendorf 1,5ml,
mỗi ống 200µl, được bảo quản ở -20oC.
2.1.2. Các hóa chất và bộ kit
Các hóa chất và bộ kit được đặt mua từ các hãng hóa chất uy tín dành cho nghiên cứu sinh học phân tử.
Hóa chất dùng cho tách chiết plasmid từ vi khuẩn
- Dung dịch I: glucose 50mM, Tris-HCl 25mM pH 8,0, EDTA 10mM pH 8,0
- Dung dịch II (pha trước khi dùng): SDS 10%, NaOH 5N
- Dung dịch III: glacical acetic acid 0,2M, CH3COOK 0,2M pH 4,8
- RNase 10mg/ml
- Phenol bão hòa trong TE, pH 8,0
- Chloroform, Sodium acetat 3M
- Ethanol 99% lạnh (giữ ở -20oC), Ethanol 70% lạnh (giữ ở -20oC)
Hóa chất dùng cho phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction)
- PCR buffer Taq DNA polymerase 10X
- PCR buffer DeepVent DNA polymerase 10X
- Dung dịch MgCl2, MgSO4 25mM
- dNTP 8mM
- Mồi aprE-F-BamHI, aprE-R-SacII, E-anh-R, pAX01-F-seq, pMTL-R
- Nước cất (ddH2O)
Hóa chất dùng cho điện di trên gel agarose
- Agarose (Sigma), Safe View
- Ethidium bromide 10mg/ml,
- Dung dịch điện di TAE (Tris-base, acetic acid, EDTA 500 mM).
- Dung dịch nạp mẫu DNA 6X (orange G 0,2%, xylene cyanol 0,05%,
bromophenol blue 0,09%, glycerol 60% và EDTA 60mM).
Hóa chất dùng trong cảm ứng biểu hiện gen
- Xgal, IPTG 100mM
- Dung dịch TE, Tris 1M
- Môi trường TSA, môi trường LB
- Kháng sinh: ampicillin
2.1.3. Máy móc và thiết bị
Máy móc thiết bị phục vụ cho các thí nghiệm thuộc phòng Enzyme học và phân tích hoạt tính sinh học; phòng Protein tái tổ hợp, thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.
- Máy điều khiển nhiệt theo chu kì PCR PTC-100 (Bio-rad)
- Bộ điện di đứng loại nhỏ Mini-Protean Tetra Cell
- Bộ điện di ngang DNA Horizon 58 (Life Technology)
- Hộp soi đèn tử ngoại Hoefer (UVTM – 19 – 230V)
- Máy ly tâm lạnh (Hettich Centrifugen) - Máy lắc ổn nhiệt (Stualrt Scientific)
- Máy chụp hình gel Imagemaster VDS (Amersham Biosciences)
- Nồi hấp khử trùng Autoclave (SS325-TOMY)
- Máy Vortex (IKA, Mỹ)
- Máy đo pH (Orion, Anh)
- Tủ ấm Memmert (Đức), Tủ sấy Memmert (Đức)
- Tủ cấy vô trùng Class II (Mỹ)
- Bể ổn nhiệt (Memmert)
- Cân kỹ thuật Ohaus (Mỹ), Cân phân tích Precica (Thụy Sỹ)
- Máy khuấy từ gia nhiệt Bibby (Anh )
- Tủ mát 4oC (Nhật ), Tủ lạnh -20oC (Nhật )
2.2. Phƣơng pháp
2.2.1. Tách DNA tổng số từ mẫu máu
Để thu được DNA tổng số, các mẫu máu được xử lý bằng bộ kit “DNA Blood mini kit” của hãng Qiagen. Mẫu máu khi thu về được chia vào các ống eppendorf 1,5ml, mỗi ống chứa 200µl mẫu.
Đầu tiên, mẫu máu tổng số được loại bỏ các thành phần không phải tế bào như protein và phá vỡ tế bào bằng 20µl QIAGEN Protease (or proteinase K), 200µl đệm ALủ mẫu ở 56oC trong 10 phút.
Sau đó, ly tâm nhẹ, bỏ dịch nổi và chuyển vào cột QIAamp mini, bổ sung Ethanol 96o. Tiếp tục ly tâm ở 6000g (8000 rpm) / phút, bỏ dịch và rửa tủa 2 lần với 500µl đệm AW1, và 500µl đệm AW2 trong vòng 3 - 5 phút.
Cuối cùng, bổ sung 100 µl nước đã loại bỏ enzyme phân hủy ADN vào cột, ủ ở nhiệt độ phòng (15-25oC) 1 phút, sau đó ly tâm ở 6000 g(8000 rpm) trong 1 phút, thu dịch trong ống eppendorf.
Mẫu ADN tổng số sau khi thu được sẽ điện di kiểm tra trên gel agarose 1%, và đo nồng độ bằng máy đo phổ hấp thụ (nanodrop). Sau đó, được bảo quản ở - 20oC.
2.2.2. Thiết kế cặp mồi đặc hiệu nhân bản đoạn gen có đột biến
Mồi trong phản ứng sao chép DNA là những trình tự RNA ngắn được tổng hợp bởi enzyme Primase; còn mồi trong sinh học phân tử là những đoạn oligonucleotide ngắn được tổng hợp hóa học.
2.2.3. Nhân đoạn gen FLT3chứa đột biến với cặp mồi đặc hiệu bằng phản ứng chuỗi polymerase(PCR)
DNA tổng số được sử dụng làm khuôn trong phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu tương ứng của gen FLT3. Chu trình nhiệt của phản ứng đã tối ưu như sau:
Hình 2.1: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
Mỗi phản ứng PCR gồm các thành phần theo bảng 3 bổ sung thêm 3µl DNA tổng số. Trong đó, các mẫu ADN tổng số được pha về nồng độ ADN trong khoảng từ 40-50 ng/µl. Quá trình thao tác thực hiện trong điều kiện sạch (có thể vô trùng), sau đó nhanh chóng đạt mẫu vào trong máy gia nhiệt PCR.
35 chu kì 94oC 1 phút 56oC 30 giây 72oC 1 phút 72oC 10 phút 94oC 5 phút 4oC
Bảng 2.1: Thành phẩn của phản ứng PCR đoạn gen FLT3 Thành phần Thể tích 1 phản ứng (µl) H20 14.8 Buffer 2.5 dNTPs 2.5 Mồi xuôi 1 Mồi ngược 1 Taq 0.1
2.2.4. Điện di agarose hoặc acrylamide để phân tích phổ băng đột biến
Sản phẩm PCR đoạn gen FLT3 được chạy điện di trên gel agarose 2% trong đệm TAE 1x, hiệu điện thế 100V trong thời gian 40 phút đối với bể lớn; và hiệu điện thế 90V trong khoảng 30 phút đối với bể nhỏ.
Đệm TAE 1x có thành phần như sau: Tris HCl 4.48g, EDTA 0.5M (pH 8.0) 2ml, acetic acid 1.14ml, nước cất vừa đủ 1 lít. Hòa tan 2g bột agarose trong 100ml đệm TAE 1x để cho gel agarose 2%.
Sau khi điện di xong, bản gel được nhuộm với dung dịch ethidium bromide 1% trong 5-10’ và soi dưới đèn UV của máy soi gel.
Ngoài điện di agarose 2%, tùy theo mục đích, có thể điện di với một số loại gel agarose khác như: agarose metaphor 3%, gel acrylamide 12%...
2.2.6. Nhân dòng đoạn gen FLT3 và đọc trình tự gen bằng phƣơng pháp Sanger
Sau khi điện di, băng ADN có sự chênh lệch kích thước được xác định và cắt riêng ra khỏi bản gel. Sử dụng bộ kít tinh sạch gel của promega, ta sẽ thu được ADN chứa đột biến FLT3. Sản phẩm tinh sạch của băng điện di đột biến gen FLT3 được đưa vào vector pGEM-T Easy thông qua bộ kit “pGEM-T Easy Vector System” của hãng Promega. Phản ứng ligate gồm các thành phần: Enzyme T4 ligase; Đệm của T4 ligase, ADN thôi gel.
Tiếp theo, vector tái tổ hợp được biến nạp vào tế bào khả biến DH5α và nuôi cấy trên môi trường chọn lọc TSA-ampicilin được trải IPTG và X-gal. Nuôi cấy qua một đêm, sau đó, lựa chọn những khuẩn lạc màu trắng mang PCR và điện di agarose 2% nhằm khẳng định kết quả biến nạp.
Chọn những khuẩn lạc có plasmid chứa đoạn gen FLT3 đột biến, nuôi qua đêm trong môi trường LB-ampicillin lỏng. Tinh sạch plasmid từ thể biến nạp thành công và gửi đi giải trình tự ở một số cơ sở.
* Đọc trình tự bằng phƣơng pháp Sanger
Trong phương pháp này, ddNTP(dideoxyribonucleoside triphosphate) tức dNTP mà phân tử được của nó thiếu nhóm 3’- OH được sử dụng. Trong phản ứng tổng hợp PCR, phân tử này vẫn gắn vào gốc của dNTP trước đó bằng liên kết phosphodiester nhưng do không có gốc 3’- OH nên không thể tạo liên kết mới với bất kỳ phân tử dNTP nào khác do đó, phản ứng tổng hợp DNA chấm dứt tại đây.
Trong phản ứng tổng hợp DNA, ngoài dNTPs, cho thêm vào hỗn hợp một dẫn xuất ddNTP, ví dụ thay dATP bằng ddATP, quá trình tổng hợp dừng lại khi ddATP gắn vào sợi DNA đang kéo dài. Như vậy trong hỗn hợp phản ứng sau cùng sẽ thu được nhiều phân tử DNA có độ dài khác biệt và tất cả cúng đều chấm dứt tại vị trí A (do việc gắn ddATP thay vì dATP là ngẫu nhiên). Các sản phầm có độ dài khác nhau này có thể phân biệt và quan sát trên gel polyacrylamide biến tính. Kết quả trên trường điện di là các vạch có chiều dài khác nhau và đều có vị trí tận cùng là T trên sợi khuôn. Phản ứngdiễn ra tương tự với ddGTP, ddTTP và ddCTPtạo ra 4 trường điện di và suy ra trình tự sợi khuôn DNA.
Trong thực tế, các ddNTP này thường được gắn với thuốc nhuộm phát huỳnh quang với các màu khác nhau cho mỗi loại ddNTP. Tiến hành phản ứng tổng hợp với cả 4 dNTPs và 4 ddNTPs, sản phẩm của phản ứng được đưa lên máy đọc. Máy đọc sử dụng tia laser để xác định các chất phát huỳnh quang phát ra từ thuốc nhuộm gắn lên sản phẩm và kết quả được chuyển vào máy tính để xử lý và cho ra trình tự cần xác định.
Trong đề tài này, việc đọc trình tự ADN của các băng đột biến được thực hiện theo hai cách: đọc trình tự trực tiếp từ sản phẩm ADN tinh sạch từ gel và đọc trình tự từ plasmid chứa đoạn gen FLT3 mang đột biến đó sau khi nhân dòng.
2.2.7. Một số phần mềm sử dụng trong luận văn
Ngoài phần mềm excel được sử dụng cho các tính toán thông thường, trong luận văn còn sử dụng một số phần mềm sau:
- Phần mềm BLAST-online: được dùng để chuyển trình tự nucleotid của gen sang trình tự axit amin của protein.
- Phần mềm ImageJ: được sử dụng để đo độ sáng của băng điện di, từ đó suy ra nồng độ của mẫu nghiên cứu.
- Phần mềm MEGA 5.0: được sử dụng để kiểm tra trình tự gen và trình tự protein, kiểm tra độ bắt cặp của các đoạn Nucleotid với nhau, nhằm thiết kế mồi và phát hiện đột biến gen sau khi giải trình tự.
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Thu thập và tách chiết ADN hệ gen từ mẫu máutổng số
* Kết quả tách ADN tổng số:
Sau khi thu thập, mẫumáu tổng số được sử dụng để tách ADN hệ gen, nhằm làm khuôn cho các phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu. Trong số 208 mẫu máu được tách, có 200 mẫu máu của người mang bệnh AML chưa điều trị và 8 mẫu máu của người bình thường.Kết quả định lượng bằng phương pháp đo phổ hấp thụ ở bước sóng 260nm (A260) đều nằm trong khoảngtừ 0,8-206,5 ng/µl (Phụ lục 1, 2, 3).
Sự chênh lệch nồng độ như vậy có thể giải thích do chất lượng của mẫu hoặc do quá trình thao tác. Trong quá trình thao tác, ADN có thể bị mất đi trong bước rửa cột mini QIAamp hoặc có thể bị giữ lại cột trong bước thu ADN do chưa hòa tan hết tủa. Thêm nữa, tùy thuộc vào mỗi bệnh nhân, số lượng tế bào bạch cầu khi mang bệnh AML của mỗi người là khác nhau, có thể có số lượng tế bào bạch cầu rất ít, dẫn đến lượng ADN tổng số thu được cũng thấp hơn nhiều so với các bệnh nhân khác. Đồng thời, vì mẫu thu về là mẫu máu tổng số, có rất nhiều thành phần, do vậy việc bảo quản cũng là một yếu tố có thể gây ảnh hưởng đến chất lượng của mẫu.
Bảng 3.1: Nồng độ của một số mẫu ADN tổng số
STT 182 183 184 185 186 187 188 189 190 Nồng độ
(ng/µl) 39.4 69.2 36.8 16.7 28.9 155.9 55.8 38.2 48.0
Nhằm tránh sai số của phương pháp đo phổ hấp thụ quang học, tác giả tiến hành định lượng theo phương pháp điện di. Kết quả của phương pháp điện di cho thấy hầu hết các mẫu tách được đều có một băng tương đối rõ nét, tuy nhiên ở một số mẫu, ví dụ như mẫu 185 (Hình 6, giếng 5), lại không quan sát được băng. Kết quả này thống nhất khi so sánh với kết quả của phương pháp định lượng bằng phương pháp đo phổ hấp thụ (cho nồng độ là 16,7ng/µl) (Bảng 4 và hình 6).
Hình 3.1: Ảnh điện di ADN tổng số sau khi tách
M: marker 1 kb 182-190: mẫu ADN tổng số
Ngoài ra, kết quả của phương pháp điện di còn cho thấy độ tinh sạch của các mẫu ADN thể hiện qua việc xuất hiện một băng duy nhất trên bản gel điện di. Tuy nhiên, có một số mẫu như mẫu 187 (Hình 6, giếng 7) còn lẫn ARN, cho thấy quy trình tách ADN tổng số có thể cần phải tối ưu thêm. Mặc dù vậy, những mẫu ADN tổng số như 187 khi sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR vẫn cho kết quả tốt nên không ảnh hưởng nhiều đến quy trình.
Tương tự, khi tổng hợp và so sánh kết quả định lượng giữa hai phương pháp đo phổ hấp thụ và điện di, những mẫu có nồng độ ADN tổng số thấp hơn 20 ng/µl và có băng điện di quá mờ đều được tách lại nhằm đảm bảo chất lượng khuôn cho