Ứng dụng kỹ thuật as real time pcr nhằm phát hiện một số đột biến nổi trội trên gene k ras đích nhắm trong điều trị ung thư đại trực tràng nghiên cứu khoa học

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN THAM GIA XÉT GIẢI THƯỞNG CẤP TRƯỜNG Tên đề tài: ỨNG DỤNG KỸ THUẬT AS-REAL-TIME PCR NHẰM PHÁT HIỆN MỘT SỐ ĐỘT BIẾN NỔI TRỘI TRÊN GEN K-RAS: ĐÍCH NHẮM TRONG ĐIỀU TRỊ UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: VI SINH - SINH HỌC PHÂN TỬ Tp Hồ Chí Minh, tháng năm 2013 TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN THAM GIA XÉT GIẢI THƯỞNG CẤP TRƯỜNG Tên đề tài: ỨNG DỤNG KỸ THUẬT AS-REAL-TIME PCR NHẰM PHÁT HIỆN MỘT SỐ ĐỘT BIẾN NỔI TRỘI TRÊN GEN KRAS: ĐÍCH NHẮM TRONG ĐIỀU TRỊ UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: VI SINH - SINH HỌC PHÂN TỬ Sinh viên thực 1: NGUYỄN VĂN TRƯỜNG (Nhóm trưởng) Nam, Nữ: Nam Năm: 03/04 Lớp SH10A2 Sinh viên thực 2: NGUYỄN THỊ THÚY TÀI Nam, Nữ: Nữ Năm: 03/04 Lớp SH10A2 Sinh viên thực 3: VÕ THỊ NGHĨA Nam, Nữ: Nữ Năm: 03/04 Lớp SH10A2 Sinh viên thực 4: ĐOÀN HUỲNH SANG Nam, Nữ: Nam Năm: 03/04 Lớp SH10A1 GVHD: PGS.TS LÊ HUYỀN ÁI THÚY MỤC LỤC: ĐẶT VẤN ĐỀ 15 PHẦN I: MỞ ĐẦU 17 I TỔNG QUAN 17 Tổng quan ung thư 17 Tổng quan ung thư đại trực tràng (colorectal cancer): 18 Phương pháp chẩn đoán ung thư đại trực tràng (Institute, 2011): .21 Tổng quan điều trị nhắm trúng đích ung thư: .22 Tổng quan đột biến: 26 Tổng quan gen EGFR .26 Tổng quan gen K-ras 28 Kỹ thuật AS-PCR AS-Real-time PCR 30 PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 31 I VẬT LIỆU 31 II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 Khai thác liệu khảo sát in silico 31 1.1 Khai thác liệu 31 1.2 Khảo sát in silico 31 Khảo sát in vitro 32 2.1 Tách chiết DNA 32 2.1.1 Nguyên tắc 32 2.1.2 Thiết bị hóa chất 33 2.1.3 Các bước tiến hành 33 2.2 Kiểm tra chất lượng DNA thu nhận: 34 2.2.1 Nguyên tắc: 34 2.2.2 Thiết bị hóa chất 34 2.2.3 Các bước tiến hành: 34 2.3 Phản ứng PCR: 34 2.3.1 Thiết bị, hóa chất: 35 2.3.2 Các bước tiến hành: 35 2.4 Phương pháp điện di: 36 2.4.1 Nguyên tắc: 36 2.4.2 Thiết bị hóa chất: .36 2.4.3 Các bước tiến hành: 36 2.5 Phản ứng Real time PCR 36 2.5.1 Thiết bị, hóa chất: 36 2.5.2 Các bước tiến hành: 36 PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 38 I KẾT QUẢ KHAI THÁC DỮ LIỆU VÀ KHẢO SÁT IN SILICO 38 Khai thác liệu - Các loại đột biến gen K-ras 38 Kết khảo sát in silico 46 2.1 Thu nhận trình tự gen, định vị vị trí đột biến đã công bố: .46 2.2 Thiết kế đánh giá mồi cho phản ứng PCR-Giải trình tự, AS-PCR .47 2.2.1 Thiết kế mồi: .47 2.2.2 Đánh giá mồi .47 II KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM: 51 Tách chiết DNA kiểm tra DNA gen sau tách chiết: 51 Thử nghiệm điều kiện phản ứng cho PCR – giải trình tự: 54 Kết thử nghiệm PCR-giải trình tự phát đột biến gen K-ras từ bệnh nhân ung thư đại trực tràng: 56 Kết thử nghiệm Alelle-Specific PCR phát đột biến gen K-ras từ bệnh nhân ung thư đại trực tràng: 61 PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 65 I KẾT LUẬN 65 II KIẾN NGHỊ 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO 66 PHỤ LỤC 69 PHỤ LỤC 1: ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG VÀ GIẢI PHẨU BỆNH CỦA 19 MẪU ĐẠI TRỰC TRÀNG 69 PHỤ LỤC 2: PHÂN TÍCH KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ CỦA 19 MẪU ĐẠI TRỰC TRÀNG VÀ MẪU VÚ 70 DANH MỤC HÌNH: Hình 1.1 Thể tỷ lệ mắc bệnh tỷ lệ tử vong toàn giới (Globocan, 2008) Hình 1.2 Tỷ lệ mắc bệnh ung thư đại trực tràng nam giới giới (Globocan, 2008) Hình 1.3 Tỷ lệ mắc bệnh ung thư đại trực ràng nữ giới giới (Globocan, 2008) Hình 1.4 Tỷ lệ mắc bệnh ung thư đại trực tràng nam giới Việt Nam (Globocan, 2008) Hình 1.5 Tỷ lệ mắc bệnh ung thư đại trực tràng nữ giới Việt Nam (Globocan, 2008) Hình 1.6 Các loại th́c điều trị nhắm trúng đích thụ thể EGFR (Krause D S, 2005) Hình 1.7 Vị trí gen EGFR NST sớ Hình 1.8 Cấu trúc thụ thể EGFR (Siwak D R, 2009) Hình 1.9 Vị trí gen K-Ras NST sớ 12 Hình 1.10 Thụ thể EGFR đường Ras (Arrington A K, 2012) Hình 3.1 Tỷ lệ đột biến bảy vị trí phổ biến gen K-ras đã qua áp dụng cách thớng kê, tính tần sớ trung bình có trọng sớ Hình 3.2 Mơ hình cấu trúc domain protein K-ras (A) vị trí đột biến gen (B) Hình 3.3 Vị trí cặp mồi phản ứng PCR khuếch đại exon gen K-ras Hình 3.4 Vị trí bắt cặp mồi (trong phản ứng AS-PCR) mồi/mẫu dò (trong phản ứng AS Real-time PCR) Hình 3.5 Kết điện di sản phẩm PCR với cặp mồi K-ras mẫu bệnh phẩm 16 Thang chuẩn 100 bp Hình 3.6 Kết điện di sản phẩm PCR thử nghiệm tới ưu hóa nồng độ DNA nồng độ mồi K-ras Thang chuẩn 100 bp Hình 3.7 Kết điện di sản phẩm PCR dò tìm Tm tới thích cho cặp mồi K-ras Thang chuẩn 100 bp Hình 3.8 Một sớ vị trí nghi ngờ đột biến phát phương pháp giải trình tự Hình 3.19 Kết giải trình tự codon 12 13 mẫu Hình 3.10 Mẫu 33 với tín hiệu bị nhiễu Hình 3.11 Kết điện di sản phẩm AS-PCR ba mẫu 18, 20 16 Hình 3.12 Kết điện di sản phẩm AS-PCR ba mẫu 4, 20 (sau điện di điện trường 75 V, thời gian 30 phút) Hình 3.13 Kết điện di sản phẩm AS-PCR ba mẫu 4, 20 (sau điện di điện trường 75 V, thời gian 50 phút) Hình 3.14 Kết AS Real-time PCR phát đột biến G12A âm tính tất mẫu thử nghiệm Hình 3.15 Kết AS Real-time PCR dương tính hai mẫu 16 DANH MỤC BẢNG: Bảng 2.1 Thành phần phản ứng PCR với K-ras Bảng 2.2 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR với K-ras Bảng 2.3 Thành phần phản ứng Real time PCR với mồi đột biến Bảng 2.4 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng Real time PCR với mồi đột biến Bảng 3.1 Tỷ lệ đột biến gen K-ras ung thư đại trực tràng Bảng 3.2 Tỷ lệ đột biến gen EGFR loại ung thư Bảng 3.3 Các loại mẫu sử dụng tài liệu tham khảo Bảng 3.4 Tỷ lệ đột biến bảy vị trí phổ biến gen K-ras Bảng 3.5 Sự thay đổi nu (nu gạch dưới) codon 12 13 dẫn đến đột biến Bảng 3.6 Phân tích ANOVA khác biệt cỡ mẫu châu khác kiểu đột biến trội gen K-ras Bảng 3.7 Trình tự thơng sớ đánh giá mồi IDT cho phản ứng PCR khuếch đại exon gen K-ras Bảng 3.8 Trình tự thơng sớ đánh giá mồi IDT cho phản ứng AS-PCR AS Real-time PCR phát đột biến trội exon gen K-ras Bảng 3.9 Chỉ số OD mẫu 5, 16, 17 Bảng 3.10 Kết đo mật độ quang lô mẫu thử nghiệm phương pháp tách chiết Bảng 3.11 Ký hiệu đột biến phát Bảng 3.12 Tổng số đột biến mẫu DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT A : Adenine ANOVA : Analysis of value AS-PCR : Allele-specific Polymerase Chain Reaction AS-Real-Time PCR : Allele-specific Real Time Polymerase Chain Reaction ATP : Adenosine triphosphate ADP : Adenosine diphosphate BCR : Breakpoint cluster region BLAST : Basic Local Alignment Search Tool bp : base pair C : Cytosine COLD-PCR : Coamplification at Lower Denaturation temp PCR DNA : Deoxyribonucleic acid EDTA : Ethylenediaminetetraacetic acid EGF : Epidermal Growth Factor EGFR : Epidermal Growth Factor Receptor ErbB : V-erb-b2 erythroblastic leukemia viral oncogene homolog FISH : Fluorescent in situ hybridization G : Guanidine Grb2 : Growth factor receptor-bound protein HRM : High Resolution Melting K-ras : Kirsten-ras/ V-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog LNA-PCR : Locked nucleic acid PCR MAPK : Mitogen Activated Protein kinase MEK : Mitogen Activated Protein kinase kinase NCBI : National Center for Biotechnology Information OD : Optical Density PCR : Polymerase Chain Reaction PI3K : Phosphoinositide 3-Kinase RNA : Ribonucleic acid SDS : Sodium dodecyl sulfat SNP : Single-nucleotide polymorphism SSCP : Single-strand conformation polymorphism TE : Tris 0,1M - EDTA 0001M TGF-α : Transforming Growth Factor-α TKIs : Tyrosine Kinase Inhibitors Tm : Nhiệt độ nóng chảy UTR : Untranlated region UV : Ultraviolet WHO : World Health Organization BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI Thông tin chung: - Tên đề tài: Ứng dụng kỹ thuật AS-Real-time PCR nhằm phát số đột biến trội gen K-ras: đích nhắm điều trị ung thư đại trực tràng - Sinh viên thực hiện: Sinh viên thực 1: Nguyễn Văn Trường Nam, Nữ: Nam Dân tộc: Kinh Lớp, khoa: SH10A2, khoa Công Nghệ Sinh Học Năm thứ: 03 Số năm đào tạo: 04 Ngành học: Vi sinh – Sinh học phân tử Sinh viên thực 2: Nguyễn Thị Thúy Tài Nam, Nữ: Nữ Dân tộc: Kinh Lớp, khoa: SH10A2, khoa Công Nghệ Sinh Học Năm thứ: 03 Số năm đào tạo: 04 Ngành học: Vi sinh – Sinh học phân tử Sinh viên thực 3: Võ Thị Nghĩa Nam, Nữ: Nữ Dân tộc: Kinh Lớp, khoa: SH10A2, khoa Công Nghệ Sinh Học Năm thứ: 03 Số năm đào tạo: 04 Ngành học: Vi sinh – Sinh học phân tử Sinh viên thực 4: Đoàn Huỳnh Sang Nam, Nữ: Nam Dân tộc: Kinh Lớp, khoa: SH10A1, khoa Công Nghệ Sinh Học Năm thứ: 03 10 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 ... QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI Thông tin chung: - Tên đề tài: Ứng dụng k? ?? thuật AS- Real- time PCR nhằm phát số đột biến trội gen K- ras: đích nhắm điều trị ung thư đại trực tràng - Sinh viên thực hiện: ... ung thư như: ung thư buồng trứng, ung thư cổ tử cung, ung thư vú,… có nguy cao mắc bệnh ung thư đại trực tràng - Một đột biến thư? ??ng dẫn đến ung thư đại trực tràng đột biến xảy gen gây ung thư, ... 1/2013, khẳng định: gen EGFR K- ras đích nhắm điều trị ung thư đại trực tràng liệu pháp nhắm trúng đích, đột biến K- ras thư? ??ng xuyên ghi nhận Khẳng định tính hợp lý việc xuất đột biến K- ras chúng