Phân tích tính chất methyl hóa vùng promoter gen RARβ của bệnh nhân nhiễm HPV tại Việt Nam

Phương pháp nghiên cứu 1. Khai thác dữ liệu

• Khảo sát thực nghiệm 1 Tách chiết DNA

SVTH: Huỳnh Tấn Tài Trang22 và kích thước sản phẩm PCR của các cặp mồi phù hợp với phương pháp phân tích tính chất methyl hóa DNA (Nested-PCR). Chúng tôi tách chiết DNA bộ gen người từ các mẫu bệnh phẩm dịch phết tế bào (Pap’smear) dựa trên phương pháp phenol/chloroform. Trong đó, màng tế bào và màng nhân được biến tính bằng chất tẩy mạnh (SDS) kết hợp sử dụng enzym proteinase K.

- Bổ sung một thể tích phù hợp của dung dịch phenol:chloroform (tỷ lệ 1:1) , trộn đều. - Thêm một lượng dung dịch chloroform bằng thể tích dịch nổi thu được, đảo nhẹ. Hàm lượng DNA có thể xác định được nhờ sự hấp thu mạnh ánh sáng ở bước sóng 260 nm.

Bên cạnh đó, độ tinh sạch của dung dịch acid nucleic thể hiện qua chỉ số A260 nm. Sau đó, tiến hành đo nồng độ DNA ở bước sóng 260 nm và xác định độ tinh sạch của dung dịch được xác định bằng A260 nm. Biến đổi DNA bằng sodium bisulfite với bộ kit EZ DNA Methylation-Gold (The Epigenetic companyTM).

Các mẫu được xử lý với hỗn hợp biến đổi sodium bisulfite để chuyển cytosine thành uracil (ngoại trừ các 5mC) sẽ được cố định trên màng của cột, sau đó rửa sạch muối và DNA được thu hồi lại. Sau khi tách chiết và biến đôi sodium bisulfite các mẫu DNA tò các mẫu bệnh phẩm dịch phết tế bào (Pap’smears), chúng tôi tiến hành thục hiện phản ứng Nested - MS P nhằm xác định tính chat methyl hóa trên bộ mẫu bệnh phẩm dịch phết tế bào có tính chất nhiễm HPV type nguy cơ cao, nguy cơ thấp, mẫu không nhiễm HPV. Kỹ thuật điện di phân tách các phân tử nucleic acid, dựa vào sự di chuyển về phía điện cực dương của các phân tử nucleic acid tích điện âm trong điện trường trên pha rắn (gel agarose, gel polyacrylamide).

Sự di chuyển của các phân tử nucleic acid được quyết định bởi điện tích, trọng lượng và cấu hình của phân tử nucleic acid (dạng vòng, dạng thẳng hoặc siêu xoắn). Các phân tử nucleic acid trên gel agarose được phát hiện do ethidium bromide, đây là loại chất nhuộm có khả năng chèn vào các base của phân tử nucleic acid và phát huỳnh quang dưới tác dụng của tia tử ngoại (tia UV). Dựa vào kích thước và vị trí các băng DNA trên thang chuẩn, cho phép xác định kích thước của các băng DNA sản phẩm trên bản gel.

Kết quả khai thác dữ liệu

• Gen RARβ

Bộ dữ liệu về tần số methyl hóa trong UTCTC và các ung thư khác Kết quả khảo sát cho thấy tính chất methyl hóa trên vùng promoter gen RARβ thể hiện các mức độ khác nhau trong các loại ung thư khác nhau (Bảng 3.2). Đối với ung thư cổ tử cung đã có nhiều công trình nghiên cứu về tính chất methyl hóa vùng promoter gen RARβ, kết quả khảo sát cho thấy tần suất methyl hóa trung bình khoảng 40,3%, tần suất methyl hóa trung bình có trọng số là 40.0%. Dựa vào kết quả khảo sát các công trình nghiên cứu (hình 3.2), chúng tôi ghi nhận trong 22 công trình nghiên cứu trên 8 loại ung thư nêu sử dụng mẫu mô trong phân tích tính chất methyl hóa trên gen RARβ vào khoảng 96% (trên tổng số công trình nghiên cứu), mẫu bệnh phẩm huyết thanh (máu) được sử dụng với tỷ 4% (trên tổng số công trình nghiên cứu).

Bên cạnh đó, thông tin ở bảng 3.3 cho thấy tính phổ biến của phương pháp MSP, QMSP trong những quy trình phân tích tính chất methyl hóa trên đảo CpG thuộc vùng promoter gen RARβ liên quan đến bệnh ung thư cổ tử cung. Bên cạnh đó, dựa vào công cụ trực tuyến Gene Promoter Miner [103], chúng tôi xác định một số vị trí nhận biết của yếu tố phiên mã “hot-spot” trên đảo CpG của gen RARβ, gồm có: SP1, CP2, STAT6,…Chúng tôi xác định vùng trình tự mục. SVTH: Huỳnh Tấn Tài Trang37 tiêu chứa các vị trí CpG (vị trí hot-spot) thuộc vùng promoter gen RARβ để xác định các bộ mồi phù hợp với phương pháp Nested-MSP khảo sát mức độ methyl hóa tại đảo CpG thuộc vùng promoter của gen RARβ trong bộ mẫu bệnh phẩm (dịch phết âm đạo) của bệnh nhân nhiễm HPV.

Từ kết quả bảng khảo sát thông số vật lý của bộ mồi methyl và unmethyl gen RARβ, chúng tôi nhận thấy các thông số về chiều dài, %GC và Tm của các trình tự mồi đều phù hợp với tiêu chí khuyến cáo của IDT về thiết kế mồi và tiêu chí thiết kế mồi cho phản ứng MSP phá vỡ cấu trúc thứ cấp như cấu trúc kẹp tóc, cấu trúc tự bắt cặp hay cấu trúc dị bắt cặp hầu hết đều lớn hơn -9 kcal/mol. Chú thích: Màu vàng: vị trí mồi xuôi không methyl hóa bắt cặp phù hợp với trình tự đích; màu xanh dương: vị trí mồi ngược không methyl hóa bắt cặp phù hợp với trình tự đích; màu hồng: vị trí những nucleotide không bắt cặp phù hợp với trình tự đích. Nhằm khảo sát tính chất methyl hóa vượt mức tại các đảo CpG thuộc vùng promoter trên gen RARβ trên một số mẫu bệnh phẩm dịch phết tế bào nhiễm HPV type nguy cơ cao, nguy cơ thấp, mẫu không nhiễm HPV, chúng tôi tiến hành quy trình thực nghiệm.

Chúng tôi thực hiện quy trình tách chiết DNA từ các bộ mẫu bệnh phẩm dịch phết tế bào (Pap’s smear) với kèm theo các chỉ tiêu lâm sàng có tính chất nhiễm HPV type nguy cơ cao/nguy cơ thấp hoặc không nhiễm HPV. Kết quả điện di sản phẩm Nested-MSP gen RARβ các mẫu HP Chú thích: Giếng M: Sản phẩm Nested-MSP với cặp mồi methyl; Giếng U: Sản phẩm Nested-MSP với cặp mồi unmethyl; NC: Sản phẩm Nested-MSP cặp mồi methyl với H2O; LD: thang chuẩn. Chúng tôi ghi nhận tần suất methyl hóa trên gen RARβ là 100% trong mẫu bệnh phẩm dịch phết tế bào có tính chất nhiễm HPV type nguy cơ cao, cao hơn so với công bố khoa học của Erin và cộng sự (2014) ghi nhận tần số methyl hóa trên gen RARβ trên bộ mẫu nhiễm HPV type nguy cơ cao là 88%.

SVTH: Huỳnh Tấn Tài Trang49 Đồng thời, trong công bố khoa học của Phuong và cộng sự (2015) ghi nhận tần số methyl hóa trên gen RARβ trên bộ nhiễm HPV type nguy cơ cao là 75% thấp hơn so với tần số methyl hóa trên gen RARβ chúng tôi khảo sát. Dựa vào kết quả phản ứng Nested-MSP trên một số mẫu DNA bộ gen của các mẫu bệnh phẩm dịch phết tế bào, chúng tôi xác định sự tương quan giữa tính chất methyl hóa và tính chất nhiễm HPV/không nhiễm HPV nhiễm HPV type nguy cơ thấp/type nguy cơ cao. Kết quả này có nghĩa là khả năng mắc bệnh ung thư cổ tử cung khi có tính chất methyl hóa trên gen RARβ ở bộ mẫu nhiễm HPV type nguy cơ cao cao gấp 29,86 lần với bộ mẫu không nhiễm HPV và nhiễm HPV type nguy cơ thấp.

Kết quả này có nghĩa là nguy cơ mắc bệnh ung thư cổ tử cung khi có tính chất methyl hóa trên gen RARβ ở bộ mẫu nhiễm HPV type nguy cơ cao cao gấp 2,67 lần ở bộ mẫu nhiễm HPV type nguy cơ thấp và không nhiễm HPV. Chú thích: Vị trí tô màu vàng: vị trí CG; vị trí tô màu xanh lá: vị trí nucleotide C không thuộc đảo CpG sau biến đổi bisulfite biến thành nucleotide T; : ký hiệu nucleotide C thuộc đảo CpG; : ký hiệu vị trí nucleotide C không thuộc đảo CpG sau biến đổi bisulfite biến thành nucleotide T; : trình tự mồi bắt cặp lên trình tự gen RARβ.