sàng lọc cây dược liệu có hoạt tính kháng oxy hóa và ức chế enzyme α glucosidase được trồng tại rừng ngập mặn cần giờ và nghiên cứu quy trình sản xuất nước uống đóng chai hỗ trợ hạ đường huyết

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

VẬT LIỆU

Chi Bần (Sonneeratia): cây Bần Chua (Sonneratia caseolaris), cây Bần Trắng (Sonneratia alba)

Chi Vẹt (Bruguiera): Vẹt Trụ (Bruguiera cylindrica), Vẹt Tách (Bruguiera parviflora) và Vẹt Đen (Bruguiera sexangula)

Chi Mắm (Avicennia): cây Mắm Đen (Avicennia officinalis), cây Mắm Quăn (Avicennia alba)

Chi Đước (Rhizophara): cây Đước Đôi (Rhizophora apiculata), cây Đước Xanh

(Rhizophora mucronata) và cây Đước Vòi (Rhizophora stylosa)

Bộ phận thu hái: lá trưởng thành Địa điểm thu hái: tại rừng ngập mặn Cần giờ thành phố Hồ Chí Minh vào tháng 7 năm 2019

Sau khi hái về, nguyên liệu rửa sạch, loại bỏ tạp chất, phơi khô và xay để tạo thành bột cây để chuẩn bị cho quá trình nghiên cứu

Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm Sinh Hóa, Khoa Công Nghệ Sinh Học, trường Đại học Mở Thành Phố Hồ Chí Minh trong thời gian từ tháng 8/2019 đến tháng 07/2020

2.1.3 Hóa chất và thiết bị

- Các loại dung môi ethanol (Việt Nam), metanol (Việt Nam), NaOH (Việt Nam), acid formic (Việt Nam), acid phosphoric (Việt Nam)

- DMSO, thuốc thử Folin-Ciocalteu (Merck)

- DPPH • , enzyme α- glucosidase, acarbose, cơ chất p- Nitrophenyl-α-D- glucopyranoside ( Aldrich Sigma), cơ chất para-nitrophenyl-α-D-glucosidase

Hóa chất sử dụng đạt trình độ tinh khiết phân tích

- Cân phân tích điện tử (AA – 200)

- Cân kĩ thuật (Sartorius TE 412)

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Phương pháp thu thập mẫu

Mười mẫu lá cây nghiên cứu được thu hái thuộc rừng ngập mặn Cần Giờ Các mẫu cây thuốc này được lựa chọn theo tiêu chí dân gian, tài liệu tham khảo

2.2.2 Xác định hàm lượng polyphenol Định lượng hợp chất polyphenol tổng số của dịch chiết ban đầu theo phương pháp Folin - Ciocalteau của Aiyegoro và Okoh [16] theo phụ lục V

2.2.3 Xác định hàm lượng flavonoid

Hàm lượng flavonoid của chất chiết xuất được xác định theo phương pháp tạo màu với AlCl3 bằng cách xây dựng đường chuẩn quercetin [14] theo phụ lục VI.

2.2.4 Phương pháp kháng oxy hóa: đánh bắt gốc tự do DPPH • [2]

Ngày nay DPPH • được sử dụng để khảo sát khả năng ức chế gốc tự do Phương pháp này rất hữu hiệu được dùng phổ biến vì đơn giản, nhanh chóng và dễ ổn định

Các chất có khả năng kháng oxi hóa sẽ trung hòa gốc DPPH • bằng cách cho hydrogen, làm giảm độ hấp thu tại bước sóng cực đại và màu của dung dịch phản ứng sẽ nhạt dần, chuyển từ tím sang vàng nhạt Phản ứng trung hòa gốc DPPH • của các chất kháng oxy hóa được minh họa bằng phản ứng được mô tả bên trên

Hình 2 1: Cơ chế kháng oxy hóa

2.2.5 Phương pháp ức chế enzyme α - glucosidase

Nghiên cứu khả năng ức chế α-glucosidase được xác định theo phương pháp của Apostolidis và cộng sự [54] Để khảo sát khả năng ức chế hoạt tính enzyme α- glucosidase trên cao chiết, ta sử dụng p-nitrophenyl-α-D-glucopyranosid (pNPG) làm cơ chất Cơ chất p-nitrophenyl-α-D-glucopyranosid sẽ bị enzyme α-glucosidase thủy phân chuyển hóa thành α-D-glucose và p-nitrophenol (pNP)

Hình 2 2 Phản ứng thủy phân pNPG dưới sự xúc tác của enzyme α -glucosidase

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Nguyên liệu sau khi thu hái, phân loại, rửa sạch và thái nhỏ Tiến hành sấy khô và nghiền thành bột Sau đó tiến hành nghiên cứu theo sơ đồ 2.1:

Thu thập mẫu nghiên cứu

Thử nghiệm hoạt tính sinh học

Nghiên cứu quy trình sản xuất nước uống đóng chai

Khảo sát chất lượng sản phẩm toàn diện

Khả năng kháng oxy hóa

Khả năng ức chế enzyme α-glucosidase

Sơ đồ 2.1: Sơ đồ nghiên cứu

2.3.2 Sơ đồ quy trình điều chế cao để thử hoạt tính sinh học

Mẫu lá cây được thu hái về, loại bỏ những quả hư hỏng, sâu bệnh, rửa sạch, phơi khô và xay nhuyễn thành bột Sau đó tiến hành điều chế cao tổng theo sơ đồ 2.2

Cao tổng được trích ly bằng dung môi ethanol với thông số trích ly như sau: tỷ lệ nguyên liệu : dung môi là 1:50 (g/ml), ở nhiệt độ 60ºC trong thời gian 60 phút và thực hiện 8 lần Sau quá trình trích ly tiến hành lọc thô rồi lọc tinh để loại bỏ bã, dịch sau khi lọc được loại dung môi bằng hệ thống cô quay chân không, thu hồi dung môi ethanol và cao tổng Sau đó, cao ethanol sẽ tiến hành khảo sát hoạt tính sinh học: kháng oxy hóa và khả năng ức chế enzyme α- glucosidase của cao ethanol

Sơ đồ 2.2: Sơ đồ quy trình đều chế cao

Rửa sạch Phơi khô Xay nhuyễn

2.3.3 Quy trình sản xuất nước uống đóng chai dự kiến

Nước uống đóng chai bắt đầu xuất hiện từ thế kỷ XVII ở Mỹ Ưu điểm của nước uống đóng chai là dễ dàng, nhỏ gọn, sử dụng trong những chuyến đi xa, tham gia các hoạt động ngoài trời Hiện nay có rất nhiều loại nước có ga giúp uống nhanh, tuy nhiên việc sử dụng quá nhiều nước có ga có hại cho sức khỏe Trong nước có ga có chứa cồn, các chất kích thước, cùng với lượng cao gây ra tình trạng xương yếu, đồng thời tăng nguy cơ béo phì, tiểu đường làm tăng huyết áp

Vì vậy nước uống đóng chai được sản xuất từ nguyên liệu tự nhiên có các hợp chất sinh học rất được người tiêu dùng quan tâm

Sau khi khảo sát hoạt tính sinh học khả năng ức chế α-glucosidase, lựa chọn được nguồn cây dược liệu ứng dụng vào sản phẩm Quy trình sản xuất nước uống đóng chai hỗ trợ hạ đường huyết dự kiến theo như sơ đồ 2.3

Sơ đồ 2.3: Quy trình dự kiến sản xuất nước uống đóng chai Thuyết minh quy trình:

Nguyên liệu được thu hái về, loại bỏ những lá hư hỏng, sâu bệnh và rửa sạch Nguyên liệu sau đó được phơi khô, nghiền mịn Tiến hành khảo sát quá trình sao nhằm tìm ra thông số thời gian và nhiệt độ sao tối ưu để đảm bảo chất lượng Bột

Dung môi Trích ly Bã

28 nguyên liệu sẽ được trích ly với dung môi nhằm tìm ra thông số tối ưu của quá trình trích ly với hàm lượng chất khô cao Sau khi trích ly cần lọc để loại bỏ bã nguyên liệu cũng như cặn để thu được dịch trích Tiến hành phối trộn với cỏ ngọt thích hợp để tăng vị cho sản phẩm mà vẫn giữ được mùi thơm và màu sắc đặc trưng của sản phẩm Mẫu sẽ được rót chai - ghép nắp và sau đó là gia nhiệt – bài khí Mẫu thành phẩm sẽ được đem đi thanh trùng nhằm kéo dài thời gian bảo quản của sản phẩm

2.3.4 Khảo sát thành phần nguyên liệu

2.3.4.1 Khảo sát các tính chất hóa lý

❖ Mục đích: Phân tích, xây dựng tiêu chuẩn chất lượng của nguyên liệu cho quá trình nghiên cứu

❖ Cách tiến hành: Các loại lá sau khi thu hái về phân loại, rửa sạch, bảo quản Tiến hành khảo sát các chỉ tiêu hóa lý theo phương pháp được trình bày ở bảng 2.1:

Bảng 2 1 Phương pháp khảo sát thành phần và tính chất nguyên liệu

2.3.4.2 Xác định hàm lượng polyphenol

Từ nguyên liệu ban đầu được xử lý theo sơ đồ 2.2 để thu nhận bán thành phẩm cao chiết với dung môi cồn thu cao cồn Cao chiết được xác định hàm lượng polyphenol dựa theo phương pháp Folin-Ciocalteau của Aiyegoro và Okoh [16]

Lấy 1 mg cao chiết được thực hiện và pha loãng 100 lần Sau đó lấy 1ml dung dịch vừa pha loãng vào bình định mức 10 ml, thêm 0,5 ml thuốc thử Folin – Ciocalteu, lắc đều, để phản ứng diễn ra trong 3 phút rồi thêm vào 1 ml dung dịch

Na2CO3 bão hòa, lắc đều và bổ sung nước cất đến vạch định mức Để yên trong 3 phút rồi đem so màu ở bước sóng 760 nm với nước cất làm chuẩn

Chỉ tiêu Phương pháp Độ ẩm (%) Sấy đến khối lượng không đổi

Hàm lượng tro tổng (%w/w khô) Nung ở 550 - 600 0 C đến khối lượng không đổi Hàm lượng đường khử, đường tổng (%) Phương pháp Bertrand

Dựa vào đường chuẩn acid gallic để xác định hàm lượng polyphenol có trong mẫu cao bán thành phẩm Hàm lượng polyphenol có trong mẫu được tính bằng đương lượng acid gallic (GAE) có trong mẫu cao đem định lượng

2.3.4.3 Xác định hàm lượng flavonoid

Từ nguyên liệu ban đầu được xử lý theo sơ đồ 2.2 để thu nhận bán thành phẩm cao chiết, với dung môi cồn thu cao cồn Cao chiết được xác định hàm lượng flavonoid dựa theo phương pháp tạo màu với AlCl3 bằng cách xây dựng đường chuẩn quercetin [14]

Lấy 1 mg cao bán thành phẩm và pha loãng 10 lần Sau thêm vào 4 ml nước cất thu được hỗn hợp 1 Sau đó, thêm vào 0,3 ml dung dịch NaNO2 5% Sau 5 phút thêm tiếp 0,3 ml dung dịch AlCl3 10%, sau 6 phút cho vào 2 ml dung dịch NaOH 1M và định mức đến thể tích 10 ml bằng nước cất Tiến hành đo độ hấp thụ ở bước sóng 425 nm

Dựa vào đường chuẩn quercetin để xác định hàm lượng flavonoid có trong mẫu cao bán thành phẩm Hàm lượng flavonoid có trong mẫu được tính bằng đương lượng quercetin có trong mẫu cao đem định lượng

2.3.5 Khảo sát hoạt tính sinh học trong nguyên liệu

2.3.5.1 Khảo sát khả năng kháng oxy hóa

- Cân 7,88 mg DPPH • định mức bằng cồn 96 0 thành 100 ml Để ổn định trong tối 30 phút ở 40 0 C Lúc này DPPH • có nồng độ là 0,2 mM

KẾT QUẢ KHẢO SÁT THÀNH PHẦN NGUYÊN LIỆU

3.1.1 Kết quả điều chế cao

Bảng 3.1 Kết quả điều chế cao

Khối lượng thu hái (mg)

Khối lượng cao (mg) Độ ẩm cao (%)

Vẹt đen 1000 de 320 cd 67,2 c 7,42 de

Vẹt tách 1000 de 290 de 32,4 h 7,54 de

Bần trắng 850 ef 330 cd 52,0 e 8,58 ab

Mắm quăn 1200 bc 370 bc 40,3 g 6,37 fg Đước vòi 1300 ab 260 ef 44,2 f 8,31 cd Đước đôi 1300 ab 325 cd 39,0 g 8,03 cde Đước xanh 1400 a 410 ab 73,5 b 8,86 ab

(*) Kết quả được lấy theo giá trị trung bình của 3 lần lặp lại và được xử lý thống kê bằng phần mềm Statgraphic plus 3.0 Các giá trị trong cùng 1 cột có ký tự giống nhau thì không có sự khác biệt theo thống kê với mức ý nghĩa α = 0.05

3.1.2 Kết quả thành phần hóa lý của nguyên liệu Để đánh giá sơ bộ thành phần trong nguyên liệu, tiến hành khảo sát các chỉ tiêu hóa lý xác định một số thành phần và kết quả phân tích được thể hiện trong bảng 3.2: Hàm ẩm trong nguyên liệu thấp sẽ giúp thời gian bảo quản và vận chuyển nguyên liệu dễ dàng, hạn chế sự phát triển của vi sinh vật gây hại đặc biệt là nấm men, nấm mốc Do mười loại nguyên liệu xác định độ ẩm là nguyên liệu tươi nên hàm lượng ẩm tương đối cao vì vậy cần có kế hoạch thu hái, vận chuyển, xử lí và bảo quản hợp lí nhằm làm giảm tối đa sự thoát ẩm làm giảm chất lượng

Bảng 3.2 Kết quả tính chất hóa lý Độ ẩm (*) (%)

Hàm lượng tro tổng (*) (%w/w khô)

Mắm quăn 76,26 c 2,67 e 1,18 g 0,23 f Đước vòi 69,28 i 3,95 a 3,75 a 0,54 c Đước đôi 73,88 e 2,59 g 3,68 b 0.56 b Đước xanh 69.80 h 2,61 f 2,50 d 0.78 a

(*) Kết quả được lấy theo giá trị trung bình của 3 lần lặp lại và được xử lý thống kê bằng phần mềm Statgraphic plus 3.0 Các giá trị trong cùng 1 cột có ký tự giống nhau thì không có sự khác biệt theo thống kê với mức ý nghĩa α = 0.05

Hàm lượng tro trong tổng số 2 g nguyên liệu phản ánh hàm lượng khoáng của nguyên liệu Chất khoáng là nguồn dinh dưỡng có vai trò quan trọng đối với sức khỏe con người, tăng sức đề kháng cơ thể, giúp cho việc chuyển hóa các chất trong cơ thể diễn ra bình thường, vì vậy hàm lượng tro càng cao cho thấy khả năng cung cấp khoáng càng nhiều Tất cả cây nghiên cứu đều có hàm lượng tro tương đối cao, trong đó hai cây có hàm lượng trong cao nhất là lá cây đước vòi và vẹt tách

Bên cạnh đó, nguyên liệu cũng có chứa đường tổng và đường khử nên tạo cho sản phẩm có vị ngọt nhưng hàm lượng ít nên tăng chất lượng cảm quan và cung cấp một phần năng lượng cho cơ thể

3.1.3 Kết quả định lượng polyphenol và flavonoid trong nguyên liệu

Lấy 100 g bột nguyên liệu, tiến hành điều chế cao như sơ đồ 2.2 Kết quả định lượng polyphenol và flavonoid được trình bày ở bảng 3.3:

Bảng 3.3 Kết quả hàm hàm lượng polyphenol và flavonoid

Mắm quăn 1,08 k 0,11 h Đước xanh 1,90 g 0,27 c Đước đôi 2,52 d 0,28 b Đước vòi 4,05 a 0,82 a

(*) Kết quả được lấy theo giá trị trung bình của 3 lần lặp lại và được xử lý thống kê bằng phần mềm Statgraphic plus 3.0 Các giá trị trong cùng 1 cột có ký tự giống nhau thì không có sự khác biệt theo thống kê với mức ý nghĩa α = 0.05

Qua bảng 3.3, thấy rằng trong tất cả mười nguyên liệu khảo sát đều có polyphenol và flavonoid Trong đó, lá cây đước vòi có hàm lượng polyphenol và flavonoid cao nhất với 4,05% và 0,82%

Polyphenol là một trong số các nhóm hoạt chất chính có chức năng kháng khuẩn và kháng oxy hóa và flavonoid có tác dụng bảo vệ cơ thể, ngăn ngừa xơ vữa động mạch, lão hóa và thoái hóa Kết quả thí nghiệm chứng tỏ, nguồn nguyên liệu có giá trị, phù hợp để ứng dụng vào sản xuất sản phẩm có lợi cho sức khỏe Đây là tiền đề để trích ly các hợp chất có trong nguyên liêu để khảo sát hoạt tính sinh học Khi khảo sát cần chú ý đến các yếu tố ảnh hưởng đến polyphenol và flavonoid để các hoạt tính sinh học không bị phân hủy

KẾT QUẢ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC NGUYÊN LIỆU

3.2.1 Kết quả khảo sát khả năng kháng oxy hóa

Từ cao cồn, chất chuẩn acid ascorbic tiến hành khảo sát khả năng kháng oxy hóa như 2.3.5.1 và kết quả được trình bày bảng:

Bảng 3.4 Kết quả khả năng kháng oxy hóa

Hợp chất Nồng độ (àg/ml) IC 50 (*)

Hợp chất Nồng độ (àg/ml) IC 50 (*)

Hợp chất Nồng độ (àg/ml) IC 50 (*)

(*) Kết quả được lấy theo giá trị trung bình của 3 lần lặp lại và được xử lý thống kê bằng phần mềm Statgraphic plus 3.0 Các giá trị trong cùng 1 cột có ký tự giống nhau thì không có sự khác biệt theo thống kê với mức ý nghĩa α = 0.05

Trên các mẫu thí nghiệm ở các nồng độ khác nhau thì kết quả khả năng kháng oxy hóa khác nhau Qua kết quả thể hiện ở bảng 3.4, nhận thấy rằng khi tăng nồng độ mẫu thì khả năng kháng oxy hóa cũng tăng vì trong nguyên liệu có polyphenol – có khả năng kháng oxy hóa nên khi nồng độ cao chiết tăng thì khả năng kháng oxy hóa tăng Do khi nồng độ cao chiết tăng lên thì các lượng hợp chất có hoạt tính sinh học trong dung dịch sẽ tăng lên, khả năng ức chế gốc tự do của DPPH • cũng như các hợp chất có chứa nhiều gốc –OH sẽ trung hòa các gốc tự do trong dung dịch phản ứng làm thay đổi màu dung dịch phản ứng từ màu tím của DPPH • sang màu vàng nhạt nhanh

45 hơn so với hàm lượng hợp chất có nhóm –OH ít nên khả năng kháng oxy hóa sẽ tăng lên Do đó, nồng độ cao chiết từ bột nguyên liệu càng cao thì khả năng kháng oxy hóa càng cao

Khi so sánh giá trị IC50 các cao chiết của các cây khảo sát và đối chứng dương acid ascorbic là một loại thuốc thương mại đã được tinh sạch có hoạt tính kháng oxy hóa cao, nhận thấy rằng cao chiết các cây bần chua, cây đước vòi, cây vẹt tách, cây vẹt trụ và cây bần trắng có khả năng kháng oxy hóa rất cao Và còn các cây mắm quăn, đước xanh, mắm đen, vẹt đen và đước đôi có khả năng kháng oxy hóa yếu hơn so với đối chứng dương acid ascorbic

Trong đó, cây đước vòi và cây bần chua có khả năng kháng oxy hóa cao nhất với giỏ trị IC50 lần lượt là 30,36 àg/ml và 60,32 àg/ml so với đối chứng dương Acid ascorbic (IC507,60 àg/ml) Qua đú, cho thấy lỏ cõy đước vũi cú tiềm năng rất lớn ứng dụng vào các sản phẩm thực phẩm, thực phẩm chức năng kháng oxy hóa

3.2.2 Kết quả khảo sát khả năng ức chế enzyme α -glucosidase

Từ cao cồn và chất chuẩn acarbose tiến hành khảo sát khả năng ức chế enzyme α-glucosidase như 2.3.5.2 và kết quả được trình bày ở bảng 3.5:

Trên các mẫu thí nghiệm ở các nồng độ khác nhau thì kết quả khả năng ức chế enzyme α-glucosidase khác nhau Qua kết quả thể hiện ở bảng 3.5, nhận thấy rằng khi nồng độ mẫu thí nghiệm tăng lên thì khả năng ức chế enzyme α-glucosidase cũng tăng Khi tăng nồng độ cao chiết thì hàm lượng các hoạt chất có khả năng ức chế hoạt tính enzyme α-glucosidase trong cao chiết cũng tăng, khi đó hoạt tính enzyme α- glucosidase bị các hoạt chất trong cao chiết của các ức chế nên hoạt lực của enzyme α-glucosidase hoạt động trong dung dịch yếu đi, nên khi enzyme α-glucosidase tham gia phản ứng xúc tác với cơ chất p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside sẽ tạo hàm lượng p-nitrophenol thấp thể hiện ở giá trị mật độ quang thấp, thì phần trăm ức chế của enzyme α-glucosidase sẽ cao Khi nồng độ các cao chiết còn thấp thì lượng các hoạt chất có khả năng ức chế hoạt tính enzyme α-glucosidase không đủ hoặc ức chế nhưng thấp, khi đó enzyme α-glucosidase tham gia phản ứng xúc tác với cơ chất sẽ tạo hàm lượng p-nitrophenol nhiều, dẫn đến giá trị mật độ quang cao thì phần trăm ức chế của

46 enzyme thấp Do đó, nồng độ cao chiết càng cao thì khả năng ức chế hoạt tính enzyme α-glucosidase càng cao

Bảng 3.5: Kết quả khảo sát khả năng ức chế enzyme α -glucosidase

Nồng độ (àg/ml) IC 50 (*)

Vẹt đen 7,179 10,26 31,79 62,56 84,10 145,9 f Đước đôi 28,62 36,75 40,28 50,53 57,95 160,3 g Đước vòi 6,69 10,46 24,27 49,79 66,11 165,6 h

Cao chiết Nồng độ (àg/ml) IC 50 (*)

(*) Kết quả được lấy theo giá trị trung bình của 3 lần lặp lại và được xử lý thống kê bằng phần mềm Statgraphic plus 3.0 Các giá trị trong cùng 1 cột có ký tự giống nhau thì không có sự khác biệt theo thống kê với mức ý nghĩa α = 0.05

Khi tăng nồng độ cao chiết thì hàm lượng các hoạt chất có khả năng ức chế hoạt tính enzyme α-glucosidase trong cao chiết cũng tăng, khi đó hoạt tính enzyme α- glucosidase bị các hoạt chất trong cao chiết của các ức chế nên hoạt lực của enzyme α-glucosidase hoạt động trong dung dịch yếu đi, nên khi enzyme α-glucosidase tham gia phản ứng xúc tác với cơ chất p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside sẽ tạo hàm lượng p-nitrophenol thấp thể hiện ở giá trị mật độ quang thấp, thì phần trăm ức chế của enzyme α-glucosidase sẽ cao Khi nồng độ các cao chiết còn thấp thì lượng các hoạt chất có khả năng ức chế hoạt tính enzyme α-glucosidase không đủ hoặc ức chế nhưng thấp, khi đó enzyme α-glucosidase tham gia phản ứng xúc tác với cơ chất sẽ tạo hàm lượng p-nitrophenol nhiều, dẫn đến giá trị mật độ quang cao thì phần trăm ức chế của enzyme thấp Do đó, nồng độ cao chiết càng cao thì khả năng ức chế hoạt tính enzyme α-glucosidase càng cao

Qua bảng kết quả 3.5 cho thấy rằng, giá trị IC50 về khả năng ức chế enzyme α- glucosidase của các loại cao chiết khảo sát thì giá trị IC50 của mẫu cao các cây bần chua, vẹt trụ, bần trắng và đước xanh thấp hơn so với acarbose nên cao của bốn loại cây này có khả năng ức chế enzyme α-glucosidase cao Trong khi đó, các cao chiết của các loài cây còn lại có giá trị IC50 cao hơn so với acarbose nên khả năng ức chế enzyme α-glucosidase của cao các loài cây đó thấp, khả năng ức chế enzyme thấp nhất là cõy mắm quăn và cõy mắm đen với IC50 lần lượt là 204,3 (àg/ml) và 220,7 (àg/ml) Acarbose được biết đến như một chất ức chế enzyme α-glucosidase và đang được sử dụng phổ biến cho bệnh nhân đái tháo đường type 2 Acarbose cũng được sử dụng như một đối chứng dương trong các nghiên cứu về khả năng ức chế enzyme α- glucosidase của các cao chiết thực vật

Kết quả phõn tớch với giỏ trị IC50 thấp nhất là 106,3 (àg/ml) cho thấy cõy bần chua có khả năng ức chế α-glucosidase cao nhất trong mười cây khảo sát và cao hơn so với đối chứng dương acarbose (IC50 là 138,2 àg/ml) thấy rằng tiềm năng lỏ cõy bần chua trong điều trị đái tháo đường thông qua hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase

Vì vậy, đề tài lựa chọn nguyên liệu lá cây bần chua để nghiên cứu quy trình sản xuất nước uống đóng chai hỗ trợ hạ đường huyết dành cho người bị bệnh tiểu đường.

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT NƯỚC UỐNG ĐÓNG CHAI HỖ TRỢ HẠ ĐƯỜNG HUYẾT

3.3.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của quá trình sao đến chất lượng sản phẩm

Lá bần chua sau khi khảo sát các công đoạn chế biến tiến hành xay mịn đồng nhất kích thước và khảo sát quá trình sao như bảng bố trí thí nghiệm 2.3.6.1, kết quả cảm quan theo phương pháp cho điểm được trình bày như bảng 3.6:

Qua bảng cho thấy các mẫu dịch nước thành phẩm cũng có sự khác biệt có ý nghĩa về giá trị cảm quan Tại nhiệt độ 70 0 C mẫu dịch nước cho giá trị cảm quan tốt, tức là dịch nước thành phẩm có màu nâu cánh gián tương đối, mùi thơm tự nhiên đặc trưng cho bần chua, hậu vị chát nhẹ và đồng thời hàm lượng polyphenol và flavonoid tương đối cao Khi các mẫu sao ở nhiệt độ dưới 70 0 C thì dịch nước thành phẩm có màu vàng, mùi ít đặc trưng Còn khi ở nhiệt độ cao hơn 70 0 C thì màu dịch nước có màu hơi ngả, có mùi hơi khét và hàm lượng polyphenol và flavonoid thấp nhất so với

48 các nghiệm thức còn lại Trong cùng một mốc nhiệt độ khi sao trong khoảng thời gian dài thì dịch có màu đậm hơn so với khi sao trong thời gian ngắn

Bởi vì, quá trình sao là quá trình truyền nhiệt trực tiếp giữa thiết bị và sản phẩm Qúa trình sao không những làm giảm hàm ẩm, tăng hương cho dịch trích ly mà còn góp phần tiêu diệt vi sinh vật Bột bần chua có độ ẩm thấp nên khi sao tạo điều kiện cho các phản ứng hóa nâu và tạo các hợp chất hương diễn ra với cường độ mạnh

Bảng 3.6: Kết quả đánh giá cảm quan dịch thành phẩm

Thời gian ( phút) ĐTB cảm quan (*)

5 3,7 de 2,808 d 0,189 h Màu vàng, mùi thơm nhẹ

Màu nâu cánh gián nhạt, mùi thơm đặc trưng

5 3,1 f 2,880 b 0,197 c Màu vàng, mùi thơm nhẹ

10 4,5 ab 2,583 k 0,195 e Màu nâu cánh gián nhạt, mùi thơm đặc trưng

15 3,9 cde 2,557 n 0,190 g Màu vàng, mùi thơm nhẹ

20 4,2 bcd 2,574 l 0,205 a Màu nâu cánh gián nhạt, mùi thơm đặc trưng

5 3,4 ef 2,672 f 0,188 k Màu vàng, mùi thơm nhẹ

10 5 a 3,317 a 0,203 b Màu nâu cánh gián tương đối, mùi thơm đặc trưng

15 4,0 bcd 2,816 c 0,195 e Màu nâu cánh gián nhạt, mùi thơm đặc trưng

Màu nâu cánh gián nhạt, mùi thơm đặc trưng

20 3,9 cde 1,712 r 0,139 o Màu vàng, mùi thơm nhẹ

(*) Kết quả được lấy theo giá trị trung bình của 3 lần lặp lại và được xử lý thống kê bằng phần mềm Statgraphic plus 3.0 Các giá trị trong cùng 1 cột có ký tự giống nhau thì không có sự khác biệt theo thống kê với mức ý nghĩa α = 0.05

Khi sao mẫu ở nhiệt độ thấp trong thời gian ngắn thì các phản ứng tạo màu và tạo các hợp chất hương diễn ra ở mức độ thấp nên sản phẩm có màu nâu nhạt và màu thơm nhẹ, trong khi tiến hành sao ở nhiệt độ cao, thời gian ngắn hay nhiệt độ thấp thời gian dài thì phản ứng tạo màu và tạo hương có điều kiện xảy ra Mặt khác, khi tiến hành sao trong nhiệt độ cao và thời gian dài thì các phản ứng tạo màu và mùi cho sản phẩm diễn ra mãnh liệt có thể dẫn đến cháy khét sản phẩm

Từ kết quả, thông số tối ưu được chọn cho quá trình sao là 70 0 C trong 10 phút Nhận thấy rằng hàm lượng polyphenol và flavonoid giảm so với nguyên liệu ban đầu là do chúng là hợp chất dễ bị oxy hóa và có một số nhóm nhạy cảm với nhiệt khi dưới tác dụng của nhiệt độ trong quá trình chế biến đã làm phân hủy một vài loại hợp chất

3.3.2 Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly

3.3.2.1 Kết quả khảo sát lựa chọn dung môi

Bảng 3.7: Kết quả sự ảnh hưởng của dung môi đến hàm lượng polyphenol và flavonoid

STT Dung môi Polyphenol (*) (%) Flavonoid (*) (%)

(*) Kết quả được lấy theo giá trị trung bình của 3 lần lặp lại và được xử lý thống kê bằng phần mềm Statgraphic plus 3.0 Các giá trị trong cùng 1 cột có ký tự giống nhau thì không có sự khác biệt theo thống kê với mức ý nghĩa α = 0.05

Qua bảng 3.7 cho thấy khi trích ly ở các nồng độ dung môi khác nhau cho hàm lượng polyphenol và flavonoid khác nhau, hàm lượng hai nhóm chất này thu được cao nhất là khi trích ly ở nồng độ cồn 70º và thấp nhất ở nồng độ 99,7º Vì so với cao cồn 99,7º thì nước trong cồn 70º đã hòa tan một số hợp chất tan trong nước có trong lá bần chua vì vậy thu được hàm lượng polyphenol và flavonoid cao Thấy rằng, khi trích ly ở nồng độ cồn thấp quá hay cao quá thì khả năng trích ly polyphenol và flavonoid kém

Khi so sánh hàm lượng trích ly polyphenol và flavonoid giữa cao nước với cao cồn ở các nồng độ thì khả năng trích ly của cao nước thấp hơn so với cao cồn 70º, tuy

50 nhiên lại cao hơn so với các nồng độ cao cồn còn lại Vì vậy, hàm lượng polyphenol và flavonoid của cao nước vẫn cao thích hợp cho áp dụng cho sản phẩm, cao nước chứa các cấu tử hòa tan tốt sẽ cho giá trị cảm quan tốt hơn

3.3.2.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu : nước

Trích ly là quá trình hòa tan chọn lọc một hay nhiều cấu tử có trong mẫu nguyên liệu bằng cách cho nguyên liệu tiếp xúc với dung môi Động lực của quá trình trích ly là sự chênh lệch nồng độ của cấu tử ở trong nguyên liệu là ở trong dung môi Kết quả sự ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu : nước đến quá trình trích ly thể hiện theo bảng 3.8

Bảng 3.8: Kết quả sự ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu : nước

Hiệu suất thu hồi chất khô (*) (%)

(*) Kết quả được lấy theo giá trị trung bình của 3 lần lặp lại và được xử lý thống kê bằng phần mềm Statgraphicplus 3.0 Các giá trị trong cùng 1 cột có ký tự giống nhau thì không có sự khác biệt theo thống kê với mức ý nghĩa α = 0,05

Qua bảng 3.8, cho thấy khi tăng tỷ lệ nguyên liệu : nước từ 1:10 (g/ml) đến 1:16 (g/ml) thì hiệu suất trích ly tăng do hàm lượng chất khô tăng, đồng thời hàm lượng polyphenol và flavonoid cũng tăng Nhưng khi tăng tỷ lệ nguyên liệu : nước đến 1:18 (g/ml) thì các chỉ tiêu này vẫn tiếp tục tăng nhưng không đáng kể về mặt thống kê Nguyên nhân dẫn đến kết quả này là do khi tăng lượng dung môi thì sự chênh lệch nồng độ của các cấu tử cần trích ly trong nguyên liệu và trong dung môi sẽ càng lớn làm cho hiệu quả trích ly sẽ càng tăng

Hiệu suất trích ly, hàm lượng polyphenol và flavonoid thấp nhất ở nghiệm thức 1:10 (g/ml) và cao nhất ở nghiệm thức 1:16 (g/ml) Khi tăng tỷ lệ nguyên liệu : nước từ 1:16 (g/ml) lên 1:18 (g/ml) thì các chỉ tiêu này tiếp tục tăng nhưng không đáng kể Điều này chứng tỏ tiếp tục tăng lượng nước sẽ không mang lại kết quả cao nhưng lại làm tốn chi phí dung môi Nếu tiếp tục tăng lượng dung môi nữa thì hàm lượng chất

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CHẤT LƯỢNG SẢN PHẨM

Sản phẩm nước uống đóng chai từ lá bần chua cho sản phẩm có chất lượng cao giúp tăng cường sức khỏe Để đánh giá được chất lượng của sản phẩm, tiến hành phân tích các chỉ tiêu có trong sản phẩm nước uống đóng chai

3.4.1 Kết quả chỉ tiêu hóa lý

Mẫu hòa tan được tiến hành kiểm tra chỉ tiêu theo các phương pháp trình bày ở bảng 2.9 và kết quả được trình bày ở bảng 3.13

Bảng 3.13: Kết quả chỉ tiêu hóa lý của sản phẩm

Hàm lượng polyphenol 3,058 Hàm lượng flavonoid 0,211

Hàm lượng polyphenol và flavonoid của sản phẩm nước uống đóng chai lá bần chua tương đối cao vì thế rất có lợi cho sức khỏe Nhưng so với hàm lượng polyphenol và flavonoid có trong nguyên liệu ban đầu, thì hàm lượng polyphenol và flavonoid trong sản phẩm giảm so với nguyên liệu ban đầu, cho thấy rằng các công đoạn chế biến có ảnh hưởng đến hàm lượng polyphenol và flavonoid, do polyphenol và flavonoid là hai hợp chất dễ bị oxy hóa và có một số nhóm chất nhạy cảm với nhiệt, khi qua các công đoạn chế biến dưới tác dụng của nhiệt độ đã làm phân hủy một vài loại polyphenol cũng như flavonoid trong mẫu

Kết quả trên là tiền đề giúp cho việc ứng dụng lá bần chua vào chế biến sản phẩm nước uống rất có ích cho sức khỏe

3.4.2 Kết quả khảo sát hoạt tính sinh học trên nước uống đóng chai thành phẩm

Sản phẩm nước uống đóng chai từ lá bần chua là một sản phẩm có giá trị cao, dễ dàng sử dụng, chứa nhiều hoạt chất có tác dụng tốt với sức khỏe con người Nước uống đóng chai được tiến hành khảo sát hoạt tính sinh học như 2.3.7.2 kết quả như sau:

❖ Kết quả khảo sát khả năng ức chế enzyme α -glucosidase

Nước uống đóng chai thành phẩm tiến hành khảo sát khả năng ức chế enzyme α-glucosidase như thí nghiệm khảo sát khả năng ức chế enzyme α-glucosidase trong nguyên liệu, kết quả được trình bày như bảng 3.14

Qua bảng 3.14, kết quả khảo sát khả năng ức chế enzyme α-glucosidase thấy rằng: khi tăng nồng độ mẫu thì khả năng ức chế enzyme α-glucosidase cũng tăng Khi tăng nồng độ nước uống đóng chai từ lá bần chuathì lượng các hợp chất có khả năng ức chế enzyme α-glucosidase cũng tăng, khi đó enzyme α-glucosidase bị cao chiết ức chế nên hàm lượng enzyme còn lại trong dung dịch phản ứng ít, nên khi cho cơ chất vào thì enzyme α-glucosidase chuyển hóa cơ chất tạo ra p-nitrophenol nên thể hiện giá trị mật độ quang thấp, thì phần trăm ức chế của enzyme cao

Bảng 3.14: Kết quả khảo sát khả năng ức chế enzyme α -glucosidase của sản phẩm

% ức chế gốc tự do

Dựa trên kết quả, nhận thấy rằng nước uống đóng chai từ lá bần chua có khả năng ức chế enzyme α-glucosidase nhưng khả năng ức chế enzyme thấp hơn so với nguyên liệu ban đầu, vì sau quá trình chế biến hàm lượng các hợp chất có hoạt tính sinh học đã bị thay đổi do trải qua nhiều công đoạn chế biến vì vậy hoạt tính sinh học giảm nên khả năng ức chế enzyme giảm

❖ Kết quả khảo sát khả năng kháng oxy hóa

Sau khi chế biến thành nước uống đóng chai thành phẩm, để đánh giá khả năng kháng oxy hóa của sản phẩm, tiến hành khảo sát khả năng kháng oxy hóa như thí nghiệm khảo sát khả năng kháng oxy hóa trong nguyên liệu Kết quả được trình bày ở bảng 3.15

Bảng 3.15: Kết quả khả năng kháng oxy hóa của sản phẩm

% ức chế gốc tự do

Qua bảng 3.15, kết quả khảo sát khả năng kháng oxy hóa theo phương pháp DPPH • thấy rằng: khi tăng nồng độ mẫu thì khả năng kháng oxy hóa cũng tăng vì trong lá bần chua có polyphenol – có khả năng kháng oxy hóa nên khi nồng độ cao

58 chiết tăng thì khả năng kháng oxy hóa tăng Do khi nồng độ cao chiết tăng lên thì các lượng hợp chất có hoạt tính sinh học trong dung dịch sẽ tăng lên, khả năng ức chế gốc tự do của DPPH ● cũng như các hợp chất có chứa nhiều gốc –OH sẽ trung hòa các gốc tự do trong dung dịch phản ứng làm thay đổi màu dung dịch phản ứng từ màu tím của DPPH● sang màu vàng nhạt nhanh hơn so với hàm lượng hợp chất có nhóm –OH ít tnên khả năng kháng oxy hóa sẽ tăng lên

Dựa trên kết quả, nhận thấy rằng nước uống đóng chai từ lá bần chua có khả năng kháng oxy hóa nhưng khả năng kháng thấp hơn so với nguyên liệu ban đầu Vì sau quá trình chế biến hàm lượng các hợp chất có hoạt tính sinh học – polyphenol đã bị giảm nên khả năng kháng oxy hóa thấp

Từ kết quả khảo sát hoạt tính sinh học, nhận thấy rằng: nguyên liệu lá bần chua tươi và nước uống đóng chai từ lá bần chua đều có khả năng ức chế enzyme α- glucosidase và khả năng kháng oxy hóa Nhận thấy rằng nước uống đóng chai từ lá bần chua có khả năng hỗ trợ hạ lượng đường huyết nên phù hợp cho bệnh nhân tiểu đường loại 2, ngoài ra hoạt tính kháng oxy hóa giúp chống lại các gốc tự do gây hại tế bào, ngăn cản sự hình thành các yếu tố gây ung thư Vì vậy, việc ứng dụng lá bần chua vào chế biến các sản phẩm thực phẩm là rất có lợi cho sức khỏe con người, góp phần đã dạng hóa sản phẩm thực phẩm chức năng trên thị trường

3.4.3 Kết quả chỉ tiêu cảm quan

Sản phẩm được sản xuất tại phòng thí nghiệm, sau đó đem đánh giá chất lượng cảm quan theo tiêu chuẩn TCVN 9739: 2013 (ISO 6079:1990) Hội đồng đánh giá cảm quan gồm 15 thành viên, kết quả như bảng 3.16

Sản phẩm nước uống đóng chai từ lá bần chua có điểm chất lượng là 17,83 Do đó nước uống đóng chai từ lá bần chua được xếp loại khá

Sản phẩm đạt giá trị cảm quan cao, từ đây tạo tiền đề cho việc ứng dụng quy trình sản xuất này để tạo ra một sản phẩm có lợi cho sức khỏe, đa dạng hóa sản phẩm trên thị trường và được người tiêu dùng ưa thích

Bảng 3.16: Kết quả đánh giá cảm quan sản phẩm

Người thử Chỉ tiêu đánh giá Độ trong Màu sắc Mùi Vị

Tổng 64 67 69 67 Điểm trung bình chưa có hệ số trọng lượng 4,27 4,47 4,6 4,47

Hệ số trọng lượng 1 0,6 1,2 1,2 Điểm trung bình có hệ số trọng lượng 4,27 2,68 5,52 5,36 Điểm chất lượng 17,83

3.4.4 Kết quả chỉ tiêu vi sinh vật

Sản phẩm được gửi mẫu kiểm tra tại Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm

CASE TP.Hồ Chí Minh thuộc Sở Khoa học và Công nghệ TP.Hồ Chí Minh Kết quả kiểm tra vi sinh được trình bày ở bảng 3.17 sau:

Bảng 3.17: Kết quả chỉ tiêu vi sinh của sản phẩm

STT Chỉ tiêu kiểm nghiệm Kết quả

2 Escherichia coli Không phát hiện

3 Salmonella (CFU/25 g) Không phát hiện

4 Staphylococcus aureus Không phát hiện

5 Tổng số nấm men – nấm mốc (CFU/mL) < 01

6 Tổng số vi khuẩn hiếu khí (CFU/mL) < 01

Qua bảng 3.17, nhận thấy rằng sản phẩm nước uống đóng chai từ lá bần chua không phát hiện sự có mặt của Escherichia coli, Salmonella và Staphylococcus aureus chứng tỏ rằng sản phẩm không bị nhiễm vi khuẩn sau quá trình chế biến nên sẽ không gây độc tố làm ảnh hưởng sức khỏe người tiêu dùng Theo những kết quả trên, sản phẩm đã đạt chỉ tiêu vi sinh vật, vì vậy cần có những phương pháp bảo quản nghiêm ngặt giúp hạn chế sự phát triển của vi sinh vật, giảm nguy cơ hư hỏng sản phẩm