Xác định cơ sở phân tử của bệnh cao cholesterol trong máu có tính chất gia đình liên quan đến gen LDLR (low density lipoprotein receptor)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP HỒ CHÍ MINH KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP Tên chun đề: XÁC ĐỊNH CƠ SỞ PHÂN TỬ CỦA BỆNH CAO CHOLESTEROL TRONG MÁU CĨ TÍNH CHẤT GIA ĐÌNH LIÊN QUAN ĐẾN GEN LDLR (LOW DENSITY LIPOPROTEIN RECEPTOR) KHOA: CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: VI SINH - SINH HỌC PHÂN TỬ GVHD: PGS TS LÊ HUYỀN ÁI THUÝ ThS TRƢƠNG KIM PHƢỢNG SVTH: NGUYỄN THỊ NGỌC MỸ MSSV: 1153010494 KHOÁ: 2011 - 2015 Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP HỒ CHÍ MINH KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP Tên chuyên đề: XÁC ĐỊNH CƠ SỞ PHÂN TỬ CỦA BỆNH CAO CHOLESTEROL TRONG MÁU CĨ TÍNH CHẤT GIA ĐÌNH LIÊN QUAN ĐẾN GEN LDLR (LOW DENSITY LIPOPROTEIN RECEPTOR) KHOA: CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: VI SINH - SINH HỌC PHÂN TỬ GVHD: PGS TS LÊ HUYỀN ÁI THUÝ ThS TRƢƠNG KIM PHƢỢNG GVHD ký xác nhận: SVTH: NGUYỄN THỊ NGỌC MỸ MSSV: 1153010494 KHOÁ: 2011 - 2015 Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2015 Chuyên Đề KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô khoa Công Nghệ Sinh Học trƣờng Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh q thầy chun ngành Vi sinh - Sinh học phân tử tận tình dạy bảo, truyền đạt cho em kiến thức, kinh nghiệm suốt thời gian qua Em xin chân thành cảm ơn PGS.TS Lê Huyền Ái Thuý, ThS Lao Đức Thuận - phụ trách, nghiên cứu làm việc phịng thí nghiệm Sinh học phân tử, anh chị bạn làm khố luận Phịng tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ em tận tình suốt thời gian khoá luận tốt nghiệp Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ThS Trƣơng Kim Phƣợng hết lòng giúp đỡ, trực tiếp hƣớng dẫn em suốt trình làm thực tập tốt nghiệp Cô dạy em không nhiều kiến thức bổ ích mà cịn tinh thần làm việc, thái độ nghiên cứu khoa học nghiêm túc hiệu Sau cùng, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Cha Mẹ gia đình ni dƣỡng, dạy bảo để có đƣợc ngày hơm Xin cảm ơn anh chị em gia đình, bạn bè động viên, giúp đỡ trình học tập hồn thành khố luận tốt nghiệp Xin Chân Thành Cảm Ơn! Sinh viên Nguyễn Thị Ngọc Mỹ SVTH: NGUYỄN THỊ NGỌC MỸ Trang i Chuyên Đề KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ApoB Apolipoprotein B - 100 ApoE Apolipoprotein E BLAST Basic Local Alignment Search Tool CHD Coronary Heart Disease CVD Cardiovascular Disease DGGE Denaturing Gradient Gel Electrophoresis DNA Deoxyribonucleic Acid FH Familial Hypercholesterolemia HDL High Density Lipoprotein heFH heterozygous Familial Hypercholesterolemia hoFH homozygous Familial Hypercholesterolemia LDL Low Density Lipoprotein LDLR Low Density Lipoprotein Receptor LDLRAP1 LDLR adaptor protein MLPA Multiplex Ligation – dependent Probe Amplification NCBI National Center for Biotechnology Information NIH National Institutes of Health PCR Polymerase Chain Reaction PCSK9 Proprotein convertase subtilisin/kexin type RER Rough Endoplasmic Reticulum SRE Steroid Response Element SREBP Steroid Response Element Binding Protein SSCP Single – Strand Conformation Polymorphism TC Total Cholesterol TG Triglyceride SVTH: NGUYỄN THỊ NGỌC MỸ Trang ii Chuyên Đề KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DANH MỤC BẢNG Bảng II.1 Thành phần phản ứng PCR với mồi LDLR13_F LDLR13_R .19 Bảng II.2 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR với mồi LDLR13_F LDLR13_R 19 Bảng III.1 Số lƣợng cơng trình nghiên cứu đƣợc thu thập từ PubMed (NCBI) 21 Bảng III.2 Các cơng trình nghiên cứu bệnh FH NCBI 22 Bảng III.3 Các dạng đột biến điểm gen LDLR thu thập đƣợc giới 23 Bảng III.4 Số dạng đột biến điểm gen LDLR châu lục 25 Bảng III.5 Các dạng đột biến điểm gen LDLR quốc gia giới .26 Bảng III.6 Số dạng đột biến điểm exon gen LDLR 28 Bảng III.7 Cơ sở liệu gen LDLR đƣợc thu thập NCBI 31 Bảng III.8 Các mồi khuếch đại vùng trình tự exon 33 Bảng III.9 Thông số chi tiết cặp mồi khuếch đại exon thu thập đƣợc 34 Bảng III.10 Một số thông số vật lý mồi 38 Bảng III.11 Giá trị đo mật độ quang mẫu bệnh phẩm 39 Bảng III.12 Tổng hợp kết gải trình tự exon gen LDLR 50 Bảng VI.1 Số lƣợng đột biến exon gen LDLR 64 Bảng VI.2 Kết đánh giá độ đặc hiệu mồi LDLR13 Annhyb…….78 Bảng VI.3 Thông số mẫu bệnh phẩm thu thập đƣợc…………………… 79 SVTH: NGUYỄN THỊ NGỌC MỸ Trang iii Chun Đề KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP DANH MỤC HÌNH Hình I.1 Con đƣờng chuyển hóa thụ thể LDL [27] .4 Hình I.2 Xơ vữa động mạch [75] .5 Hình I.3 Một số biểu bệnh nhân FH [57] Hình I.4 Vị trí gen LDLR nhiễm sắc thể số 19 (Genecards) .9 Hình I.5 Các vùng chức thụ thể LDL [7] 10 Hình III.1 Tỉ lệ đột biến gen LDLR exon .29 Hình III.2 Biểu đồ thể phƣơng pháp xác định đột biến gen LDLR 30 Hình III.3 Đánh giá độ tƣơng đồng trình tự gen LDLR cơng cụ Bioedit 32 Hình III.4 Khảo sát độ đặc hiệu mồi LDLR13_F cơng cụ BLAST 36 Hình III.5 Khảo sát độ đặc hiệu mồi LDLR13_R công cụ BLAST 37 Hình III.6 Xác định vị trí bắt cặp mồi LDLR13_F LDLR13_R công cụ Annhyb .37 Hình III.7 Kết điện di sản phẩm khuếch đại gen LDLR với mồi LDLR13_F LDLR13_R 40 Hình III.8 Kết điện di khuếch đại gen LDLR với mồi LDLR13_F LDLR13_R 40 Hình III.9 Kết khảo sát mức độ tƣơng đồng trình tự A2F cơng cụ BLAST 44 Hình III.10 Một số vị trí nghi ngờ xuất đột biến điểm trình tự A2F 44 Hình III.11 Kết khảo sát mức độ tƣơng đồng trình tự A6F cơng cụ BLAST .45 Hình III.12 Sắp gióng cột trình tự A6F với NM_000527.4 cơng cụ BioEdit 45 Hình III.13 Kết khảo sát mức độ tƣơng đồng trình tự A7F cơng cụ BLAST .46 Hình III.14 Sắp gióng cột trình tự A7F với NM_000527.4 cơng cụ BioEdit 46 Hình III.15 Kết khảo sát mức độ tƣơng đồng trình tự A1F công cụ BLAST .47 Hình III.16 Một số vị trí xuất đột biến điểm trình tự A1F 47 SVTH: NGUYỄN THỊ NGỌC MỸ Trang iv Chuyên Đề KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Hình III.17 Kết khảo sát mức độ tƣơng đồng trình tự A3F cơng cụ BLAST .48 Hình III.18 Một số vị trí xuất đột biến điểm trình tự A3F 48 Hình III.19 Kết khảo sát mức độ tƣơng đồng trình tự A4F cơng cụ BLAST .49 Hình III.20 Một số vị trí xuất đột biến điểm trình tự A4F 49 Hình VI.1 Tỉ lệ đột biến exon gen LDLR [49] 64 Hình VI.2 Mức độ tƣơng đồng trình tự NG_009060 NM_000527.4 65 Hình VI.3 Kết khảo sát độ tƣơng đồng trình tự NG_009060.1 cơng cụ BLAST .65 Hình VI.4 Kết khảo sát độ tƣơng đồng trình tự NM_000527.4 cơng cụ BLAST 66 Hình VI.5 Đánh giá IDT trình tự mồi LDLR13_F 67 Hình VI.6 Đánh giá IDT trình tự mồi LDLR13_R 68 Hình VI.7 Kết khảo sát độ đặc hiệu trình tự mồi LDLR13_R công cụ BLAST .68 Hình VI.8 Kết giải trình tự mẫu A1 71 Hình V.9 Kết giải trình tự mẫu A2 72 Hình V.10 Kết giải trình tự mẫu A3 73 Hình V.11 Kết giải trình tự mẫu A4 74 Hình V.12 Kết giải trình tự mẫu A6 75 Hình V.13 Kết giải trình tự mẫu A7 76 SVTH: NGUYỄN THỊ NGỌC MỸ Trang v Chuyên Đề KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ PHẦN I TỔNG QUAN I.1 TỔNG QUAN VỀ CAO CHOLESTEROL I.1.1 Cholesterol I.1.2 Bệnh rối loạn mỡ máu (Dyslipidemia) .4 I.1.2.1 Khái niệm I.1.2.1 Nguyên nhân I.1.2.1 Dấu hiệu triệu chứng I.1.2.1 Chẩn đoán .6 I.1.3 Bệnh cao cholesterol có tính gia đình (Familial Hypercholesterolemia) I.1.3.1 Khái niệm I.1.3.1 Đột biến gen bệnh FH I.1.3.1 Chẩn đoán .8 I.2 TỔNG QUAN VỀ GEN LDLR I.2.1 Gen LDLR I.2.2 Protein LDLR .9 I.2.3 Thụ thể LDL .10 I.2.4 Các dạng ảnh hƣởng gen LDLR đến thụ thể LDL .11 I.3 KỸ THUẬT XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN TRÊN GEN LDLR .12 I.3.1 Giải trình tự tự động: 12 I.3.2 Single Strand Conformation Polymorphism - SSCP 13 I.4 MỘT SỐ CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU VỀ BỆNH CAO CHOLESTEROL CĨ TÍNH GIA ĐÌNH 13 PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .15 II.1 VẬT LIỆU .15 II.1.1 Các công cụ tin sinh học: 15 SVTH: NGUYỄN THỊ NGỌC MỸ Trang vi Chuyên Đề KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Diament J., Giannini S D., Bertolami M C., Hirata R D (2002), Molecular basis of familial hypercholesterolemia in Brazil: Identification of seven novel LDLR gene mutations, Hum Mutat 19 (4), pp: 462 - 463 67 Simons K., Ehehalt R (2002), Cholesterol, lipid rafts, and disease, J Clin Invest 110 (5), pp: 597 - 603 68 Theart L., Kotze M J., Langenhoven E., Loubser O., Peeters A V., Lintott C J., Scott R S (1995), Screening for mutations in exon of the LDL receptor gene: identification of a new deletion mutation J Med Genet 32 (5), pp: 379 - 382 69 Tuppia L., Antonucci I., Palka G., Gatta V (2012), Use of the MLPA Assay in the Molecular Diagnosis of Gene Copy Number Alterations in Human Genetic Diseases, Int J Mol Sci 13 (3), pp: 3245 - 3276 70 Whitfield A J., P Hugh, R Barrett, Frank M van Bockxmeer, John R Burnett (2004), Lipid Disorders and Mutations in the APOB Gene, Clinical Chemistry 1725 - 1732 71 Xenophontos S L., Pierides A., Demetriou K., Avraamides P., Manoli P., AyrtonN., Skordis N., Anastasiadou V., Miltiadous G and Cariolou M A (2000), Geographical clustering of low density lipoprotein receptor gene mutations (C292X; Q363X; D365E & C660X) in Cyprus, Hum Mutat 15(4), pp: 380 72 Yamamoto T., Davis C G., Brown M S., Schneider W J., Casey M L., Goldstein J L., Russell D W (1984), The human LDL receptor: a cysteinerich protein with multiple Alu sequences in its mRNA, Cell 39(1), pp: 2738 73 Yang K C., Su Y N., Shew J Y., Yang K Y., Tseng W K., Wu C C., Lee Y T (2009), LDLR and ApoB are major genetic causes of autosomal dominant hypercholesterolemia in a Taiwanese population, J Formos Med Assoc 106 (10), pp: 799 - 807 74 Zakharova F M., Damgaard D., Mandelshtam M Y., Golubkov V I., Nissen SVTH: NGUYỄN THỊ NGỌC MỸ Trang 62 Chuyên Đề KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP P H., Nilsen G G., Stenderup A., Lipovetsky B M., Konstantinov V O., Denisenko A D., Vasilyev V B., Faergeman O (2005), Familial hypercholesterolemia in St-Petersburg: the known and novel mutations found in the low density lipoprotein receptor gene in Russia, BMC Med Genet (6), pp: 75 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmedhealth/PMH0063067/ 76 http://www.ucl.ac.uk/ldlr/Current/search.php?select_db=LDLR&srch=all SVTH: NGUYỄN THỊ NGỌC MỸ Trang 63 Chuyên Đề KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1: KHẢO SÁT DỮ LIỆU Bảng VI.1 Số lƣợng đột biến exon gen LDLR Hình VI.1 Tỉ lệ đột biến exon gen LDLR [49] SVTH: NGUYỄN THỊ NGỌC MỸ Trang 64 Chuyên Đề KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP PHỤ LỤC 2: KHẢO SÁT IN SILICO GEN LDLR Hình VI.2 Mức độ tƣơng đồng trình tự NG_009060 NM_000527.4 Hình VI.3 Kết khảo sát độ tƣơng đồng trình tự NG_009060.1 công cụ BLAST SVTH: NGUYỄN THỊ NGỌC MỸ Trang 65 Chun Đề KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP Hình VI.4 Kết khảo sát độ tƣơng đồng trình tự NM_000527.4 công cụ BLAST SVTH: NGUYỄN THỊ NGỌC MỸ Trang 66 Chun Đề KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP Hình VI.5 Đánh giá IDT trình tự mồi LDLR13_F SVTH: NGUYỄN THỊ NGỌC MỸ Trang 67 Chuyên Đề KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Hình VI.6 Đánh giá IDT trình tự mồi LDLR13_R Hình VI.7 Kết khảo sát độ đặc hiệu trình tự mồi LDLR13_R công cụ BLAST SVTH: NGUYỄN THỊ NGỌC MỸ Trang 68 Chuyên Đề KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Bảng VI.2 Kết đánh giá độ đặc hiệu mồi LDLR13_F LDLR13_R Annhyb LDLR13_F Vị trí bắt đầu 20753 Vị trí kết thúc 20772 LDLR13_R 21260 21279 Tên mồi SVTH: NGUYỄN THỊ NGỌC MỸ Chiều dài sản phẩm 527 bp Trang 69 Chuyên Đề KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Bảng VI.3 Thông số mẫu bệnh phẩm thu thập đƣợc STT Mẫu Tên bệnh nhân Tuổi A1 Phan Thị S A2 Cholesterol Tryglyceride HDL LDL (mmol/L) 49 7,91 1,78 1,52 5,49 Tăng huyết áp Phƣơng Văn Q 34 17,46 6,91 1,29 12,72 Theo dõi viêm cầu thận cấp A3 Sầm Thị C 54 6,12 2,33 1,25 4,27 A4 Nguyễn Thanh N 30 6,1 3,75 1,31 2,46 Khám sức khoẻ định kì A5 Nguyễn Văn L 73 6,16 0,92 1,01 4,37 nhồi máu tim A6 Đỗ Thị T 58 8,31 3,96 1,4 5,52 Đau vai, Tăng huyết áp A7 Trần Văn Đ 34 5,82 3,33 3,99 2,96 Khám sức khoẻ định kì SVTH: NGUYỄN THỊ NGỌC MỸ (mmol/L) (mmol/L) Chẩn đoán (mmol/L) Viêm dày, Tăng huyết áp, bƣớu cổ Trang 70 Chun Đề KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP Hình VI.8 Kết giải trình tự mẫu A1 SVTH: NGUYỄN THỊ NGỌC MỸ Trang 71 Chuyên Đề KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Hình V.9 Kết giải trình tự mẫu A2 SVTH: NGUYỄN THỊ NGỌC MỸ Trang 72 Chuyên Đề KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Hình V.10 Kết giải trình tự mẫu A3 SVTH: NGUYỄN THỊ NGỌC MỸ Trang 73 Chuyên Đề KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP Hình V.11 Kết giải trình tự mẫu A4 SVTH: NGUYỄN THỊ NGỌC MỸ Trang 74 Chun Đề KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP Hình V.12 Kết giải trình tự mẫu A6 SVTH: NGUYỄN THỊ NGỌC MỸ Trang 75 Chun Đề KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP Hình V.13 Kết giải trình tự mẫu A7 SVTH: NGUYỄN THỊ NGỌC MỸ Trang 76 ... cao cholesterol máu có tính chất gia đình liên quan đến gen LDLR (Low Density Lipoprotein Receptor)? ?? o Mục tiêu: Xác định sở phân tử (tính chất đột biến điểm) gen LDLR liên quan đến bệnh cao cholesterol. .. KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP Tên chun đề: XÁC ĐỊNH CƠ SỞ PHÂN TỬ CỦA BỆNH CAO CHOLESTEROL TRONG MÁU CĨ TÍNH CHẤT GIA ĐÌNH LIÊN QUAN ĐẾN GEN LDLR (LOW DENSITY LIPOPROTEIN RECEPTOR) KHOA: CÔNG NGHỆ SINH HỌC... cholesterol có tính chất gia đình Trong đó, 38 cơng bố khoa học mô tả thông tin: cholesterol, bệnh cao cholesterol FH, 14 cơng trình nghiên cứu tính chất đột biến điểm gen LDLR liên quan đến bệnh FH,