NGUYÊN TẮC VÀ MỘT SỐ ỨNG DỤNG CỦA CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ CƠ BẢN

NGUYÊN TẮC VÀ MỘT SỐ ỨNG DỤNG CỦA CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ CƠ BẢN TS.BS. Hoàng Anh Vũ Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 03 năm 2011 1 Nội dung: 1. Các kỹ thuật khảo sát nhiễm sắc thể 2. Các kỹ thuật khảo sát nucleic acid 3. Các kỹ thuật khảo sát protein 2 Mục tiêu: 1. Nhận diện đƣợc kỹ thuật tƣơng ứng mức độ phân tử 2. Nêu đƣợc cơ chế phân tử và cách phát hiện bất thƣờng 3. Liệt kê ứng dụng của PCR và giải trình tự DNA NỘI DUNG – MC TIÊU Cơ thể người Cơ quan/hệ thống Mô Tế bào Các phân tử sinh học (nucleic acid, protein) 3 Nhiễm sắc thể Deoxyribonucleic acid (DNA) (+ Histone) Ribonucleic acid (RNA) Protein Nhiễm sắc thể đồ FISH Southern blot (DNA) Northern blot (RNA) PCR DNA sequencing Hóa mô miễn dịch Western blot 4  Bản đồ của bộ nhiễm sắc thể của một cá thể  Nam bình thường: 46,XY  Nữ bình thường: 46,XX 5 NHIM SẮC TH ĐỒ (KARYOTYPE) Cấy tế bào Thu hoạch Thu hoạch tế bào 0.075 M KCl Cố định (Acid acetic: methanol) Cytokines (tủy: 1 – 2 ngày, máu: 2 -3, ối: 5 -7) Chuẩn bị slide Nhuộm băng • G-banding • Q-banding • (R, C, T, NOR) Phân tích 20- 30 metaphase 6 NST ĐỒ: QUY TRNH K THUẬT 7 BT THƢỜNG SỐ LƢNG NST: HỘI CHNG DOWN 8 t(9:22): chuyển vị nhiễm sắc thể 9 và 22 BT THƢỜNG CU TRÖC NST: BNH BCH CU MN DÕNG TY (CML)  Chỉ khảo sát đƣợc khi nuôi cấy bệnh phẩm thành công  Không phát hiện đƣợc những bất thƣờng nhỏ (độ phân giải thấp)  Tốn nhiều thời gian và nhân lực 9 HN CH CA NST ĐỒ  Lai tại chỗ gắn huỳnh quang: lai phân tử thực hiện ngay trong tế bào mà không cần tách chiết nucleic acid ra khỏi tế bào  Cung cấp thông tin chính xác về vị trí và phân bố của đoạn DNA quan tâm trên NST nhờ một mẫu dò (probe) chuyên biệt 10 FISH (fluorescence in situ hybridization) [...]... SOUTHERN BLOT • Cần lƣợng lớn DNA (microgram) • Kỹ thuật phức tạp, tốn nhiều thời gian • Phần lớn các ứng dụng đã đƣợc thay thế bởi PCR 19 NORTHERN BLOT  Ứng dụng chính: Khảo sát biểu hiện gen (RNA) trong mô  Kỹ thuật phức tạp, tốn thời gian 20 PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION): NGUYÊN TẮC KỸ THUẬT 21 PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION): NGUYÊN TẮC KỸ THUẬT 22 CÁC THÀNH PHẦN QUAN TRỌNG CỦA PCR 1... (dNTPs): Nguyên liệu cho tổng hợp chuỗi DNA 4 Polymerase chịu nhiệt: Xúc tác phản ứng 5 Buffer: Tạo môi trƣờng cho polymerase hoạt động (ổn định pH, nồng độ HCl và Mg++ phù hợp) 23 KHUÔN MẪU (TEMPLATE) Genomic DNA mRNA reverse transcriptase cDNA Genomic PCR RT-PCR 24 GENOMIC PCR VÀ RT-PCR 25 GENOMIC PCR VÀ RT-PCR Genomic-PCR: • Khảo sát các exon và vùng nối exon – intron • Có thể sử dụng các bệnh...FISH: NGUYÊN TẮC KỸ THUẬT  Probe: Chuỗi DNA đã đƣợc đánh dấu  Denature (biến tính): Chuỗi đôi DNA tách rời thành chuỗi đơn  Hybridize (lai hóa): Các chuỗi đơn DNA đặc hiệu sẽ bắt cặp đƣợc với nhau ở điều kiện thích hợp Phát hiện đƣợc các chuỗi đặc hiệu nhờ các probe 11 HÌNH ẢNH TĂNG BIẾU HIỆN GEN HER2/NEU TRONG UNG THƢ VÖ HER2/neu... nl(9) nl(22) nl(22) nl(22) Ph Ph(-) Ph(+) Nhạy Imatinib Kháng Imatinib 13 SOUTHERN BLOT: NGUYÊN TẮC KỸ THUẬT 14 SOUTHERN BLOT: QUY TRÌNH KỸ THUẬT 15 SOUTHERN BLOT: ỨNG DỤNG • Phát hiện những thay đổi về cấu trúc của DNA (mất đoạn, thêm đoạn) • Có thể phát hiện đột biến điểm nếu đột biến làm thay đổi điểm cắt của men cắt hạn chế (restriction enzyme) 16 MẤT ĐOẠN GEN CYP21 VÀ C4B TRONG BỆNH THIẾU... Chẩn đoán các đột biến gen • Nguy cơ bệnh: BRCA1 (ung thƣ vú), APC (đa polyp tuyến gia đình), VHL (ung thƣ thận), đột biến vùng precore của HBV (ung thƣ gan), LDLR (tăng cholesterol gia đình), • Chẩn đoán bệnh: JAK2 (tăng sinh tủy), globine (thalassemia), BTK (X-linked agammaglobulinemia), ATP7B (bệnh Wilson), khoảng 6000 bệnh đơn gen gây khuyết tật bẩm sinh • Tiên lƣợng bệnh: P53 (các loại ung... đoán sự hiện diện của gen/tác nhân gây bệnh • BCR/ABL: Bạch cầu mạn dòng tủy (Imatinib) • PML/RARA: Bạch cầu cấp dòng tủy (Retinoic acid) • FIP1L1/PDGFRA: Hội chứng tăng eosinophil (Imatinib) • TMPRSS2/ERG: Ung thƣ tiền liệt tuyến • EML4/ALK: Ung thƣ vú, ung thƣ đại trực tràng, ung thƣ phổi • Các yếu tố vi sinh: HBV, HCV, HPV, lao, 2 Real time PCR theo dõi sự thay đổi số lượng của gen/tác nhân... Chỉ khảo sát các exon, không khảo sát intron • Đặc biệt quan trọng trong khảo sát các gen tổ hợp (fusion gene) và biểu hiện gen • Bệnh phẩm phải đƣợc bảo quản đúng cách: Không dùng chống đông heparin (máu, tủy), không dùng chất bảo quản mô tƣơi, Nếu muốn giữ mẫu lâu nên giữ đông lạnh từ -200C (mô đặc) hoặc trong sepasol (tế bào máu hoặc tủy) 26 NHƢỢC ĐIỂM CỦA PCR 1 Tạo sản phẩm ngắn: Vài trăm bp,... 6000 bệnh đơn gen gây khuyết tật bẩm sinh • Tiên lƣợng bệnh: P53 (các loại ung thƣ); FLT3, NPM1 (bạch cầu cấp),… • Điều trị nhắm trúng đích phân tử: EGFR (ung thƣ phổi), KRAS (ung thƣ đại trực tràng), cKIT (GIST), UNG THƢ TIỀN LIỆT TUYẾN: CƠ CHẾ PHÂN TỬ NST 21 ERG TMPRSS2 Mất đoạn NST (3 Mb) ERG TMPRSS2 RT-PCR phát diện gen tổ hợp TMPRSS2/ERG 33 UNG THƢ TIỀN LIỆT TUYẾN: QUY TRÌNH PHÁT... tươi, mô đông lạnh (không dùng chất cố định) 1 2 3 4 Tách chiết RNA (RNase!) Chuyển mRNA thành cDNA bằng reverse transcriptase PCR-1: Kiểm chất lượng cDNA (mồi xuôi và ngược trên cùng gen beta-actin) 1 2 3 4 Thang chuẩn Bệnh nhân Chứng âm Chứng dương PCR-2: Tìm sự hiện diện gen tổ hợp (mồi xuôi trên gen TMPRSS2, mồi ngược trên gen ERG) Điện di trên thạch: Quan sát kết quả 34 CÁC KIỂU ĐỘT BIẾN GEN THƢỜNG... 26 NHƢỢC ĐIỂM CỦA PCR 1 Tạo sản phẩm ngắn: Vài trăm bp, tối đa 5 kb 2 Thiếu “trung thực” (infidelity): Taq DNA polymerase không có hoạt tính proofreading Phải sử dụng polymerase có hoạt tính sửa sai khi cần giải trình tự chuỗi DNA 27 PHÂN TÍCH SẢN PHẨM PCR Điện di Real time PCR (Quantitative PCR, Q-PCR) Tinh sạch sản phẩm DNA sequencing A Wild-type sequence AAG GTT GTT GAG GAG ATA AAT GGA AAC