Cơ sở phân tử của tính di truyền

DNA LÀ CHẤT DI TRUYỀN • Vào năm 1868, vài năm sau khi Mendel công bố các quy luật di truyền Friedrich Miescher, nhà sinh hóa học Thụy Sĩ phát hiện trong nhân tế bào mủ một chất không phả

CHƯƠNG VIII

CƠ SỞ PHÂN TỬ CỦA TÍNH DI TRUYỀN

• I DNA LÀ CHẤT DI TRUYỀN.

• II CẤU TRÚC CỦA DNA.

• III SAO CHÉP DNA.

• IV CÁC CƠ CHẾ SỬA SAI VÀ BẢO VỆ DNA.

• V DNA THỎA MÃN CÁC YÊU CẦU ĐỐI VỚI CHẤT DI TRUYỀN.

• Sau khi tìm hi u c u trúc và s bi n ể ấ ự ế đổ ă i n ng

l ượ ng c a t bào, ch ủ ế ươ ng này i sâu vào các c đ ơ

ch ế phân t c a tính di truy n, ử ủ ề mà DNA (Desoxyribonucleic acid) óng vai trò trung tâm đ

T t c các t bào c a t t c các sinh v t trên ấ ả ế ủ ấ ả ậ hành tinh chúng ta đề u có b máy di truy n hay ộ ề

h gen ệ (genome) v i c u trúc chung là DNA, mà ớ ấ

vi c th c hi n ch c n ng c ng gi ng nhau ệ ự ệ ứ ă ũ ố

v c n b n Phát minh ra c u trúc c a ề ă ả ấ ủ phân t ử DNA, ã t o ra cu c cách m ng trong Sinh đ ạ ộ ạ

h c, m ọ ở đầ u Sinh h c phân t ọ ử Phân t DNA ử tho mãn các yêu c u ả ầ đố i v i v t ch t di ớ ậ ấ truy n: ề ch a ứ và truy n ề đạ t thông tin, t sao ự chép chính xác, có kh n ng ả ă bi n d ế ị và s a sai ử

I DNA LÀ CHẤT DI TRUYỀN

• Vào năm 1868, vài năm sau khi Mendel công bố các quy luật di truyền Friedrich Miescher, nhà sinh hóa học Thụy Sĩ phát hiện trong nhân tế bào mủ một chất không phải protein, đó là acid nucleic

• Năm 1914, nhà hóa học Đức R.Feulgen tìm ra phương pháp nhuộm màu đặc hiệu đối với DNA và mười năm sau cho thấy DNA của nhân giới hạn trong các nhiễm sắc thể Mãi đến năm 1944 vai trò mang thông tin di truyền của DNA mới được Avery và các cộng sự chứng minh và đến năm 1952 được công nhận sau nhiều tranh cãi.

Friedrich

Miescher

1 Hiện tượng biến nạp (transformation) ở vi khuẩn

• Hiện tượng biến nạp được Griffith phát hiện ở vi khuẩn

Diplococus pneumoniae (nay gọi là Streptococus pneumoniae - phế cầu khuẩn gây sưng phổi ở động vật có vú) vào năm 1928 Vi khuẩn này có 2 dạng khác nhau:

• Dạng SIII, gây bệnh có vỏ bao tế bào (capsule) bằng

polysaccharide cản trở bạch cầu phá vỡ tế bào Dạng này tạo đốm mọc (khuẩn lạc) láng (Smooth-láng) trên môi trường agar

• Dạng RII, không gây bệnh, không có vỏ bao, tạo đốm

mọc nhăn (Rough-nhăn).

• Thí nghiệm được tiến hành như mô tả trên hình 8.1.

Thí nghiệm biến nạp ở chuột

Thí nghiệm biến nạp ở chuột

• Tiêm vi khuẩn S sống gây bệnh cho

chuột - chuột chết.

• Tiêm vi khuẩn R sống không gây bệnh

- chuột sống.

• Tiêm vi khuẩn S bị đun chết cho chuột

- chuột sống.

• Hỗn hợp vi khuẩn S bị đun chết trộn

với vi khuẩn R sống đem tiêm cho chuột - chuột chết Trong xác chuột chết có vi khuẩn S và R.

• Vi khuẩn S không thể tự sống khi bị đun chết,

nhưng chúng đã truyền tính gây bệnh cho tế bào

R gọi là biến nạp (transformation).

• Năm 1944, T.Avery, Mc Leod và Mc Carty đã

xác định tác nhân gây biến nạp là DNA :

• - Nếu các tế bào S chết bị xử lý bằng protease

(hủy protein) hoặc ARN-ase (phân hủy ARN) hoạt tính biến nạp vẫn còn :protein và ARN không phải là tác nhân gây biến nạp

• Nhưng nếu tế bào S chết bị xử lý bằng DNA-ase

(enzyme chỉ phân hủy đặc hiệu DNA) thì hoạt tính biến nạp không còn nữa, chứng tỏ DNA là nhân tố biến nạp.

• Kết quả thí nghiệm có thể tóm tắt như

sau:

DNA của S + các tế bào R sống

-> chuột -> chết (có R + S)

Kết luận: Hiện tượng biến nạp là một chứng minh sinh hóa xác nhận rằng DNA mang tín hiệu di truyền

• Thời đó, vai trò của DNA vẫn chưa được công nhận vì cho rằng vẫn còn một ít protein.

• Về sau có thể thực hiện biến nạp không chỉ với tính trạng gây bệnh, mà còn nhiều tính trạng khác như tính đề kháng thuốc hay tổng hợp chất này chất nọ Biến nạp có thể thực hiện ở nhiều loại vi khuẩn khác nhau

• Ngày nay có thể thực hiện được biến nạp ở sinh vật Eukaryotae như nấm men, tế bào thực vật, tế bào chuột và cả tế bào người, có thể thực hiện biến nạp giữa các loài khác nhau rất

xa trong hệ thống phân loại

• Biến nạp được coi như phương tiện vạn năng (universal) để chuyển gen giữa các sinh vật khác nhau.

2 Sự xâm nhập của DNA virus vào vi

khuẩn.

• Năm 1952, Hershey và Chase đã tiến hành thí

nghiệm với bacteriophage T2 (virus của vi khuẩn được gọi là bacteriophage - thực khuẩn thể hay gọi tắt là phage) xâm nhập vi khuẩn Escherichia coli (E.coli) Phage T2 có cấu tạo đơn giản gồm vỏ protein bên ngoài và ruột DNA bên trong (hình 7.2) Khi cho phage T2 vào vi khuẩn, chúng gắn lên bề mặt bên ngoài, một phần chất nào đó xâm nhập vào vi khuẩn và sau 20 phút tế bào vi khuẩn bị bể ra phóng thích nhiều phage mới.

Virus đốm thuốc lá

• Thí nghiệm của Hershey và Chase nhằm xác định xem

phage nhiễm vi khuẩn đã bơm chất nào vào tế bào vi khuẩn: chỉ DNA, chỉ protein hay cả hai Vì DNA chứa nhiều Phosphore nhưng không có Sulfur (lưu huỳnh) còn protein chứa Sulphur nhưng không Phosphore, nên có thể phân biệt giữa DNA và protein nhờ các đồng vị phóng xạ P32 và S35 Phage được nuôi trên vi khuẩn đã mọc trên môi trường chứa các đồng vị phóng xạ P32 và đồng vị phóng xạ S35 S35 xâm nhập vào protein và P32 vào DNA của phage Phage nhiễm phóng xạ này được tách ra đem cho nhiễm các vi khuẩn không bị nhiễm phóng xạ

• Cho phage nhiễm trong một khoảng thời gian đủ để bám vào vách tế bào vi khuẩn và bơm chất nào đó vào trong tế bào, rồi dung dịch được lắc mạnh và ly tâm để tách rời tế bào vi khuẩn khỏi phần phage bám bên ngoài vách tế bào Phân tích phần nằm ngoài vi khuẩn cho thấy nó chứa nhiều S35 (80%) nhưng rất ít P32, chứng tỏ phần lớn protein vỏ của phage nằm ngoài tế bào vi khuẩn

• Phân tích phần trong các tế bào vi khuẩn thấy chúng chứa

nhiều P32 (70%) nhưng rất ít S35, chứng tỏ DNA được bơm vào trong tế bào Thí nghiệm này chứng minh trực tiếp rằng DNA của phage T2 ban đầu đã xâm nhập vào tế bào vi khuẩn và chúng sinh sản tạo ra thế hệ phage mới mang tính di truyền có khả năng tiếp tục nhiễm các vi khuẩn khác.

• Kết luận: Vật chất di truyền của phage T2 là DNA.

• Sau thí nghiệm này vào năm 1952 nhiều cuộc tranh cãi sôi nổi đã diễn ra về vai trò của DNA là vật chất di truyền Các số liệu thu được tiếp theo đã khẳng định điều đó.

II THÀNH PHẦN VÀ CẤU TRÚC

HÓA HỌC CỦA DNA

• 1 Thành phần hóa học.

• Desoxyribonucleic acid là polinucleotide từ

các đơn phân (monomer) nucleotide.

Nitrogenous base gồm hai purine là Adenine (A) và Guanine (G) và hai pirimidine là

Cytosine (C) và Thymine (T) , ở RNA còn có Uracil (U)

Kết quả phân tích hóa học của DNA ở những sinh vật khác nhau cho thấy sự giống nhau đặc biệt giữa các đơn chất hợp thành DNA Thành phần hóa học của DNA gồm có gốc acid phosphoric, đường 5-desoxyribose và các base nitric Base nitric gồm hai purine là Adenine (A) và Guanine (G) và hai pirimidine là Cytosine (C) và Thymine (T)

CÁC BASE PURINE VÀ PIRIMIDINE

• Vào những năm 1930, Carpersson phát hiện phân tử DNA rất lớn, hơn cả protein Những phân tử DNA nhỏ nhất cũng vài nghìn nucleotide, còn những phân tử lớn nhất dài hơn cả triệu cặp nucleotide.

• Tất cả sinh vật đều có chung một cấu trúc DNA Tính đặc trưng của DNA một loài chỉ biểu hiện ở sự sắp xếp các nucleotide theo một trình tự dọc theo chiều dài và số lượng của chúng.

2 Mô hình cấu trúc DNA Watson -

Crick.

• Cấu trúc không gian của DNA đã hấp dẫn

nhiều nhà khoa học

• Năm 1950 hầu như chưa biết gì về sự sắp xếp

không gian của các nguyên tử trong DNA và

dĩ nhiên cũng chưa biết bằng cách nào nó chứa thông tin cho sao chép và kiểm soát các hoạt động của tế bào

• Vào thời gian này một số nhà nghiên cứu bắt

đầu sử dụng kỹ thuật phân tích dùng tán xạ tia X (X-ray diffraction analysis) đối với DNA.

Kỹ thuật phân tích tán xạ tia X (X-ray

diffraction analysis)

• Nổi bật nhất trong số đó là Rosaline

Franklin và Maurice Wilkins ở London, họ đã thu nhận những kết quả rõ nhất Lúc này Francis Crick cũng vừa nêu ra phương pháp toán học giải thích kết quả của tán xạ tia X đối với các cấu trúc xoắn của protein và dùng nó giải thích các hình ảnh do Franklin và Wilkins thu được.

ROSALIND

MAURICE

WILKINS

• Người ta nhận thấy không những DNA từ các nguồn khác nhau cho các đặc tính phân tích tán xạ giống nhau, mà cũng chính những tán xạ đó sẽ nhận được không phụ thuộc vào các sợi DNA được tách riêng ra hoặc ở trạng thái tự nhiên (intact) như khi nằm trong đầu tinh trùng hay trong phage

• Những tính chất căn bản thu được như sau:

• Các base purine và pirimidine có cấu trúc phẳng,

mặt phẳng của chúng xếp vuông góc với trục dài của mạch polynucleotid và chúng chồng cái này lên cái kia như một cột gồm những viên gạch chồng lên nhau, khoảng cách trung tâm của hai mặt phẳng kề nhau là 3,4 Anstrom.

• Mạch polynucleotid không duỗi thẳng mà xoắn thành lò xo quanh trục giữa, mỗi bước xoắn của lò

xo dài 34 Anstrom.

• Số liệu tính toán cũng cho thấy DNA có nhiều hơn một mạch polynucleotide.

Mô hình chuỗi xoắn kép DNA của

Watson - Crick

• Vào năm 1953, J.Watson và F.Crick đã thực hiện bước quyết định cuối cùng bằng sự tổng hợp tài tình các số liệu phân tích hóa học và tán xạ tia X để xây dựng đúng đắn mô hình cấu trúc của phân tử DNA, còn gọi là mô

hình DNA Watson - Crick hay chuỗi xoắn

kép Mô hình gồm hai mạch polinucleotide bắt cặp bổ sung (complementary) tạo lò xo

xoắn kép

• Vào năm 1951, F.Crick mới 35 tuổi bắt đầu

quan tâm đến DNA Thực ra từ năm 1946, sau khi đọc cuốn sách "Sự sống là gì?" (“What is a life?”) theo quan điểm của nhà vật lý học lý thuyết nổi tiếng E.Schrodinger (được giải Nobel), Crick đã bỏ vật lý học và theo sinh vật học Thời gian này James Watson khoảng 25 tuổi, sau khi bảo vệ tiến

sĩ được đến thực hiện hậu tiến sĩ (postdoctoral) ở Cambridge Sự hợp tác của Watson và Crick đã dẫn đến một trong những phát minh lớn nhất của thế kỷ 20.

Nguyên tắc bổ sung

• :Hai mạch được gắn với nhau bằng các liên kết

hydro giữa các base đối diện với nhau theo từng cặp: đối diện Adenine làø Thymine, đối diện Guanine là Cytosine.

• Watson và Crick đã đi đến kết luận rằng A bắt

cặp với T và G với C hoàn toàn dựa trên tính toán lý thuyết và điều này bất ngờ giải thích phát hiện của E.Chargaff (Mỹ) vào năm 1951 rằng trong tất cả các loại DNA đều chứa cùng một số lượng A và T đúng như nhau; G và C cũng có cùng một số lượng đúng như nhau.

• Tóm lại, theo mô hình của Watson - Crick phân tử

DNA là một chuỗi xoắn kép mà hai mạch gồm khung đường xen kẽ với các nhóm phosphate, được gắn với nhau nhờ các liên kết hydro giữa Adenine với Thymine ở mạch đối diện và giữa Guanine với Cytosine ở mạch đối diện Từ năm 1953 đến nay mô hình đó được củng cố bằng các nghiên cứu tiếp theo và chấp nhận Watson, Crick và Wilkins đã nhận giải thưởng Nobel vào năm 1962ù.

Watson và Crick với mô hình DNA (1953)

M.H.F.Wilkins

R.Franklin (1921-1958) và hình chụp

nhiễu xạtia X với mẫu DNA

Công bố đầu tiên về

Chuỗi xoắn kép DNA

Koch,Pasteur, Watson và Crick

J.D.Watson và F.H.C.Crick

Crick (1916-2004) và Watson (1928-)

CAÁU TRUÙC DNA

SỰ BẮT CẶP BỔ SUNG

• Một đặc điểm của mô hình là sự đối song

song (anti-paralell) Để các base tương ứng đối diện với nhau, hai mạch cần phải bố trí đầu sợi này đối diện với đuôi sợi kia Mỗi mạch đơn có một đầu mang nhóm P tự do gắn vào C’5 của đường desoxyribose nên gọi là đầu 5'P, còn đầu kia có nhóm OH ở vị trí C’3 nên gọi là đầu 3'OH Hai mạch có đầu ngược nhau như sau:

• 5'P 3'OH

• 3'OH 5'P

Glycosidic bond

CAC BIẾN ĐỔI TAUTOMER CỦA

NUCLEOTIDE

Primary structure of nucleic acids-sequence

NHŨNG TÍNH CHẤT DNA

• ĐẶC BIỆT NGUYÊN TẮC BỔ SUNG :

• - Sao chép chính xác.

• -Phiên mã

• - Sữa sai.

• - Lai DNA

• - Chẩn đoán phân tử

• - Antisense (Phản RNA)

• - RNAi (RNA interference)

• Hy vọng các bạn có thể tìm thêm ứng dụng

mới

• – Cơ sở cho sự truyền đạt thông tin từ DNA

đến RNA và protein.

• – Cơ sở cho sự sao chép chính xác của vật chất

di truyền.

• – Cơ chế phân tử của đột biến.

• – Biết trình tự nucleotide mạch 1, suy ra trình tự tương ứng mạch 2.

• – Biến tính (Denaturation) và hồi tính

(renaturation) DNA dẫn đến lai nucleic acid và lai phân tử làm cơ sở cho các chẩn đoán mới.

• – Tiềm năng cho sữa sai, khi sai ở mạch 1 dựa vào mạch 2 để sửa sai

– Thuận tiện cho cắt nối, ghép gen.

MÔ HÌNH CẤU TRÚC DNA CỦA

WATSON-CRICK

• – Năm 1953, F.Sanger xác định a.a của insulin

• – Năm 1953, mô hình cấu trúc phân tử DNA

của Watson-Crick đặt nền móng cho sự phát

triển của Sinh học phân tử " Học thuyết trung tâm " của sinh học phân tử :

• DNA -> RNA -> protein

• Sao chép phiên mã dịch mãû

• Lúc này Watson mới 25 tuổi

• và Crick 35 tuổi

Biến tính DNA và lai nucleic acid.

3 DNA và nhiễm sắc thể.

• a DNA trong tế bào.

• DNA hiện diện trong bộ máy di truyền của tất cả các loại tế bào từ vi khuẩn đến người Ti thể và lục lạp cũng có DNA riêng Giửa các sinh vật Prokaryotae và Eukaryotae có sự khác nhau đáng kể về thành phần cấu tạo và tổ chức của DNA trong tế bào

• Bộ gen của E coli và đa số các Prokaryotae là một phân tử DNA vòng tròn Khái niệm nhiễm sắc thể hiện nay được dùng cho cả vi khuẩn, nên nói nhiễm sắc thể vi khuẩn ta hiểu đó là sợi DNA.

• Đa phần DNA của Eukaryotae được tổ chức thành nhiều nhiễm sắc thể trong nhân tế bào Mỗi nhiễm sắc thể chứa 1 phân tử DNA thẳng mạch kép Các nhiễm sắc thể có số lượng và hình dạng đặc trưng cho tế bào của mỗi loài sinh vật.

• Có sự khác nhau đáng kể về số lượng DNA giửa

các tế bào prokaryota và eukaryota DNA của E.coli chứa khoảng 4.10 6 cặp base, còn DNA của tế bào người nhiều hơn gấp 1.000 lần, khoảng 3,2.10 9 cặp base.

• DNA trong tế bào thường ở dạng xoắn và cuộn lại rất chặt Một DNA vòng tròn của E.coli nếu kéo thẳng sẽ dài khoảng 1,35 mm gấp 1.000 lần chiều dài tế bào

• DNA tế bào đơn bội của người nếu kéo thẳng và

nối đuôi nhau dài khoảng 1m cũng gấp 1.000 lần chiều dài tế bào Do đó, trong tế bào DNA phải xoắn chặt và gói gọn rất tinh vi mà các gen vẫn biểu hiện khi có nhu cầu

Nucleic acid trong tế bào : DNA mạch kép và siêu xoắn

enzyme topoisomerases có thể thay đổi siêu xoắn

DNA cuộn lại (condensation) : trong nhân cuộn lại

thành các sợi nhiễm sắc (chromatin fibers)

DNA in the nucleus is

condensed into

chromatin fibers

b Nhiễm sắc thể của Eukaryotae

• Các nhiễm sắc thể của Eukaryotae có tổ chức

phức tạp gồm DNA và vài loại protein gắn vào Trong đó, histone là protein giữ vai trò cốt lõi trong cuộn lại của DNA Các histone là những protein nhỏ chứa nhiều acid amin mang điện tích dương (lysin và arginin) nên gắn chặt với DNA điện tích âm Sợi DNA dài quấn quanh các protein histone tạo nên nucleosome là đơn

vị cấu trúc của nhiễm sắc thể Đơn vị này là phức hợp gồm 146 cặp base của DNA quấn quanh 8 phân tử histone (4 loại x 2 phân tử) Các nucleosome kề nhau được nối qua một phân tử histone H1 trung gian (hình 7.5)