Sản phẩm PCR đoạn gen FLT3 được chạy điện di trên gel agarose 2% trong đệm TAE 1x, hiệu điện thế 100V trong thời gian 40 phút đối với bể lớn; và hiệu điện thế 90V trong khoảng 30 phút đối với bể nhỏ.
Đệm TAE 1x có thành phần như sau: Tris HCl 4.48g, EDTA 0.5M (pH 8.0) 2ml, acetic acid 1.14ml, nước cất vừa đủ 1 lít. Hòa tan 2g bột agarose trong 100ml đệm TAE 1x để cho gel agarose 2%.
Sau khi điện di xong, bản gel được nhuộm với dung dịch ethidium bromide 1% trong 5-10’ và soi dưới đèn UV của máy soi gel.
Ngoài điện di agarose 2%, tùy theo mục đích, có thể điện di với một số loại gel agarose khác như: agarose metaphor 3%, gel acrylamide 12%...
2.2.6. Nhân dòng đoạn gen FLT3 và đọc trình tự gen bằng phƣơng pháp Sanger
Sau khi điện di, băng ADN có sự chênh lệch kích thước được xác định và cắt riêng ra khỏi bản gel. Sử dụng bộ kít tinh sạch gel của promega, ta sẽ thu được ADN chứa đột biến FLT3. Sản phẩm tinh sạch của băng điện di đột biến gen FLT3 được đưa vào vector pGEM-T Easy thông qua bộ kit “pGEM-T Easy Vector System” của hãng Promega. Phản ứng ligate gồm các thành phần: Enzyme T4 ligase; Đệm của T4 ligase, ADN thôi gel.
Tiếp theo, vector tái tổ hợp được biến nạp vào tế bào khả biến DH5α và nuôi cấy trên môi trường chọn lọc TSA-ampicilin được trải IPTG và X-gal. Nuôi cấy qua một đêm, sau đó, lựa chọn những khuẩn lạc màu trắng mang PCR và điện di agarose 2% nhằm khẳng định kết quả biến nạp.
Chọn những khuẩn lạc có plasmid chứa đoạn gen FLT3 đột biến, nuôi qua đêm trong môi trường LB-ampicillin lỏng. Tinh sạch plasmid từ thể biến nạp thành công và gửi đi giải trình tự ở một số cơ sở.
* Đọc trình tự bằng phƣơng pháp Sanger
Trong phương pháp này, ddNTP(dideoxyribonucleoside triphosphate) tức dNTP mà phân tử được của nó thiếu nhóm 3’- OH được sử dụng. Trong phản ứng tổng hợp PCR, phân tử này vẫn gắn vào gốc của dNTP trước đó bằng liên kết phosphodiester nhưng do không có gốc 3’- OH nên không thể tạo liên kết mới với bất kỳ phân tử dNTP nào khác do đó, phản ứng tổng hợp DNA chấm dứt tại đây.
Trong phản ứng tổng hợp DNA, ngoài dNTPs, cho thêm vào hỗn hợp một dẫn xuất ddNTP, ví dụ thay dATP bằng ddATP, quá trình tổng hợp dừng lại khi ddATP gắn vào sợi DNA đang kéo dài. Như vậy trong hỗn hợp phản ứng sau cùng sẽ thu được nhiều phân tử DNA có độ dài khác biệt và tất cả cúng đều chấm dứt tại vị trí A (do việc gắn ddATP thay vì dATP là ngẫu nhiên). Các sản phầm có độ dài khác nhau này có thể phân biệt và quan sát trên gel polyacrylamide biến tính. Kết quả trên trường điện di là các vạch có chiều dài khác nhau và đều có vị trí tận cùng là T trên sợi khuôn. Phản ứngdiễn ra tương tự với ddGTP, ddTTP và ddCTPtạo ra 4 trường điện di và suy ra trình tự sợi khuôn DNA.
Trong thực tế, các ddNTP này thường được gắn với thuốc nhuộm phát huỳnh quang với các màu khác nhau cho mỗi loại ddNTP. Tiến hành phản ứng tổng hợp với cả 4 dNTPs và 4 ddNTPs, sản phẩm của phản ứng được đưa lên máy đọc. Máy đọc sử dụng tia laser để xác định các chất phát huỳnh quang phát ra từ thuốc nhuộm gắn lên sản phẩm và kết quả được chuyển vào máy tính để xử lý và cho ra trình tự cần xác định.
Trong đề tài này, việc đọc trình tự ADN của các băng đột biến được thực hiện theo hai cách: đọc trình tự trực tiếp từ sản phẩm ADN tinh sạch từ gel và đọc trình tự từ plasmid chứa đoạn gen FLT3 mang đột biến đó sau khi nhân dòng.
2.2.7. Một số phần mềm sử dụng trong luận văn
Ngoài phần mềm excel được sử dụng cho các tính toán thông thường, trong luận văn còn sử dụng một số phần mềm sau:
- Phần mềm BLAST-online: được dùng để chuyển trình tự nucleotid của gen sang trình tự axit amin của protein.
- Phần mềm ImageJ: được sử dụng để đo độ sáng của băng điện di, từ đó suy ra nồng độ của mẫu nghiên cứu.
- Phần mềm MEGA 5.0: được sử dụng để kiểm tra trình tự gen và trình tự protein, kiểm tra độ bắt cặp của các đoạn Nucleotid với nhau, nhằm thiết kế mồi và phát hiện đột biến gen sau khi giải trình tự.
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Thu thập và tách chiết ADN hệ gen từ mẫu máutổng số
* Kết quả tách ADN tổng số:
Sau khi thu thập, mẫumáu tổng số được sử dụng để tách ADN hệ gen, nhằm làm khuôn cho các phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu. Trong số 208 mẫu máu được tách, có 200 mẫu máu của người mang bệnh AML chưa điều trị và 8 mẫu máu của người bình thường.Kết quả định lượng bằng phương pháp đo phổ hấp thụ ở bước sóng 260nm (A260) đều nằm trong khoảngtừ 0,8-206,5 ng/µl (Phụ lục 1, 2, 3).
Sự chênh lệch nồng độ như vậy có thể giải thích do chất lượng của mẫu hoặc do quá trình thao tác. Trong quá trình thao tác, ADN có thể bị mất đi trong bước rửa cột mini QIAamp hoặc có thể bị giữ lại cột trong bước thu ADN do chưa hòa tan hết tủa. Thêm nữa, tùy thuộc vào mỗi bệnh nhân, số lượng tế bào bạch cầu khi mang bệnh AML của mỗi người là khác nhau, có thể có số lượng tế bào bạch cầu rất ít, dẫn đến lượng ADN tổng số thu được cũng thấp hơn nhiều so với các bệnh nhân khác. Đồng thời, vì mẫu thu về là mẫu máu tổng số, có rất nhiều thành phần, do vậy việc bảo quản cũng là một yếu tố có thể gây ảnh hưởng đến chất lượng của mẫu.
Bảng 3.1: Nồng độ của một số mẫu ADN tổng số
STT 182 183 184 185 186 187 188 189 190 Nồng độ
(ng/µl) 39.4 69.2 36.8 16.7 28.9 155.9 55.8 38.2 48.0
Nhằm tránh sai số của phương pháp đo phổ hấp thụ quang học, tác giả tiến hành định lượng theo phương pháp điện di. Kết quả của phương pháp điện di cho thấy hầu hết các mẫu tách được đều có một băng tương đối rõ nét, tuy nhiên ở một số mẫu, ví dụ như mẫu 185 (Hình 6, giếng 5), lại không quan sát được băng. Kết quả này thống nhất khi so sánh với kết quả của phương pháp định lượng bằng phương pháp đo phổ hấp thụ (cho nồng độ là 16,7ng/µl) (Bảng 4 và hình 6).
Hình 3.1: Ảnh điện di ADN tổng số sau khi tách
M: marker 1 kb 182-190: mẫu ADN tổng số
Ngoài ra, kết quả của phương pháp điện di còn cho thấy độ tinh sạch của các mẫu ADN thể hiện qua việc xuất hiện một băng duy nhất trên bản gel điện di. Tuy nhiên, có một số mẫu như mẫu 187 (Hình 6, giếng 7) còn lẫn ARN, cho thấy quy trình tách ADN tổng số có thể cần phải tối ưu thêm. Mặc dù vậy, những mẫu ADN tổng số như 187 khi sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR vẫn cho kết quả tốt nên không ảnh hưởng nhiều đến quy trình.
Tương tự, khi tổng hợp và so sánh kết quả định lượng giữa hai phương pháp đo phổ hấp thụ và điện di, những mẫu có nồng độ ADN tổng số thấp hơn 20 ng/µl và có băng điện di quá mờ đều được tách lại nhằm đảm bảo chất lượng khuôn cho phản ứng PCR.
3.2. Thiết kế và tối ƣu quy trình phát hiện đột biến gen FLT3-ITD 3.2.1. Thiết kế trình tự mồi 3.2.1. Thiết kế trình tự mồi (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Trong đề tài này, cặp mồi đặc hiệu nhằm nghiên cứu đột biến FLT3- ITDđược thiết kế dùng cho phản ứng PCR để nhân một đoạn gen có kích thước 330
M 182 183 184 185 186 187 188 189 190 10000 bp 2000 bp 1000 bp 750 bp 500 bp
bp, kéo dài từ intron 11 đến exon 12 (dựa theo nghiên cứu của tác giả Hitoshi Kiyoi và cộng sự, năm 1999)[27]. Trình tự của cặp mồi như sau:
11F: 5’-GCAATTTAGGTATGAAAGCCAGC-3’ 12R: 5’-CTTTCAGCATTTTGACGGCAACC-3’
Chiều dài mồi xuôi cũng như mồi ngược là 23 Nucleotide, vừa đảm bảo tínhđặc hiệu (mồi bắt cặp với gen 100%), vừa tránh được sự tạo cấu trúc bậc 2.Thành phần base có tổng (G + C) của mồi xuôi và mồi ngượclần lượtlà 43,5 % và 47,8%, cũng là một yếu tố đảm bảo tính đặc hiệu cho phản ứng PCR.Hai mồi có đầu 3’ của mồi là G hoặc C đảm bảo tính ổn định và độ bền cao.Nhiệt độ gắn mồi (Tm) là 56o
Ctrong giới hạn thích hợp (52oC – 65oC) và không có sự cách biệt quá lớn giữa 2 mồi, giúp cho phản ứng PCR đạt hiệu quả cao nhất.
3.2.2. Thiết kế và tối ƣu quy trình phát hiện đột biến FLT3-ITD
Quy trình phát hiện đột biến FLT3-ITDđược thiết lập gồm các bước sau: (1) Nhân đoạn gen FLT3 có kích thước 330bp với cặp mồi đặc hiệu, sử dụng phản ứng PCR; (2) điện di trên gel agarose 2%;(3) phân tích và khẳng định kết quả. Quy trình có thể tóm tắt như sau:
Hình 3.2: Quy trình phát hiện đột biến FLT3-ITD
Quy trình được thử nghiệm với 36 mẫu bệnh đầu tiên và 3 mẫu người thường làm đối chứng. Điện di sản phẩm PCR sử dụng ADN tổng số tách từ mẫu máu của người thường trên gel agarose 2%, kết quả cho thấy có 1 băng duy nhất, có kích
Nhân đoạn gen FLT3 kích thước 330bp với cặp mồi đặc hiệu bằng phản ứng PCR
Điện di sản phẩm thu được trên gel agarose 2%, sau đó nhuộm ethidium và soi trên máy có tia UV
Phân tích kết quả thu được và đưa ra kết luận. Khẳng định kết luận bằng cách đưa đoạn ADN vào vecto tái tổ hợp và đọc trình tự
thước xấp xỉ 330 bp, sắc nét, không xuất hiện băng không đặc hiệu (Hình 3.3). Kết quả điện di 36 mẫu bệnh cho thấy, 35/36 mẫu đều xuất hiện một băng điện di sắc nét, giống như mẫu đối chứng của người thường, riêng mẫu 20 ngoài một băng giống băng của người thường và có kích thước tương đương còn xuất hiện thêm 1 băng sắc nét, có kích thước lớn hơn 330 bp. Đây có thể là băng chứa đột biến FLT3- ITD. Kết quả nhân dòng của băng có kích thước lớn hơn đó (cắt khỏi bản gel, tinh sạch, đưa vào vectơ tái tổ hợp) và giải trình tự cho thấy chính xác là mẫu 20 có trình tự giống với trình gen FLT3 bình thường nhưng có chứa thêm một lặp đoạn 33 bp. Như vậy, mẫu 20 có chứa đột biến lặp đoạn FLT3-ITD và được sử dụng làm mẫu đối chứng dương cho quá trình sàng lọc 164 mẫu còn lại.Quy trình có thể ứng dụng để sàng lọc các đột biến lặp đoạn trên gen FLT3.
Hình 3.3: Điện di sản phẩm PCR một số mẫu máu (19-32)
M: marker 100bp
19-32: mẫu ADN từ bệnh nhân AML (-1): mẫu đối chứng của người thường (-2): đối chứng âm của phản ứng PCR
Trong phản ứng PCR, một số thành phần (nồng độ mồi, nồng độ enzyme, nồng độ ADN,…) sẽ gây ảnh hưởng đến kết quả của quy trình phát hiện đột biến gen FLT3-ITD.Theo nghiên cứu củaKiyoi năm 1999[26],nồng độ mồiđã sử dụng là 2 pmol, nhưng khi sử dụng nồng độ đó với ADN đã tách, mồi thừa rất nhiều, tạo thành băng hoặc vệt trong bản điện di. Do vậy, tác giả đã tiến hànhthử nghiệm
300 bp 400 bp
nhiều giá trị khác nhau, nhằm tối ưu đến một giá trị đạt hiệu quả cao nhất về khoa học cũng như về mặt kinh tế. Sau khi thực hiện các phản ứng PCR với nồng độ mồi khác nhau, kết quả điện di cho thấy sử dụng nồng độ mồi là 0,4 pmol, phản ứng PCR vẫn cho kết quả tốt, không bị thừa mồi sau phản ứng. Vì vậy, các phản ứng PCR tiếp theo sẽ được thực hiện với nồng độ mồi là 0,4 pmol.
Tương tự như vậy, ban đầu quy trình sử dụng enzyme Taq polymerase sản xuất tại Phòng Thí nghiệm Trọng điểmvới thể tích là2,5µl/1 phản ứng (25µl). Tuy vậy, trong dung dịch enzyme lại chứa nhiều chất bảo quản enzyme như glycerol, tris-HCl, NaCl, EDTA,…Nếu sử dụng enzyme với tỉ lệ thể tích là 1:10 của phản ứng như vậy, những chất đó có ảnh hưởng lớn đến kết quả phản ứng. Do đó, một loại Taq polymerasekhác là Dream Taq (Fermentas) được sử dụng thay thế, với thể tích là 0,2µl/ 25µltrong 1 phản ứng, có tỉ lệ là 1: 125 nên ít làm thay đổi thành phần phản ứng PCR, giúp phản ứng PCR đạt hiệu cao hơn.
Thêm vào đó, trongnhiều trường hợp kích thước đoạn lặp rất nhỏ khiến băng đột biến rất gần với băng thườngnên gặp khó khăn trong việc xác định có chứa đột biến hay không. Nguyên nhân của vấn đề đó có thể do thể tích ADN tổng số khi cho vào phản ứng PCR là giống nhau, nhưng nồng độ lại khác nhau, và những mẫu lên băng quá đậm thường tương ứng với những mẫu có nồng độ cao hơn nhiều so với những mẫu khác. Từ đó, pha loãng ADN tổng số về một khoảng nồng độ thích hợp nhằm tránh các trường hợp trên. Nhiều mẫu được thực hiện PCR lại sau khi pha loãng nồng độ ADN tổng số đã xuất hiện 2 băng mảnh, tách rời nhau, thay vì một băng đậm như ban đầu. Qua nhiều lần lặp lại thí nghiệm, kết quả cho thấy nồng độ ADN tổng số tốt nhất sử dụng cho phản ứng PCR trong quy trình trên là 40-50 ng/µl nhằm đạt nồng độ cuối cùng là 4,8 -6 ng/µl sau khi bổ sung vào dung dịch phản ứng.
Như vậy, sau nhiều bước tối ưu, quy trình đã được hoàn thiện với các thành phần và các bước đã trình bày trong chương 2 và được ứng dụng để sàng lọc trong quy mô phòng thí nghiệm với các mẫu còn lại.
3.3. Bƣớc đầu sàng lọc trong quy mô phòng thí nghiệm
Ứng dụng quy trình đã tối ưu,164 mẫu ADN tổng số còn lại tách từ bệnh nhân mắc bệnh AML chưa được điều trị đãđược sàng lọc. Kết quả cho thấy trong 164 mẫu bệnh AML sau khi điện di có 14 mẫu có phổ băng khác, ngoài băng 330 bp giống như các mẫu ADN tổng số tách từ người thường, còn chứa thêm từ 1-2 băng có kích thước lớn hơn 330bp. Như vậy, trong 200 mẫu ADN tổng số tách từ bệnh nhân mắc bệnh AML có 15 mẫu có khả năngchứa đột biến FLT3-ITD.Số mẫu có khả năng chứa đột biến này chiếm tỷ lệ 7,5% trong tổng số 200 mẫu ADN của người bệnh. Những mẫu đó là: 20, 53, 54, 57, 60, 62, 69, 71, 88, 102, 112, 124, 127, 146, 160. (Hình 3.4)
Hình 3.4: Điện di một số mẫu chứa đột biến FLT3-ITD
M: marker 100bp
(-1): mẫu đối chứng của người thường (-2): đối chứng âm của phản ứng PCR
Theo nghiên cứu của Christian Thiede và cộng sự năm 2002 trên 979 bệnh nhân AML ở Mỹ, tỉ lệ đột biến FLT3-ITDlà 20,4%[51]. Trong một nghiên cứu khác của Susanne Schnittger và cộng sự trên 234 bệnh nhân,tỉ lệ đột biến FLT3-ITD là 23,5%[45]. Trong khi đó, tỉ lệ này ở Nhật Bản là 20% [54].Tuy nhiên, tỉ lệ đột biến FLT3-ITD cũng có thể thấp hơn như trong nghiên cứu của Meshinchi và cộng sự năm 2008 trên 630 bệnh nhân AML thì có 77 bệnh nhân có mang đột biến FLT3-
(-2) M 20 53 54 57 (-1) 60 62 71 88 102 112 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
400 bp 300 bp
ITD, tỉ lệ là 12% [37].Như vậy, mặc dù tỉ lệ đột biến trong đề tài này không cao so với kết quả của những nghiên cứu khác trên thế giới nhưng vẫncó thể giải thích được. Trong quá trình tiến hành đề tài,200 mẫu máu mang bệnh AML được lấy từ bệnh viện Huyết học truyền máu trung ương từng đợt khác nhau, khi sàng lọc sẽ có các tỉ lệ đột biến khác nhau theo từng đợt. Cụ thể là 208 mẫu (200 mẫu máu mang bệnh và 8 mẫu máu người thường)được lấy theo 4 đợt: 39 mẫu (36 mẫu bệnh, 3 mẫu người thường); 49 mẫu bệnh; 35 mẫu bệnh; 85 mẫu (80 mẫu bệnh và 5 mẫu người thường), và tỉ lệ đột biến ứng với từng đợt là: 1/36 (2,8%), 8/49 (16,3%), 2/35 (5,7%), 4/80 (5%). Như vậy, tỉ lệ đột biến phụ thuộc rất nhiều vào mẫu, và các điều kiện ngẫu nhiên khi chọn mẫu như thể bệnh, độ tuổi bệnh nhân, khu vực lấy mẫu…
Chính vì vậy, đây là kết quả sàng lọc ban đầu cho thấy tỉ lệ đột biến FLT3-