NGUYÊN TẮC VÀ MỘT SỐ ỨNG DỤNG CỦA CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ CƠ BẢN

NGUYÊN TẮC VÀ MỘT SỐ ỨNG DỤNG CỦA CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ CƠ BẢNTS.BS.. Các kỹ thuật khảo sát nhiễm sắc thể 2..  Chỉ khảo sát được khi nuôi cấy bệnh phẩm thành công  Không phát h

NGUYÊN TẮC VÀ MỘT SỐ ỨNG DỤNG CỦA CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ CƠ BẢN

TS.BS Hoàng Anh Vũ

Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh

Nội dung:

1 Các kỹ thuật khảo sát nhiễm sắc thể

2 Các kỹ thuật khảo sát nucleic acid

3 Các kỹ thuật khảo sát protein

Mục tiêu:

1 Nhận diện được kỹ thuật tương ứng mức độ phân tử

NỘI DUNG – MỤC TIÊU

Southern blot (DNA)Northern blot (RNA)PCR

DNA sequencing

 Bản đồ của bộ nhiễm sắc thể của một cá thể

NHIỄM SẮC THỂ ĐỒ (KARYOTYPE)

Cấy tế bào

Thu hoạch

(Acid acetic: methanol)

Cytokines (tủy: 1 – 2 ngày, máu: 2 -3, ối: 5 -7)

Chuẩn bị slide

NST ĐỒ: QUY TRÌNH KỸ THUẬT

BẤT THƯỜNG SỐ LƯỢNG NST:

HỘI CHỨNG DOWN

 Chỉ khảo sát được khi nuôi cấy bệnh phẩm thành

công

 Không phát hiện được những bất thường nhỏ (độ

phân giải thấp)

 Tốn nhiều thời gian và nhân lực

HẠN CHẾ CỦA NST ĐỒ

 Lai tại chỗ gắn huỳnh quang: lai phân tử thực

hiện ngay trong tế bào mà không cần tách chiết

nucleic acid ra khỏi tế bào

 Cung cấp thông tin chính xác về vị trí và phân bố của đoạn DNA quan tâm trên NST nhờ một mẫu dò

FISH (fluorescence in situ hybridization)

 Probe: Chuỗi DNA đã đƣợc đánh dấu

 Denature (biến tính): Chuỗi đôi DNA tách rời thành chuỗi đơn

 Hybridize (lai hóa): Các chuỗi đơn DNA đặc hiệu sẽ bắt cặp đƣợc với nhau

Bình thường:

2 tín hiệu màu đỏ

Ung thư vú: nhiều tín hiệu đỏ

HER2/neu

HÌNH ẢNH TĂNG BIẾU HIỆN GEN HER2/NEU

TRONG UNG THƯ VÖ

nl(9) nl(9)

nl(22)

nl(22)

nl(9) der(9)

SOUTHERN BLOT: NGUYÊN TẮC KỸ THUẬT

SOUTHERN BLOT: QUY TRÌNH KỸ THUẬT

• Phát hiện những thay đổi về cấu trúc của DNA

(mất đoạn, thêm đoạn)

• Có thể phát hiện đột biến điểm nếu đột biến làm

thay đổi điểm cắt của men cắt hạn chế (restriction

enzyme)

SOUTHERN BLOT: ỨNG DỤNG

Probe: C4 Probe: CYP21

MẤT ĐOẠN GEN CYP21 VÀ C4B

TRONG BỆNH THIẾU 21-HYDROXYLASE

ĐỘT BIẾN TẾ BÀO HÌNH LIỀM

 Ứng dụng chính: Khảo sát biểu

hiện gen (RNA) trong mô

NORTHERN BLOT

PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION):

NGUYÊN TẮC KỸ THUẬT

PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION):

NGUYÊN TẮC KỸ THUẬT

1 Khuôn mẫu (template DNA): đoạn gen mục tiêu được

khuếch đại (beta-globin: 1,6 kb/3.300 Mb = 1/2.000.000)

2 Cặp mồi (primer): khoảng 18 – 25 bp

tổng hợp chuỗi DNA

4 Polymerase chịu nhiệt: Xúc tác phản ứng

5 Buffer: Tạo môi trường cho polymerase hoạt động (ổn định

CÁC THÀNH PHẦN QUAN TRỌNG CỦA PCR

GENOMIC PCR VÀ RT-PCR

• Khảo sát các exon và vùng nối exon – intron

• Có thể sử dụng các bệnh phẩm bảo quản trong mô vùi nến

RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR, không phải real time PCR):

• Chỉ khảo sát các exon, không khảo sát intron

• Đặc biệt quan trọng trong khảo sát các gen tổ hợp (fusion gene)

và biểu hiện gen

• Bệnh phẩm phải đƣợc bảo quản đúng cách: Không dùng chống

GENOMIC PCR VÀ RT-PCR

1 Tạo sản phẩm ngắn: Vài trăm bp, tối đa 5 kb

2 Thiếu “trung thực” (infidelity): Taq DNA

polymerase không có hoạt tính proofreading

NHƯỢC ĐIỂM CỦA PCR

Phải sử dụng polymerase có hoạt tính

sửa sai khi cần giải trình tự chuỗi DNA

Real time PCR (Quantitative PCR, Q-PCR) Tinh sạch

GIẢI TRÌNH TỰ CHUỖI DNA

(DNA SEQUENCING)

MÁY GIẢI TRÌNH TỰ

1 Chẩn đoán sự hiện diện của gen/tác nhân gây bệnh

• BCR/ABL: Bạch cầu mạn dòng tủy (Imatinib)

• PML/RARA: Bạch cầu cấp dòng tủy (Retinoic acid)

• FIP1L1/PDGFRA: Hội chứng tăng eosinophil (Imatinib)

• TMPRSS2/ERG: Ung thƣ tiền liệt tuyến

• EML4/ALK: Ung thƣ vú, ung thƣ đại trực tràng, ung thƣ phổi

• Các yếu tố vi sinh: HBV, HCV, HPV, lao,

của gen/tác nhân gây bệnh trong quá trình điều

trị: HIV, HBV, HCV, BCR/ABL,…

PCR VÀ DNA SEQUENCING: ỨNG DỤNG

3 Chẩn đoán các đột biến gen

• Nguy cơ bệnh: BRCA1 (ung thƣ vú), APC (đa polyp tuyến gia đình), VHL (ung thƣ thận), đột biến vùng precore của HBV (ung thƣ gan), LDLR (tăng cholesterol gia đình),

• Chẩn đoán bệnh: JAK2 (tăng sinh tủy), globine (thalassemia),

BTK (X-linked agammaglobulinemia), ATP7B (bệnh Wilson), khoảng 6000 bệnh đơn gen gây khuyết tật bẩm sinh

• Tiên lƣợng bệnh: P53 (các loại ung thƣ); FLT3, NPM1 (bạch

PCR VÀ DNA SEQUENCING: ỨNG DỤNG

Mất đoạn NST (3 Mb)

NST 21

RT-PCR phát diện gen tổ hợp TMPRSS2/ERG

UNG THƢ TIỀN LIỆT TUYẾN: CƠ CHẾ PHÂN TỬ

Bệnh phẩm: Mô tươi, mô đông lạnh

(không dùng chất cố định)

Tách chiết RNA (RNase!)

Chuyển mRNA thành cDNA bằng

UNG THƢ TIỀN LIỆT TUYẾN:

QUY TRÌNH PHÁT HIỆN TMPRSS2/ERG

1 Mất đoạn (deletion): Alpha-thalassemia

2 Thêm đoạn (duplication, insertion):

FLT3 trong bệnh bạch cầu cấp dòng tủy

3 Đột biến điểm (point mutation):

+ Đột biến sai/nhầm nghĩa (missense mutation): Thay bằng amino acid khác

(BRAF trong ung thư giáp).

+ Đột biến vô nghĩa (nonsense mutation): Stop codon

CÁC KIỂU ĐỘT BIẾN GEN THƯỜNG GẶP

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 M

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

11

12 13 14 15 16 17

Đột biến gây bệnh Nhầm nghĩa

SNP Thay đổi ở intron

IVS7+36delCTT

Ser265Ser Ser694Ser Leu771Leu Pro871Leu Glu1038Gly Lys1183Arg

Glu143Lys

Tyr856His Val1247Ile

BÌNH THƯỜNG

ĐỘT BIẾN

21 31

33 46

ĐỘT BIẾN MẤT ĐOẠN GEN GLOBINE GÂY

α-THALASSEMIA

ASO-PCR (Allele Specific Oligonucleotide):

CHẨN ĐOÁN ĐỘT BIẾN ĐIỂM

ĐỘT BIẾN ĐIỂM JAK2 V617F

TRONG RỐI LOẠN TĂNG SINH TỦY

A

255 Glu

GTG 256 Val

TAC 257 Tyr

GGG 254 Gly

TAC 253 Tyr

CAG 252 Gln

A A G

L y s

Chuỗi bình thường

BẠCH CẦU MẠN DÕNG TỦY:

ĐỘT BIẾN KHÁNG IMATINIB

(Lynch TJ, N Engl J Med 2004)

ĐỘT BIẾN EGFR TRONG UNG THƢ PHỔI

• Carcinôm tuyến > carcinôm

ĐÁP ỨNG VỚI THUỐC ỨC CHẾ EGFR

PHỤ THUỘC KIỂU ĐỘT BIẾN

KHẢO SÁT ĐỘT BIẾN EGFR VÀ K-RAS

TRÊN BỆNH NHÂN VIỆT NAM UNG THƢ PHỔI KHÔNG TẾ BÀO NHỎ

Wild-type

Đột biến

• MỤC TIÊU: 100 BỆNH NHÂN

• ĐÃ THỰC HIỆN: 7/12 BN

HÓA MÔ MIỄN DỊCH WESTERN BLOT

SO SÁNH CÁC KỸ THUẬT SOUTHERN, NORTHERN

VÀ WESTERN BLOT

TMPRSS2/ERG Ung thƣ bàng quang: NST 3, 7, 9, 17

TÓM TẮT ỨNG DỤNG CỦA CÁC KỸ THUẬT

1 Huyết học:

Các gen tổ hợp: AML, CMLDeletion: alpha-thalasemia

Đột biến điểm JAK2 : MPD

2 Ung thƣ

Colorectal: KRAS , p53

3 Tim mạch: Brugada syndrome (SCN5A)

Idiopathic cardiac hypertrophy (sarcomere-gene

mutations),Wafarin (CYP2C9, VKORC1)

4 Sản phụ khoa: Metformin/polycystic ovary

syndrome (STK11)

5 Nội tiết

Tiểu đường type 2 (TCF7L2 polymorphisms)

6 Di truyền: Wilson, tăng cholesterol máu,

7 .

Trung tâmY sinh học phân

tử

Ung thƣBệnh truyền nhiễm

Huyết học

Nhi khoa – di

truyền

Da liễu