CHƯƠNG VII: CƠ SỞ PHÂN TỬ CỦA TÍNH DI TRUYỀN

4/20/2010 1 PHẦN II: CƠ SỞ DI TRUYỀN HỌC CHƯƠNG VII: CƠ SỞ PHÂN TỬ CỦA TÍNH DI TRUYỀN TS. Nguyễn Hồi Hương VII. 1. Q trình khám phá DNA là vật chất di truyền 1865- Mendel công bố các quy luật di truyền 1868 - Fredrich Miescher phát hiện một hợp chất mang tính acid yếu trong nhân tế bào, sau này gọi là DNA 1924- sử dụng phương pháp nhuộm màu soi kính hiển vi người ta phát hiện ra nhân tế bào gồm acid nucleic và cả protein. 1928 – thí nghiệm Griffith phát hiện hiện tượng biến nạp (transformation) ở vi khuẩn 1944 – thí nghiệm của Avery, Mac Carty, Mc Leod xác đònh được tác nhân gây biến nạp 1949 - Erwin Chargaff phân tích thành phần các base trong DNA: DNA mang tính đặc hiệu lồi, đưa ra quy tắc Erwin Chargaff. 1952 – thí nghiệm Hershey – Chase chứng minh DNA là vật chất di truyền. 1953 - Rosalind Franklin dùng phương pháp tán xạ tia X nghiên cứu cấu trúc tinh thể DNA 1953 – Watson và Crick xây dựng mơ hình cấu trúc không gian và kích thước của phân tử DNA. 1928 - Thí nghiệm Griffith với Streptococcus pneumoniae Chủng R không có nang bao bọc bò hệ thống miễn dòch phát hiện và tiêu diệt Chủng S mang độc lực vì có nang polysaccharide làm hệ mễn dòch không phát hiện được Thí nghiệm Griffith với Streptococcus pneumoniae trên chuột Chủng R Chủng S Chủng S sau khi đun sôi – S’ Hỗn hợp R+S’ Tế bào chết S’ chuyển tính gây bệnh cho tế bào R Biến nạp (transformation): thay đổi tính trạng khi truyền thông tin di truyền 4/20/2010 2 1944 - Thí nghiệm của Avery, Mac Carty, Mc Leod chứng minh DNA là vật chất di truyền Tế bào S’ Hiện tượng biến nạp không xuất hiện nếu không có DNA DNA là chất di truyền 1952 – Thí nghiệm của A. Hershey và M. Chase Bacteriophage T2 Bacteriophage = phage = thực khuẩn DNA chứa 32 P Vỏ protein chứa 32 S Cho phage T2 lây nhiễm E.coli Đánh dấu DNA của phage T2 bằng 32P và protein bằng 32S bằng cách ni chúng trên mơi trường chứa 32P hoặc 32S Khuấy trộn mạnh để tách phage T2 ra khỏi E.coli Ly tâm tách tế bào E.coli và phage T2. E.coli: cặn lắng. Phage T2: dịch trong. THÍ NGHIỆM KẾT LUẬN: Vật chất mà phage truyền cho E. coli là DNA DNA là vật chất di truyền 1953 - Phát hiện cấu trúc không gian và kích thước của phân tử DNA: hai chuỗi xoắn α Những năm 50 thế kỷ 20: Phương pháp tán xạ tia X được sử dụng để phát hiện cấu trúc khơng gian của DNA Mẫu DNA: DNA tinh khiết được kết tinh 4/20/2010 3 1949- Thành phần hóa học của DNA Những năm 50 thế kỷ 20: Quy tắc Chargaff : trong DNA, lượng base purine (A+G) ln bằng lượng pyrimidine (T+C) Phương pháp tán xạ tia X dùng để nghiên cứu cấu trúc không gian của protein và nucleic acid Xây dựng mơ hình cấu trúc khơng gian phân tử DNA dựa trên kết quả tán xạ tia X VII. 2. Cấu trúc khơng gian của DNA theo Watson - Crick Chuỗi xoắn kép Mỗi mạch gồm khung đường xen kẽ các nhóm phosphate Hai mạch nối với nhau bằng liên kết hydro tại các base A mạch 1 - T mạch 2 C mạch 1 – G mạch 2 Hai mạch đối song song (antiparallel): đầu 5’P mạch 1 đối diện đầu 3’OH mạch 2. Liên kết hydro giữa các base của hai mạch phân tử DNA – tính đặc hiệu H A luôn liên kết với T, G với C – quy tắc bắt cặp bổ sung S lượng A = T, G = C (phù hợp quy tắc Chargaff) 4/20/2010 4 Tổng quan cấu trúc DNA Tương quan giữa cấu trúc và chức năng phân tử DNA Vật chất di truyền chứa thơng tin di truyền : trình tự base. Vật chất di truyền phải có khả năng bị đột biến : thay đổi trình tự base. Vật chất di truyền phải được sao chép chính xác để chuẩn bị cho tế bào phân chia: nhờ quy luật bắt cặp bổ sung giữa các base A – T và C – G. Vật chất di truyền được biểu hiện ra kiểu hình (tương quan kiểu gene – kiểu hình) nhờ q trình phiên mã – dịch mã. VII.3. DNA trong tế bào Hai mạch xoắn kép Nén chặt nhờ xoắn cuộn nhiều cấp (chiều dài bộ gene gấp 1000 chiều dài tế bào) 1. DNA Prokaryote 1 phân tử DNA vòng Siêu xoắn 2. DNA Eukaryote Nhiễm sắc chất =DNA + protein (histone và khác histone) a) Chất đồng nhiễm sắc (Euchromatin): DNA không bò nén, sẵn sàng phiên mã. b) Chất dò nhiễm sắc (Heterochromatin): DNA được nén chặt, bò kìm hãm phiên mã. 4/20/2010 5 NST ở trung kỳ (metaphase) của nguyên phân NST nén chặt (dò nhiễm sắc) Sợi chromatin, các nucleosome được quấn cuộn Chuỗi xoắn kép DNA Chất nhiễm sắc dạng sâu chuỗi (hạt là nucleosome) Vùng NST ở thể lỏng lẻo (đồng nhiễm sắc) Nhiễm sắc chất và nhiễm sắc thể (NST) VII. 4. Sao chép DNA (DNA replication) DNA mẹ Tách rời hai mạch Mi mạch DNA mẹ làm khuôn mẫu tổng hợp một mạch DNA con 1. Mô hình chuỗi xoắn kép của DNA cho phép dự đoán phương pháp sao chép của DNA Cơ chế sao chép bán bảo tồn (semiconservative DNA replication): Từ một phân tử DNA mẹ tạo ra hai phân tử DNA con giống hệt nhau, mội phân tử DNA con chứa một mạch của DNA me.ï 2. Thí nghiệm Meselson & Stahl 1. Nuôi cấy E. coli trong môi trường chứa 15 N là nguồn nitơ duy nhất trong nhiều thế hệ (generation). Lấy mẫu và chiết tách DNA. 2. Chuyển tế bào E. coli sang môi trường chứa 14 N. Sau khi tế bào phân chia một lần, lấy mẫu và chiết tách DNA. 3. Lập lại bước hai. 4. Ly tâm cả ba mẫu DNA nói trên dùng thang nồng độ CsCl, so sánh vò trí của các vệt DNA. 4/20/2010 6 Sao chép bán bảo tồn (semiconservative replication) ½ DNA nhẹ; ½ DNA trung gian giữa nặng và nhẹ 1 vệt DNA trung gian giữa nặng và nhẹ 1 vệt DNA nặng Kết quả thí nghiệm khẳng đònh cơ chế sao chép bán bảo tồn Hướng sao chép: 5’ – 3’ Một mạch DNA đóng vai trò mạch khn Cần tổng hợp đọan mồi theo ngun tắc bắt cặp bổ sung base với mạch khn Enzyme sao chép (DNA polymerase) cần đoạn mồi (RNA primer) để hoạt động 3. Quá trình sao chép DNA a) Tạo liên kết phosphodiester dNTP tạo liên kết phosphodiester với đọan mồi, đồng thời theo ngun tắc bắt cặp bổ sung base với mạch khn Sao chép tiến hành tại một điểm gọi là origine (ori) Mt replicon là một đơn vò sao chép (chứa một ori) DNA vòng của Prokaryote là một replicon. Mỗi sợi DNA Eukaryote có nhiều replicon. Quá trình sao chép diễn ra theo hai hướng. b) Cơ chế sao chép DNA 4/20/2010 7 Cơ chế sao chép DNA i) Khởi sự Tháo xoắn – Helicase Căng mạch – Protein căng mạch (single strand binding protein SSBP) Tổng hợp đoạn mồi – Primase ii) Nối dài – DNA polymerase III Mạch tới tổng hợp liên tục Mạch chậm tổng hợp gián đoạn thành nhiều đoạn Okazaki iii) Kết thúc Mạch chậm: Cắt bỏ đoạn mồi (RNA), tổng hợp DNA thay thế – DNA Polymerase I Nối các đoạn Okazaki – DNA ligase Cơ chế sao chép DNA ở E.coli i) Khởi sự ori Helicase tháo xoắn Protein căng mạch ngăn cản hai mạch tạo xoắn trở lại Khởi sự sao chép tại điểm ori Protein căng mạch Enzyme primase tổng hợp đoạn mồi (RNA primer) cỡ 5 nucleotide ii) Nối dài Tại một chĩa ba sao chép (replication fork): Enzyme DNA polymerase III tạo liên kết phosphodiester giữa các nucleotide vào đoạn mồi và nối dài mạch DNA Mạch tới Mạch chậm Mạch tới và mạch chậm tổng hợp khác nhau nhưng luôn theo chiều 5’-3’ 4/20/2010 8 Mạch tới tổng hợp liên tục Mạch chậm tổng hợp gián đoạn thành các đoạn Okazaki Mạch tới Mạch chậm iii) Kết thúc …và DNA polymerase I tổng hợp DNA thay thế DNA polymerase I cắt bỏ đoạn mồi… DNA ligase nối các đoạn Okazaki Tạo xoắn kép 4. Sao chép DNA ở vi khuẩn a) Cơ chế 1: sao chép theo hai hướng 4/20/2010 9 b) Cơ chế 2: sao chép bằng cách cuộn vòng (rolling circle mehanism) -sao chép DNA khi giao nạp -Virus (phage lamda) Điểm xuất phát sao chép DNA (ori) Đơn vò sao chép DNA con Hợp nhất các đơn vò sao chép Sao chép hai hướng 5. Sao chép DNA ở tế bào Eukaryote 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ Tính chất của DNA polymerase DNA polymerase ở E. coli_ pol I pol II pol III Polymer hóa: 5’ - 3’ + + + Proofreading exonuclease: 3’ - 5’ + + + Exonuclease : 5’ - 3’ + - - DNA polymerase III là enzyme chính trong quá trình sao chép DNA DNA polymerase I trong sao chép DNA loại bỏ đoạn mồi và lấp đầy chỗ trống trên mạch chậm, và đó cũng là enzyme sửa lỗi DNA và được sử dụng để tạo DNA tái tổ hợp.  Tất cả DNA polymerase cần primer với đầu 3’ OH tự do  Tất cả DNA polymerase xúc tác phản ứng tổng hợp DNA (nối dài mạch DNA) theo hướng 5’ - 3’.  Một số DNA polymerases có hoạt tính đọc và sửa lỗi (proofreading activity) tức hoạt tính exonuclease 3’-5’. 6. Ứng dụng sao chép DNA a) PCR = polymerase chain reaction Q trình sao chép tự động một đoạn DNA ngắn nhiều lần in vitro Sao chép mang tính chu kỳ: một số bước lặp lại nhiều lần. Các bước chính: Mạch kép DNA tách rời nhau do bị đun nóng (biến tính) (t> 90 o C) Primer nhân tạo được cho vào hỗn hợp phản ứng cùng với 4 loại dNTP và Tag polymerase Tag polymerase xúc tác phản ứng nối dài và bắt cặp bổ sung mạch mới tổng hợp. Tag polymerase = DNA polymerase chịu nhiệt (95 o C) từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermus aquaticus phân lập từ suối nước nóng. 4/20/2010 10 Nguyên liệu: DNA cần sao chép (DNA đích) Đoạn mồi (10-20 nucleotide) Tag polymerase Các bước của PCR cho mỗi chu kỳ: Đoạn mồi bắt cặp bổ sung với mỗi mạch của DNA đích (khuôn) Tag polymerase nối dài đoạn mồi, tổng hợp mạch DNA con Chu kỳ 1 Chu kỳ 2 Chu kỳ 3 Thời gian mỗi chu kỳ: vài phút Số lượng phân tử DNA tăng theo cấp số nhân [...]... đ nh nh máy tính Màu huỳnh quang ng v i ddNTP cu i cùng 11 4/20/2010 VII 5 Các cơ chế sửa sai và bảo vệ DNA b) Đột biến ngẫu nhiên gây ra do đồng phân hỗ biến (tautomer) 1 Các đột biến có thể xảy ra trên phân tử DNA Các dạng đồng phân hỗ biến của các base trong DNA A, G = purine a) Các dạng biến đổi cặp base T, C = pirimidine Đoạn DNA bình thường CATTCACCTGTACCA GTAAGTGGACATGGT Đồng hoán (từ T-A sang... biến thay thế (substitution mutation) Đồng hoán: pyrimidine này thành pyrimidine khác Dò hoán: pyrimidine thành purine xóa CATCACCTGTACCA GTAGTGGACATGGT Cytosine chèn CATGTCACCTGTACCA GTACAGTGGACATGGT AMINO Có thể mất hoặc thêm nhiều cặp base tại một vò trí Đột biến ngẫu nhiên do đồng phân hỗ biến của cytosine gây ra IMINO Các dạng đồng phân hỗ biến của các base trong DNA Cytosine (Đột biến ngẫu nhiên... uracil adenine thành hypoxanthine 2 Cơ chế sửa lỗi DNA a) Cơ ch đ c và ch a b n nháp (proofreading): ch a l i trong q trình sao chép DNA; Do DNA polymerase th c hi n GI m t l l i t 1/104 – 1/1010 c p base b) Cơ ch s a l i b t c p sai (mismatch repair): Xóa – chèn base Hóa chất (acridine) scan DNA ngay sau khi sao chép đ phát hi n và s a ch a b t c p sai k p th i Tạo dimer Tia cực tím Làm đứt mạch đơn... p t c base b t c p sai Khi tia tử ngoại gây đột biến tạo dimer giữa hai Thymine liên tiếp, ánh sáng thường sẽ phục hồi chỗ sai hỏng nhờ hoạt hóa enzyme photolyase cắt vòng cyclobutyl pirimidine dimer DNA polymerase n i l i base đúng b) Cơ ch mismatch repair Trong q trình sao chép, m t base b t c p sai Enzyme c t b base b t c p sai DNA polymerase n i l i base đúng c) Cơ ch s a ch a b ng c t b M t base... mạch đơn Tia ion hóa; hóa chất (bleomycin) c) Cơ ch s a ch a b ng c t b : nh ng đ t bi n nh u nhiên đư c s a b ng cách c t b base ho c nucleotide b l i và t ng h p l i Làm dính hai mạch Các dẫn xuất của Psoralen; mitomycin C Tạo các đồng phân tautomer Tự phát Hiệu quả: Ở tb vi khuẩn 50% thông tin không bò biến đổi sau 100 triệu lần sao chép 13 4/20/2010 a) Cơ ch đ c và ch a b n nháp Trong q trình sao... lk hydro Dạng bình thường amino Cytosine Adenine Thymine Dạng đồng phân hỗ biến imino Cytosine bắt cặp nhầm với adenine gây đột biến đổi đồng hoán KETO ENOL 12 4/20/2010 c) Biến đổi do hóa chất gây ra i) Làm mất amin (deamination) do tác nhân oxy hóa ảnh hưởng đến tính đặc hiệu của lk hydro d) Biến đổi do tia cực tím Tia cực tím tạo dimer giữa hai thymine liên tiếp DNA Pol III bò cản trở khi tổng hợp... p ng ng l i Đi n di DNA ddNTP Đi n di (electrophoresis) các m ch DNA m i t ng h p: Phương pháp s p x p DNA theo đ dài V t dư i = m ch ng n V t trên = m ch dài Trong h n h p có nhi u m ch DNA m i đư c t ng h p v i đ dài khác nhau, nucleotide cu i cùng ln là ddNTP M i m ch phát huỳnh quang v i màu khác nhau Màu huỳnh quang đư c xác đ nh nh chùm laser Trình t base đư c xác đ nh nh máy tính Màu huỳnh quang... ch c n xác đ nh v i các dNTP và ddNTP (dideoxiribonucleoside triphosphate) đư c g n nhóm ch c phát huỳnh quang cũng ng d ng: genomics – gi i mã b gene sinh v t DNA c n xác đ nh trình t base đư c đun nóng đ có m ch đơn DNA m ch đơn T ng h p m ch b t c pb sung b t đ u Primer DNA polymerase dNTP Nhóm OH C 3’ b m t oxy, dNTP ti p theo khơng th t o liên k t phosphodiester Khi ddNTP g n vào m ch DNA đang... : đột biến làm biến đổi amino acid Đôt bíên vô nghóa (nonsense mutation): đột bíên tạo stop signal Hậu quả gây đột biến dòch khung (frameshift mutation): thay đổi trình tự polypeptide, gây nhiều bệnh di truyền 14 4/20/2010 c) Chèn base Đột biến dòch khung gây ra do mất hay chèn base mRNA (a) và mRNA (b) chỉ khác nhau là G chèn vào vò trí thứ ba từ trái sang DNA mRNA protein Đột biến DNA gây đột bíên... base b t c p sai DNA polymerase n i l i base đúng c) Cơ ch s a ch a b ng c t b M t base b bi n đ i (h ng) Enzyme c t b base h ng và m t s base bên c nh DNA polymerase t ng h p l i đo n c tb 3 Hậu quả của đột biến DNA Nếu không kòp thời sửa chữa… a) Đột biến thay thế (subsitution mutation) – đột biến điểm Mũi tên xanh: dồng hóan Mũi tên đỏ: dò hoán Đột biến âm thầm (silent mutation): không làm thay . 1 PHẦN II: CƠ SỞ DI TRUYỀN HỌC CHƯƠNG VII: CƠ SỞ PHÂN TỬ CỦA TÍNH DI TRUYỀN TS. Nguyễn Hồi Hương VII. 1. Q trình khám phá DNA là vật chất di truyền 1865-. quan giữa cấu trúc và chức năng phân tử DNA Vật chất di truyền chứa thơng tin di truyền : trình tự base. Vật chất di truyền phải có khả năng bị đột biến