sàng lọc cây dược liệu có hoạt tính kháng oxy hóa và ức chế enzyme α glucosidase được trồng tại rừng ngập mặn cần giờ và nghiên cứu quy trình sản xuất nước uống đóng chai hỗ trợ hạ đường huyết

SÀNG LỌC CÂY DƯỢC LIỆU CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA VÀ ỨC CHẾ ENZYME

RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ VÀ NGHIÊN CỨU

HỖ TRỢ HẠ ĐƯỜNG HUYẾT

TP HỒ CHÍ MINH, NĂM 2020

SÀNG LỌC CÂY DƯỢC LIỆU CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA VÀ ỨC CHẾ ENZYME

RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ VÀ NGHIÊN CỨU

GIẤY XÁC NHẬN

Tôi tên là: Lê Linh Ngọc

Ngày sinh: 25/06/1997 Nơi sinh: Quảng Trị

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã sinh viên: 1653010195

Tôi đồng ý cung cấp toàn văn thông tin khóa luận tốt nghiệp hợp lệ về bản quyền cho Thư viện Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh Thư viện Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh sẽ kết nối toàn văn thông tin khóa luận tốt nghiệp vào hệ thống thông tin khoa học của Sở Khoa học và Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh

(Ghi rõ họ và tên)

Lê Linh Ngọc

Giảng viên hướng dẫn: ThS Nguyễn Thị Lệ Thủy

Tên đề tài: SÀNG LỌC CÂY DƯỢC LIỆU CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA

VÀ ỨC CHẾ ENZYME α-GLUCOSIDASE ĐƯỢC TRỒNG TẠI RỪNG NGẬP

MẶN CẦN GIỜ VÀ NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT NƯỚC UỐNG ĐÓNG CHAI HỖ TRỢ HẠ ĐƯỜNG HUYẾT

Ý kiến của giáo viên hướng dẫn về việc cho phép sinh viên: Lê Linh Ngọc được bảo

luận tốt nghiệp

Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 08 năm 2020

Người nhận xét

hội học tập tốt

Lời tiếp theo em xin cảm ơn đến các thầy cô và bạn bè mà em có cơ hội tiếp xúc và học hỏi trong suốt quãng thời gian em ngồi trên ghế nhà trường, đặc biệt là các thầy cô trong khoa Công nghệ sinh học nói chung và các thầy cô trong chuyên ngành thực phẩm nói riêng của Trường Đại học Mở

Qua sự hướng dẫn và truyền đạt tận tình của quý thầy cô em đã hoàn thành

xong khóa luận tốt nghiệp của mình với đề tài : “SÀNG LỌC CÂY DƯỢC LIỆU

CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA VÀ ỨC CHẾ ENZYME α-GLUCOSIDASE

ĐƯỢC TRỒNG TẠI RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ VÀ NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT NƯỚC UỐNG ĐÓNG CHAI HỖ TRỢ HẠ ĐƯỜNG HUYẾT” Em xin dành lời cảm ơn sâu sắc và chân thành của mình đến cô ThS Nguyễn Thị Lệ Thủy – là giảng viên khoa Công nghệ sinh học, chuyên ngành Công nghệ thực phẩm và cũng là giảng viên hướng dẫn em thực hiện đề tài khóa luận Cô đã luôn dành thời gian để đồng hành cùng em, giúp đỡ và hướng dẫn em tận tình để em hoàn thành tốt đề tài của mình Không những chỉ dạy những kiến thức chuyên ngành mà cô còn chia sẽ cho em những kinh nghiệm làm việc, dạy cách làm việc như thế nào cho đạt hiệu quả cao Em xin chúc cô luôn khỏe mạnh, hạnh phúc và đạt được nhiều thành công trong cuộc sống

Và nhân dịp này em xin dành lời tri ân sâu sắc đến mẹ Người đã sinh thành, nuôi nấng và dạy dỗ em nên người, đã lo lắng cho em để em có cơ hội học hỏi và tiếp xúc với cuộc sống

Cuối cùng em xin chân thành cảm ơn gia đình và các anh chị, bạn bè những người đã hỗ trợ, luôn bên cạnh động viên, giúp đỡ cho em thực hiện đề tài khóa luận tốt nghiệp này

DANH MỤC HÌNH i

DANH MỤC BẢNG ii

DANH MỤC SƠ ĐỒ iii

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1 TỔNG QUAN VỀ CHI BẦN (SONNERATIA) 2

1.5 TỔNG QUAN VỀ ENZYME α – GLUCOSIDASE 19

1.5.1 Cấu trúc enzyme α – glucosidase 19

1.5.2 Cơ chế hoạt động của enzyme α – glucosidase 19

2.1 VẬT LIỆU 23

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 23

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 23

2.1.3 Hóa chất và thiết bị 23

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.2.1 Phương pháp thu thập mẫu 24

2.2.2 Xác định hàm lượng polyphenol 24

2.2.3 Xác định hàm lượng flavonoid 24

2.2.4 Phương pháp kháng oxy hóa: đánh bắt gốc tự do DPPH• 24

2.2.5 Phương pháp ức chế enzyme α – glucosidase 25

2.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 25

2.3.1 Sơ đồ nghiên cứu 25

2.3.2. Sơ đồ quy trình điều chế cao để thử hoạt tính sinh học 26

2.3.3 Quy trình sản xuất nước uống đóng chai dự kiến 27

2.3.4 Khảo sát thành phần nguyên liệu 28

2.3.5 Khảo sát hoạt tính sinh học trong nguyên liệu 29

2.3.6 Nghiên cứu quy trình sản xuất nước uống đóng chai 31

2.3.7 Nghiên cứu chất lượng sản phẩm 37

3.1 KẾT QUẢ KHẢO SÁT THÀNH PHẦN NGUYÊN LIỆU 41

3.1.1 Kết quả điều chế cao 41

3.1.2 Kết quả thành phần hóa lý của nguyên liệu 41

3.1.3 Kết quả định lượng polyphenol và flavonoid trong nguyên liệu 42

3.2 KẾT QUẢ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC NGUYÊN LIỆU 44

3.2.1 Kết quả khảo sát khả năng kháng oxy hóa 44

3.2.2 Kết quả khảo sát khả năng ức chế enzyme α – glucosidase 45

3.3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT NƯỚC UỐNG ĐÓNG CHAI HỖ TRỢ HẠ ĐƯỜNG HUYẾT 47

3.3.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của quá trình sao đến chất lượng sản phẩm 47

3.3.2 Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly 49

3.3.3 Kết quả khảo sát tỷ lệ phối trộn 53

nước uống đóng chai 54

3.4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CHẤT LƯỢNG SẢN PHẨM 55

3.4.1 Kết quả chỉ tiêu hóa lý 55

3.4.2 Kết quả khảo sát hoạt tính sinh học trên nước uống đóng chai thành phẩm 56

3.4.3 Kết quả chỉ tiêu cảm quan 58

3.4.4 Kết quả chỉ tiêu vi sinh vật 60

PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 61

TÀI LIỆU THAM KHẢO 64 PHỤ LỤC I

i

Hình 1.1 Cây bần trắng (Sonneratia alba) 2

Hình 1.2 Cây bần chua (Sonneratia caseolaris) 2

Hình 1.3 Cây bần ổi (Sonneratia ovata) 2

Hình 1.4 Cấu trúc hóa học các hợp chất từ chi Sonneratia 4

Hình 1.5 Cây Vẹt Trụ (Bruguiera cylindrica) 7

Hình 1.6 Cây Vẹt Dù (Bruguiera gymnorrhiza) 7

Hình 1.7 Cây Vẹt Tách (Bruguiera parviflora) 7

Hình 1.8 Cây Vẹt Đen (Bruguiera sexangula) 7

Hình 1.9 Cấu trúc hóa học các hợp chất từ chi Bruguiera 9

Hình 1.10 Cây mắm đen (Avicennia officinalis) 11

Hình 1.11 Cây mắm ổi (Avicennia marina) 11

Hình 1.12 Cây mắm quăn (Avicennia lanata) 11

Hình 1.13 Cấu trúc hóa học các hợp chất từ chi Bruguiera 13

Hình 1.14 Cây đước đôi (Rhizophora apiculata) 14

Hình 1.15 Cây đước xanh (Rhizophora mucronata) 14

Hình 1.16 Cây đước vòi (Rhizophora stylosa) 14

Hình 1.17 Cấu trúc hóa học các hợp chất từ chi Rhizophora 18

Hình 1.18 Cấu trúc không gian của enzyme α-glucosidase 19

Hình 2.1 Cơ chế kháng oxy hóa .24

Hình 2.2 Phản ứng thủy phân pNPG dưới sự xúc tác của enzyme α-glucosidase 25

ii

Bảng 2.1 Phương pháp khảo sát thành phần và tính chất nguyên liệu 28

Bảng 2.2 Bảng bố trí thí nghiệm quá trình sao 32

Bảng 2.3 Chỉ tiêu đánh giá cảm quan của dịch sau khi sao 32

Bảng 2.4 Bảng bố trí thí nghiệm khảo sát tỷ lệ nguyên liệu : dung môi 33

Bảng 2.5 Bảng bố trí thí nghiệm khảo sát nhiệt độ 34

Bảng 2.6 Bảng bố trí thí nghiệm khảo sát thời gian 35

Bảng 2.7 Bảng bố trí thí nghiệm khảo sát tỷ lệ phối trộn dịch chiết 35

Bảng 2.8 Bảng điểm cảm quan sau khi phối trộn dịch chiết 36

Bảng 2.9 Phương pháp khảo sát chỉ tiêu hóa lý của nước uống đóng chai 37

Bảng 2.10 Bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng ức chế enzyme α-glucosidase 38

Bảng 2.11 Bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng kháng oxy hóa từ cao chiết 38

Bảng 2.12 Phương pháp khảo sát các chỉ tiêu vi sinh vật 40

Bảng 2.13 Bảng cho điểm cảm quan sản phẩm nước uống đóng chai 39

Bảng 3.1 Kết quả điều chế cao 41

Bảng 3.2 Kết quả tính chất hóa lý 42

Bảng 3.3 Kết quả hàm hàm lượng polyphenol và flavonoid 43

Bảng 3.4 Kết quả khả năng kháng oxy hóa 44

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát khả năng ức chế enzyme α-glucosidase 46

Bảng 3.6 Kết quả đánh giá cảm quan dịch thành phẩm 48

Bảng 3.7 Kết quả sự ảnh hưởng dung môi đến hàm lượng polyphenol và flavonoid 49 Bảng 3.8 Kết quả sự ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu : nước 50

Bảng 3.9 Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ 51

Bảng 3.10 Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất trích ly 52

Bảng 3.11 Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của quá trình phối chế 53

Bảng 3.12 Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng nhiệt độ thanh trùng đến sản phẩm 55

Bảng 3.13 Kết quả chỉ tiêu hóa lý của sản phẩm 56

Bảng 3.14 Kết quả khảo sát khả năng ức chế enzyme α-glucosidase của sản phẩm 57

iii Bảng 3.16 Kết quả đánh giá cảm quan sản phẩm 59 Bảng 3.17 Kết quả chỉ tiêu vi sinh của sản phẩm 60Bảng 4.1 Kết quả khảo sát hoạt tính sinh học 61

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2.1: Sơ đồ nghiên cứu 25Sơ đồ 2.2: Sơ đồ quy trình đều chế cao 26Sơ đồ 2.3: Quy trình dự kiến sản xuất nước uống đóng chai 27

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Từ thời xa xưa, ông cha ta đã biết dùng cây cỏ để chữa bệnh Trải qua hàng ngàn năm lịch sử, các cây thuốc được phát hiện ngày càng nhiều hơn, các kinh nghiệm dùng cây thuốc chữa bệnh đã được tích lũy dần dần trong nhân dân, rồi được truyền từ đời này sang đời khác Đặc biệt, các loài cây ở vùng ngập mặn ven biển từ lâu đã là nguồn thuốc tự nhiên, rất phong phú và gần gũi đối với người dân vùng biển

Việt Nam có khoảng 3260 km bờ biển với nhiều loài thực vật ở các vùng sinh thái ven biển khác nhau, là quốc gia có hệ thống rừng ngập mặn phong phú trải dài từ Bắc đến Nam, do đó hệ thực vật rất phong phú và đa dạng Trong điều kiện địa lý khắc nghiệt như môi trường đất cát, yếm khí, nhiều côn trùng, thường xuyên ngập triều các loài cây ngập mặn ven biển đã trải qua quá trình sinh tổng hợp đặc biệt tạo ra nhiều hợp chất có cấu trúc phong phú và có hoạt tính sinh học cao Tuy nhiên ở Việt Nam, hiện nay các công trình nghiên cứu thăm dò về hoạt tính sinh học của các loài cây ngập mặn đã được ứng dụng trong dân gian để làm thuốc còn rất ít

Chính vì vậy, với mong muốn phát hiện cây có hoạt tính sinh học đã được người dân sử dụng làm thuốc nhưng chưa được nghiên cứu nhiều về mặt hoạt tính sinh học

Xuất phát từ cơ sở khoa học như trên, đề tài : “Sàng lọc cây dược liệu có hoạt tính

kháng oxy hóa và ức chế enzyme α-glucosidase được trồng tại rừng ngập mặn

Cần Giờ và nghiên cứu quy trình sản xuất nước uống đóng chai hỗ trợ hạ đường huyết” được đề xuất nhằm bước đầu tổng quan tài liệu và là tiền đề chọn lựa được cây

có hoạt tính sinh học ức chế enzyme α-glucosidase để tạo ra sản phẩm hỗ trợ sức khỏe

con người đặc biệt là đối với bệnh nhân bệnh tiểu đường Với tiêu chí đặt ra là công tác nghiên cứu không làm ảnh hưởng tới hệ sinh thái của rừng ngập mặn do đó chỉ thu hái lá trưởng thành của cây này để làm đối tượng nghiên cứu

Mục tiêu nghiên cứu:

- Tổng quan tài liệu một số cây thu hái ở rừng ngập mặn Cần Giờ

- Phân tích định lượng một số hợp chất có hoạt tính sinh học trong đối tượng nghiên

cứu

- Phân tích khả năng kháng oxy hóa và ức chế enzyme α-glucosidase

- Nghiên cứu quy trình sản xuất nước uống đóng chai hỗ trợ hạ đường huyết

2

PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 TỔNG QUAN VỀ CHI BẦN (SONNERATIA)

(Sonneratia caseolaris), Bần trắng (Sonneratia alba),Bần ổi (Sonneratia ovata) [2]

Rễ cây phát triển mạnh thành gốc to, mọc sâu dưới bùn đất và chắc khỏe Rễ của cây bần mọc ra từ thân rễ thành từng khóm quanh gốc rất đặc trưng Lá mọc đối xứng, phiến lá có hình trái xoan hoặc hình bầu dục, dày nhưng khá giòn Lá bần rộng 35 – 45 mm và dài 5 – 10 cm, cuống lá có gân giữa nổi rõ, dài khoảng 0,5 – 1,5 cm

Hoa mọc thành cụm ở đầu cành, cuống dài từ 0,5 – 1,5 cm, cụm hoa dài 5 cm và chứa từ 2–3 bông nhỏ Đài hoa có mặt trong màu tím hồng, mặt ngoài màu lục Cánh hoa thuôn ở 2 đầu, màu trắng lục, mỗi hoa gồm khoảng 6 cánh

Quả mọng, khi còn non thường giòn và cứng, khi chín mềm Quả chín khoảng 2 –3 cm, đường kính 5 – 10 cm, bên trong chứa nhiều hạt dẹt

3

1.1.2 Thành phần hóa học

❖ Phenolic

Năm 1968, J.B Lowry [29] nghiên cứu trên thân cây Sonneratia caseolaris có

chứa ellagic acid (6), rễ cây Sonneratia alba có ellagic acid (6 – 9)

Năm 2009, Shi–Biao Wu và cộng sự [51] đã cô lập được các hợp chất từ quả của

cây Sonneratia caseolaris bao gồm (–)(R)-nyasol (1), (–)-(R)-4-O-methylnyasol (2),

3-hydroxy-6H-benzo[c]chromen-6one (3), 3,8-dihydroxy-6H-benzo[c]chromen-6-one

(4)

Năm 2008, Tian Minqing và cộng sự [47] nghiên cứu trên thân và cành cây S

caseolaris cô lập bốn hợp chất: methyl gallate (5), 3,3'-di-O-methylellagic acid (8),

3,3',4-tri-O-methylellagic acid (9)

Năm 2015, Nguyễn Thị Hoài Thu và cộng sự [6], từ cây Sonneratia ovata đã cô

lập được bốn mươi hợp chất trong đó có năm hợp chất phenolics mới (15 – 19) ❖ Flavonoid

Năm 2006, Samir Kumar Sadhu và cộng sự [37] đã cô lập và xác định hai

flavonoids là luteolin (10) and luteolin 7-O-β-D-glucopyranoside (11)

Năm 2008, Tian Minqing và cộng sự [47] nghiên cứu trên thân và cành cây S

caseolaris cô lập được 24 hợp chất với ba hợp chất flavonoid: luteolin (10), quercetin

3O-β-L-arabinoside (12) và (+)-2,3-dihydrokaempferol (13),

Năm 2009, Shi–Biao Wu và cộng sự [51] đã cô lập được các hợp chất từ quả của

cây S caseolaris bao gồm (–)(R)-nyasol (1), (–)-(R)-4-O-methylnyasol (2),

3-hydroxy-6H-benzo[c]chromen-6one (3), 3,8-dihydroxy-6H-benzo[c]chromen-6-one

(4), luteolin (10), luteolin 7O-β-glucoside (11)

Năm 2009, Shi-Biao Wu và cộng sự [51] đã cô lập được bảy hợp chất từ quả của

Sonneratia ovata: (–)-(R)-nyasol (1), (–)(R)-4-O-methylnyasol (2),

3-hydroxy-6H-benzo[c]chromen-6-one (3), 3,8dihydroxy-6H-benzo[c]chromen-6-one (4) và

hovetrichoside C (14)

4

Phenolic

Flavonoid

Các hợp chất khác

Sonnerphenolic D (15) Sonnerphenolic D (16) Sonnerphenolic B (17)

Sonnerphenolic C (19) Sonnerphenolic A (18) Sonnercerrbrodide (20)

Hình 1.4 Cấu trúc hóa học các hợp chất từ chi Sonneratia

1.1.3 Hoạt tính sinh học

Trái cây của Sonneratia alba được sử dụng làm thuốc đắp lên vết sưng và bong

gân [13] Theo truyền thống, trái cây chín Sonneratia alba được sử dụng để hỗ trợ tiêu

hóa và thường được sử dụng để điều trị ho [36] Nước ép của Sonneratia ovata được sử

dụng để điều trị xuất huyết [13]

5 Toàn bộ cây hoặc một phần của câySonneratia caseolaris được sử dụng rộng rãi

trong các hệ thống y học truyền thống của một số quốc gia Ví dụ, ở Myanmar, trái cây được sử dụng để đắp Ở Malaysia, vỏ của trái cây già được sử dụng để điều trị giun sán, quả chín để trị ho và lá giã nát cầm máu và trị thủy đậu Ở Bangladesh, thường được sử dụng làm thuốc chống tiểu đường, làm se da, sát trùng và điều trị xuất huyết

[35]

• Hoạt tính kháng khuẩn

Tính chất kháng khuẩn của các cao chiết khác nhau của cây Sonneratia alba:

n-hexane, ethyl acetate và methanol đã được thử nghiệm Với liều 1,5 mg/đĩa, chiết xuất methanol và ethyl acetate cho thấy sự ức chế hiệu quả nhất đối với các chủng đã được

thử nghiệm Vi khuẩn gram âm Escherichia coli với vùng ức chế 17,5 mm và là chủng nhạy cảm nhất, tiếp theo là vi khuẩn gram dương Staphylococcus aureus (12,5 mm) và

Tác giả Phạm Văn Ngọt và các cộng sự [4] đã nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của một số loài cây ngập mặn ở khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ Kết quả nghiên cứu

cho thấy cao chiết từ 10 loài cây ngập mặn: Bần trắng (Sonneratia alba), Cóc kèn

(Derris trifoliata), Cóc trắng (Lumnitzera racemosa), Đước đôi (Rhizophora apiculata), Đước xanh (Rhizophora mucronata), Vẹt dù (Bruguiera gymnorhiza),

đều có khả năng kháng lại các 30 chủng vi khuẩn gây bệnh như Staphylococcus

aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa

Acid oleanolic và acid betulinic, được phân lập từ thân cây Sonneratia alba, cho thấy hoạt tính kháng vi khuẩn chống lại Mycobacterium tuberculosis H37Ra với giá trị

MIC tương ứng là 25 và 50 mg/mL Ngoài ra, 2,6-dimethoxy-pbenzoquinone (37) thể

hiện hoạt tính chống sốt rét chống P falciparum với giá trị IC50 là 3,08 mg/mL [15] Năm 2012, A A Laith và cộng sự [27] báo cáo rằng chiết xuất methanol của

Sonneratia caseolaris có hiệu quả trên tất cả các vi khuẩn gram âm bao gồm Klebsiella pneumonia, Shigella dysenteriae, Enterobacter cloacae, Enterobacter sakazakii, Enterobacter brevis, Chryseobacterium indologenes, Stenotrophomonas maltophilia và Aeromonas hydrophila với MIC từ 1,65 đến 6,25 mg/mL và hoạt động

cao nhất là giá trị LC50 là 6,16 mg/mL

6 Nhằm nghiên cứu tiềm năng ứng dụng của thực vật sinh trưởng ở các khu vực RNM, tác giả Trần Mỹ Linh và các cộng sự đã thu thập 9 loài thực vật từ vườn quốc gia Xuân Thủy, tỉnh Nam Định Dịch chiết methanol từ cành và lá của những loài thực

vật được sử dụng để đánh giá hoạt tính ức chế 4 loài vi khuẩn: Escherichia coli,

Staphylococcus aureus, Proteus mirabilis và Proteus vulgaris thu được kết quả cho

thấy loài L racemosa (Cóc trắng), S caseolaris (Bần chua) và S apetala (Bần

Myanma) có hoạt tính ức chế vi khuẩn cao[3] • Hoạt tính chống đái tháo đường

Một hợp chất polysacarit thu được từ chiết xuất lá Sonneratia alba sở hữu một

đặc tính chống tiểu đường rất hiệu quả, giúp giảm 19,2% lượng đường trong máu trong 6 giờ đầu và hơn nữa là 66,9% sau 12 giờ [30]

Chiết xuất methanolic từ trái cây của Sonneratia caseolaris làm giảm đáng kể

nồng độ glucose trong huyết thanh chuột với 19,3; 27,6; 28,6 và 41,4%, khi cho chúng

uống chiết xuất metanol của S caseolaris với liều 50, 100, 200 và 400 mg/kg trọng

lượng [35]

Acid oleanolic được phân lập từ trái của Sonneratia caseolaris cho thấy hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase mạnh mẽ với giá trị IC50 là 15 μM[48]

• Hoạt tính kháng oxy hóa

Một nghiên cứu cho thấy các chiết xuất khác nhau của vỏ cây Sonneratia alba

cho thấy các đặc tính chống oxy hóa, gây độc tế bào và kháng khuẩn cao Cao chiết

chloroform và metanol của vỏ cây Sonneratia alba cho thấy tính chất chống oxy hóa

cao, được xác định bằng phương pháp đánh bắt góc tự do DPPH•, với giá trị IC50 lần lượt là 12 và 14 µg/mL[9]

• Hoạt tính kháng ung thư

Từ trái cây của Sonneratia ovata, ba hợp chất

(-)-(R)-nyasol(1),(-)-(R)-4'O-methylnyasol và acid maslinic đã được phân lập và tìm thấy cho thấy hoạt động gây độc tế bào tương đối với dòng tế bào C-6 trên chuột bằng phương pháp xét nghiệm MTT với IC50 lần lượt là 19,02; 20,21 và 31,77 g/mL [51]

Theo Wetwitayaklung P [50], chiết xuất methanol của hạt Sonneratia caseolaris

là chất ức chế AChE tiềm năng với giá trị IC50 là 10,52 µg/mL

7 Năm 2008, Tian Minqing và cộng sự [47] phân lập luteolin từ thân và cành cây

Sonneratia caseolaris và chứng minh rằng trong thử nghiệm độc tế bào in vitro đối với

tế bào ung thư gan SMMC-7721, hợp chất này thể hiện hoạt động tương đối cao với giá trị IC50 2,8 µg/mL

1.2 TỔNG QUAN VỀ CHI VẸT (BRUGUIERA)

Theo tác giả Phạm Hoàng Hộ[2], ở Việt Nam chi Bruguiera gồm bốn loài là là

Vẹt Trụ (Bruguiera cylindrica), Vẹt Dù (Bruguiera gymnorrhiza), Vẹt Tách

(Bruguiera parviflora) và Vẹt Đen (Bruguiera sexangula)

1.2.1 Đặc điểm hình thái

Hình 1.5 Cây Vẹt Trụ (Bruguiera cylindrica)Hình 1.6 Cây Vẹt Dù (Bruguiera gymnorrhiza)

Hình 1.7 Cây Vẹt Tách (Bruguiera parviflora) Hình 1.8 Cây Vẹt Đen (Bruguiera sexangula)

Nguồn: Internet Chi Bruguiera, là đại mộc cao 20 m, tàn rậm; phế căn hình đầu gối Lá có phiến

non, gân phụ 7-10 cặp, khó nhận biết; cuống dài 2 cm, lá bẹ dài 5 - 7 cm Tụ tán từ 5 hoa; cọng 6-13 mm; đài có ống dài 7 - 9 mm, răng 8 - 10; cánh hoa vàng có 2 thùy, mỗi thùy có 3 lông tơ; tiểu nhụy từng cặp; noãn sào 2 - 4 buồng Trái cao 2 - 2,5 cm, trục hạ diệp dài 10 - 15 cm, to 4 - 5 mm, hợp tử là 2n = 36

2-8

1.2.2 Thành phần hóa học

❖ Lignan

Năm 2007, Li Han và cộng sự [28] đã cô lập được hợp chất từ nhánh cây Vẹt Dù

(Bruguiera gymnorrhiza) brugunin A (39)

Năm 2007, Shuyun Bao và cộng sự [39] đã cô lập được bốn hợp chất phenolic

glycosides mới gọi tên là rhyncosides A–D (21 – 24) và hai hợp chất mới thuộc nhóm lignan là rhyncosides E–F (25, 26), cùng mười hai hợp chất phenolic đã biết đến bao

gồm hai phenolic glycosides là 3,4,5-trimethoxyphenyl-β-D-glucopyranoside (27), (α-L-rhamnopyranosyl-(1–6)-β-D-glucopyranosyloxy)-3,4,5-trimethoxybenzene (28) và sáu lignan lyoniside (33), (+)-lyoniresinol 3α-O-α-L-rhamnopyranoside (34), (+)-

1-5′-methoxyisolariciresinol 9′-β-D-xylopyranoside (35) và hedyotisols A–C (36-38)

Năm 2008, Suisheng Shang and Shengjing Long[46] đã cô lập được một hợp chất

mới là brugnanin (42) từ nhánh cây Vẹt Dù (Bruguiera gymnorrhiza)

❖ Flavonoid

Năm 2007, Shuyun Bao và cộng sự [39] đã cô lập được bốn flavonoid bao gồm

tricin (29), rutin (30), nicotiflorin (31) và myricetin 3-O-rutinoside (32)

Lignan

Theo dân gian, trái cây của Vẹt dù (Bruguiera gymnorrhiza) được sử dụng rộng

rãi như một nguồn thay thế carbohydrate cho gạo cũng như các loại thuốc để điều trị các bệnh về mắt và herpes [31] Rễ và lá đã được sử dụng để điều trị bỏng Vỏ cây đã được sử dụng như một phương pháp điều trị tiêu chảy và sốt rét [22]

Chi Bruguiera được đặc trưng bởi sự hiện diện của số lượng lớn các hợp chất,

nhiều trong số đó cho thấy phạm vi hoạt động sinh học rộng Chúng bao gồm thuốc chống đông máu [23], chất chống oxy hóa, thuốc chống nấm, gây độc tế bào, hoạt động chống sốt rét và kháng khuẩn [31] Cho đến nay, hơn 200 hợp chất có hoạt tính sinh học đã được phân lập từ rừng ngập mặn và một số lượng lớn trong số chúng thuộc về chi

Bruguiera

• Hoạt tính kháng ung thư

Bruguiera cylindrica có hoạt tính kháng ung thư, trong số sáu ester triterpenoid

pentacyclic được phân lập từ quả của cây này, có hai hợp chất 3α-(Z)-feruloyltaraxerol

và 3α-(Z)-coumaroyltaraxerol gây độc tế bào yếu đối với dòng tế bào NCI–H187 [45]

Hợp chất Bruguierin A, cô lập được từ hoa của cây Bruguiera gymnorrhiza, ức

chế enzyme cyclooxygenase-2 (COX-2) với giá trị IC50 là 0.37 µM[44]

10 • Hoạt động chống sốt rét

Hợp chất 3β-(Z)-caffeoyllupeol được phân lập từ các loại trái của Bruguiera cho

thấy hoạt động chống sốt rét với giá trịEC50 là 8.6 µg/mL[33]

Năm 2011, Sundaram Ravikumar và cộng sự [41] đã chứng minh cao chiết ethanol

của lá cây Vẹt Trụ (Bruguiera cylindrica) có khả năng kháng vi trùng gây bệnh sốt rét

tại giá trị IC50 là 173,75 µg/ml

• Hoạt tính chống đái tháo đường

Enzyme PTP1B đóng vai trò quan trọng cả về mặt sinh lý và điều trị bệnh lý trên con đường truyền tín hiệu của insulin và các nghiên cứu chứng tỏ rằng thiếu hụt PTP1B cho thấy sự nhạy cảm với insulin tăng cường và chống lại bệnh béo phì do chế độ ăn kiêng Do đó, PTP1B có thể là một mục tiêu đầy hứa hẹn trong điều trị bệnh tiểu

đường loại II và béo phì Các hợp chất gymnorrhizol và bruguiesulfurol từ B

14,9 và 17,5µ [52].

• Hoạt tính kháng khuẩn

Một thử nghiệm kháng khuẩn in vitro cho thấy rằng chiết xuất methanolic của B

tubindrica có hoạt tính diệt phẩy khuẩn Mặc dù, B tubindrica có hoạt tính thấp nhưng

nó ức chế sự phát triển của hai loại vi khuẩn là Vibrio alcaligenes (7 mM) và Vibrio

• Hoạt động hạ lipid

Chiết xuất Bruguiera cylindrica có khả năng hạ lipid cũng như hoạt tính kháng

oxy hóa trong một mô hình triton Tác dụng hạ lipid của dịch chiết đã được tìm thấy thông qua ức chế sinh tổng hợp cholesterol ở gan, tăng bài tiết acid mật trong phân và lecithin huyết tương được kích thích: hoạt tính acyltransferase cholesterol [49]

Năm 2006, Homhual S và cộng sự [37] đã cô lập được ba hợp chất từ hoa của cây

Vẹt Dù (Bruguiera gymnorrhiza) trong đó có ba hợp chất đã biết là brugierol,

isobrugierol và một hợp chất mới là bruguiesulfurol Trong đó hai hợp chất brugierol và isobrugierol có khả năng ức chế hoạt tính của enzyme luciferase với giá trị IC50 là 85,0µM và 14,5 µM Ngoài ra hợp chất brugierol còn có khả năng ức chế enzyme cyclooxygenase-2 (COX-2) với giá trị IC50 là 6,1 µM

11 Năm 2011, Cai You-Sheng và cộng sự [53] đã cô lập được tám hợp chất mới từ

cây Vẹt Dù (Bruguiera gymnorrhiza) đó là các hợp chất palmarumycins BG1 – BG7

và hợp chất preussomerin BG1 trong đó hợp chất palmarumycins BG5 được chứng minh là có hoạt tính ức chế dòng tế bào HL 60 và MCF-7

Năm 2013, Suchada Chantrapromma và cộng sự [43] đã cô lập được hợp chất 3α

-feruloyltaraxerol từ cao chiết n-hexane của quả cây Vẹt Trụ (Bruguiera cylindrica) và

chứng minh khả năng gây độc tế bào kháng lại tế bào ung thư phổi của hợp chất này

1.3 TỔNG QUAN VỀ CHI MẮM (AVICENNIA)

Ở Việt Nam Chi Mắm (Avicennia) gồm ba loài là Mắm đen (Avicennia

Lá: lá đơn, mộc đối, đầu tròn lúc cây còn nhỏ, sau có hình trứng ngược, dài 6-8 cm, rộng 2,5 cm, chân nêm, bìa lá thường cuốn xuống, mặt trên xanh, trơn, mặt dưới có lông rất mịn, sát, màu vàng hung; gân rõ, các đầu gân phụ cân ở đầu, nối với bìa, cuống lá trơn dài 0,5-1cm

Hoa: hoa nhỏ, 10 mm, vàng, có mùi thơm, hợp thành phát hoa kép dày ở ngọn, thường có 3 nhánh hoa, mỗi hoa có lá bắc phụ nhỏ hình bầu dục, có lông tơ; đài hoa không rụng, lớn, các tai đài bằng nhau, hình bầu dục, có lông trắng mịn ở dưới thấp,

12 dài 5 - 6 mm, màu đen, vành hoa lớn, hình ống, dài bằng đài, màu vàng cam, ngoài trơn, dài 2-4, dính ở dưới, trên có 4 thùy không bằng nhau rụng sớm; 4 tiểu nhị, bầu noãn hình nón, có lông trắng mịn; vòi nhụy hình sợi dài trắng, có lông rậm, đầu nhụy chẻ hai, uốn cong

1.3.2 Thành phần hóa học

❖ Flavonoid

Năm 2000, Sharaf và cộng sự [38] cô lập được luteolin 7-O-methylether (43), chrysoeriol 7-O-glucoside (51), isorhamnetin 3-O-rutinoside (52), luteolin 7-O-

methyl 3’-O-βD-glucoside (53) và luteolin 7-O-methyl 3’-O-β-D-galactoside (54)

Năm 2004, Jia và cộng sự [24] từ cây A marina trồng tại Trung Quốc cô lập được

5-hydroxy-4,7-dimethoxyflavone (44), quercetin (45), kaempferol (46)

Năm 2007, Feng và cộng sự [19] đã cô lập được

5,7-dihydroxy-3’,4’,5’trimethoxyflavone (49)

Năm 2010, Pham Thi Thuy Trang và cộng sự [5] đã cô lập được các hợp chất

kaempferol (46) từ cây A marina trồng tại Bạc Liêu

Từ cây Avicennia marina ở Trung Quốc, năm 2006, Feng và cộng sự [18], [19] đã

cô lập được bốn hợp chất flavon luteolin 7-O-methylether (44), 3’,5’,7-trimethoxyflavone (47), 4’,5,7trihydroxyflavone (48), velutin (50)

4’,5-dihydroxy-❖ Lignan

Năm 2007, Feng và cộng sự [18] đã cô lập được syringaresinol (57)

Năm 2008, Han và cộng sự [20] đã cô lập từ cây Mắm Ổi trồng tại Xiamen Trung Quốc các hợp chất (7’S,8’R)-4,4’,9’-trihydroxy3,3’,5,5’-tetramethoxy-7,8-dehydro-9-

al-2,7’-cyclolignan (55), lyoniresinol (56), lyoniresinol 9’-O-β-D-glucopyranoside

Theo cách sử dụng truyền thống, vỏ cây, lá và quả của Avicennia officinalis đã

được sử dụng làm thuốc kích thích tình dục, lợi tiểu, viêm gan và bệnh phong [13] • Hoạt tính kháng khuẩn

Chiết xuất ethyl acetate của A officinalis cho thấy hoạt tính kháng khuẩn cao với đường kính của vùng ức chế là 13 mm so với Eschericia coli (E coli) và 11 mm so với

14

Dịch chiết n-hexane của cây Mắm đen đã được công bố tác dụng kháng khuẩn

Dịch chiết từ các loài thuộc chi Mắm (Avicennia) có hoạt tính kháng khuẩn với các loài vi khuẩn như Candida albicans, Mycobacterium vaccae, Mycobacterium

aurum, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium fortuitum và Staphylococcus aureum [21]

• Hoạt tính kháng ung thư

Các chiết xuất lá methanol của A officinalis và A marina cho thấy sự ức chế

đáng kể acetylcholinesterase (AChE) với các giá trị IC50 là 1,24 mg/mL và 3,2 mg/mL, so với donepezil với giá trị IC50 là 3,96 mg/mL [40] A officinalis cho thấy ức chế 50% butyrylcholinesterase (BChE) ở nồng độ rất thấp 0,91 mg/mL so với A marina, cho

thấy ức chế 50% ở nồng độ cao hơn là 1,96 mg/mL

Cao chiết nước của lá Mắm đen có tác động giảm loét ở liều 62,5 và 125 mg/ml trên mô hình gây loét dạ dày chuột ablino bằng dixloena.với liều 100 mg/kg [42]và đặc biệt lá cò khả năng ức chế trên 50% chonlinedterase butyry cholinesterase ở liều 1.3 mg/mL [26]

1.4 TỔNG QUAN VỀ CHI ĐƯỚC (RHIZOPHORA)

15 Các loài đước là cây thân gỗ cao từ 20 - 35 m, đường kính thân 30 – 45 cm, có khi tới 70 cm Ở một số nơi đất cao ngập triều, nghèo dinh dưỡng, không ngập triều thường có kích thước nhỏ hơn và tăng trưởng chậm

Rễ cọc ít phát triển, chủ yếu là hệ thống rễ chống (rễ chân nôm) gồm từ 8 - 12 rễ Thân đước tròn thẳng, vỏ dày màu nâu xám đến nâu đen và có nhiều vết nứt dạng ô vuông Là cây có đặc tính phân cành và có tán lá hình dù (1 - 5 tuổi), biến đổi thành hình trụ khi cây từ 6 tuổi trở đi, cành thường nhỏ và có khả năng tỉa cành tự nhiên tốt Lá đơn, mọc đối từng đôi một, phiến lá dày hình thuôn dài, cuống là dài 1,5 – 2 cm Cụm hoa hình tán, mỗi cặp có 2 hoa mọc từ nách lá, hoa không cuống, màu đỏ lợt

❖ Flavonoid

Từ cây Rhizophora stylosa được công bố có hợp chất flavoglycans (82) được cô

lập do Richter và cộng sự năm 1990

Năm 1981, Rollet đã công bố cây đước xanh sở hữu các hợp chất procyanidin

(75), anthocyanidin (76), flavonoid (77) các hợp chất này có tác dụng trong bệnh chân

voi, khối máu tụ, viêm gan, giải nhiệt

Năm 2007, Dong Li và cộng sự cô lập được hợp chất mới 3,7-O-diacetyl

epicatechin (85) và bảy hợp chất flavanol đã biết: epicatechin (86), 3-O-acetyl epicatechin (87), 3,3’,4’,5,7-O-pentaacetyl(–)-epicatechin (88), (+)-afzelechin (89),

(–)-(+)-catechin (90), cinchonain Ib (91) và proanthocyanidin B2 (82) từ rễ và thân cây R

stylosa

Năm 2008, Rahim và cộng sự đã cô lập được các hợp chất bao gồm catechin

(65), epicatechin (66), epigallocatechin (67) và epicatechingallate (68) từ vỏ cây đước

đôi

Năm 2012, Mingzhe and Hongbin đã cô lập được hợp chất tự nhiên

afzelechin-3-O-L-rhamno-pyranoside (74) từ phân đoạn butanol của cây đước đôi có hoạt tính

kháng oxy hóa in vitro

Năm 2014, Foukia và cộng sự từ cao acetate cây R stylosa đã cô lập được hợp

chất anthocyanides (92)

16

❖ Tanin

Năm 1981, Rollet đã công bố cây đước xanh sở hữu các hợp chất tự nhiên tannin

(63) và năm 2006, Lim và cộng sự đã công bố hợp chất tannins (63) trong cao chiết

cây đước đôi có khả năng kháng khuẩn và kháng nấm

Năm 2011, Lim và cộng sự đã cô lập được hợp chất tannin (69) từ dịch chiết vỏ cây đước đôi Tannin (69) được phân tách thành tannin cô đặc (70)

Năm 2014, Foukia và cộng sự từ cao acetate cây R stylosa đã cô lập được các

hợp chất tannins (69)

❖ Phenolic

Năm 1981, Rollet đã công bố cây đước xanh sở hữu các hợp chất tự nhiên

inositol (78), polyphenol (79) và saponin (90)

Năm 2012, Asha và cộng sự cô lập được hợp chất phenolic (64) và flavonoid

(77) từ cây đước đôi, các hợp chất này có khả năng kháng oxy hóa theo phương pháp

Epigallocatechin (67) Epicatechingallate (68) Afzelechin-3-O-L-rhamno-pyranoside (75)

Tannin (69) Tannin thủy phân (79)

Anthocyanidins (76)

polysaccharide từ lá của loài R apiculata, R mucronata có hoạt tính chống lại virus

gây suy giảm miễn dịch

Năm 1981, Rollet đã công bố cây đước xanh sở hữu các hợp chất tự có tác dụng trong điều trị bệnh chân voi, khối máu tụ, viêm gan, giải nhiệt

Năm 1999, Premanathan và cộng sự đã công bố cây đước đôi chứa nhiều hợp chất tự nhiên có tác dụng cho bệnh tiêu chảy, buồn nôn, thương hàn, viêm gan, sát trùng và diệt côn trùng

• Hoạt tính kháng oxy hóa

Từ lá, thân, vỏ và rễ của R mucronata có hoạt tính chống oxy hóa mạnh [44];

Dịch chiết từ vỏ và các dẫn xuất flavonol phân lập được từ loài R stylosa có hoạt tính

ức chế hoạt động của gốc tự do

19 • Hoạt tính kháng khuẩn

Năm 2004, Abeysinghe và cộng sự đã chứng minh cây đước đôi có khả năng ức

chế hiệu quả sự tăng trưởng của Staphylococcus sp và Proteus sp

Năm 2006, Lim và cộng sự đã công bố hợp chất hydrolysable tannins trong cao chiết cây đước đôi có khả năng kháng khuẩn và kháng nấm

1.5.1 Cấu trúc enzyme α-glucosidase

Hình 1 18 Cấu trúc không gian của enzyme α-glucosidase

Nguồn: Internet

Enzyme α-glucosidase với những tên khác như maltase, glucoinvertase, glucosidoinvertase, glucosidosucrase, maltase- glucoamylase, nitrophenyl α-D-glucosidase, transglucosidase, α- glucosidase, glucosidoinvertase, α-D-glucosidase, α-glucosidase hydrolase, α-1,4-glucosidase, thuộc nhóm hydrolase ( nhóm enzyme xúc

tác các phản ứng thủy phân) [7]

1.5.2 Cơ chế hoạt động của enzyme α – glucosidase

Carbohydrate chứa trong thức ăn là nguồn cung cấp chất đường cho cơ thể Sau khi vào cơ thể, những carbohydrat được thủy phân thành những phân tử đường đơn bởi những enzyme trong ruột non và các phân tử đường này được tỏa ra nuôi các tế

bào cơ thể Tiến trình phân hóa này đòi hỏi tụy tạng phải tiết ra α-amylase dùng để

phá vỡ các phân tử carbohydrate lớn thành oligosaccharide, màng tế bào ruột non lại

tiết ra α-glucosidase để tiếp tục phân hóa các oligosaccharide thành các phân tử đường

đơn rồi mới thẩm thấu vào máu Chức năng chính của enzyme này là xúc tác cho việc

cắt đứt liên kết 1,4-α-D-glucosid của cơ chất để giải phóng ra α-D-glucose Bằng cách

20

kiềm chế sự hoạt động của enzyme α-glucosidase, có thể làm giảm sự thủy giải của

carbohydrate và làm chậm sự thẩm thấu glucose vào máu

1.6.1 Khái niệm

Gốc tự do (free radical) là những nguyên tử, nhóm nguyên tử hoặc phân tử ở lớp ngoài cùng có những electron không ghép đôi Gốc tự do có thể tồn tại độc lập, tuy nhiên thời gian tồn tại của các gốc tự do thường rất ngắn Các electron này có năng lượng cao, rất kém bền nên dễ dàng tham gia vào nhiều phản ứng hóa học như phản ứng oxy hóa - khử, phản ứng polymer hóa…[2]

1.6.2 Vai trò của gốc tự do trong cơ thể 1.6.2.1 Tác dụng có hại của gốc tự do

Stress oxy hóa (oxidative stress): là kết quả của sự hình thành gốc tự do vượt quá mức kiểm soát của các hệ thống chống oxy hóa trong cơ thể Stress oxy hóa dẫn đến hậu quả là phát sinh nhiều loại bệnh của tuổi già và một số bệnh về thần kinh khác; xơ vữa động mạch, bệnh đái tháo đường, bệnh phổi, bệnh ung thư,

Quá trình peroxid hóa lipid: việc làm hư hại lipid làm ảnh hưởng đến tính linh động của màng dẫn đến một số bệnh như đái tháo đường, bệnh trên hệ tim mạch

Phá hủy DNA: các gốc tự do dễ dàng tấn công DNA thông qua việc tấn công vào nhóm đường deoxyribose và base nitơ của nhóm purin và pirimidin thành thể đột biến

Quá trình lão hóa: lão hóa là một quá trình phức tạp trong đó các tổn hại do oxy hóa đóng vai trò rất quan trọng Các phản ứng sinh hóa bên trong tế bào tạo ra các gốc tự do hoạt động, các gốc này nhanh chóng phản ứng với các phân tử quanh nó là nguyên nhân chính gây xáo trộn hoạt động của các ty lạp thể, bám vào các ADN gây đột biến bên trong các tế bào Vì thế, các gốc tự do là nguyên nhân của sự tự hủy hoại và lão hóa ở cấp tế bào

21 mức độ vi mô Vai trò của gốc tự do trong hệ thống miễn dịch, cơ thể chúng ta rất dễ bị các sinh vật lạ hoặc vi khuẩn từ môi trường bên ngoài xâm nhập vào Gốc tự do, phần lớn được tạo ra bởi sự hoạt hóa của các đại thực bào góp phần cùng với bạch cầu tiêu diệt các vi sinh vật có hại

Gốc tự do còn góp phần quét dọn những tế bào già, chết trong cơ thể tạo điều kiện cho những tế bào mới sinh sôi và phát triển Đồng thời gốc tự do còn góp phần tiêu diệt các tế bào bất thường như tế bào ung thư

Ngoài ra, còn đóng vai trò là chất dẫn truyền thần kinh, hoặc làm nhiệm vụ là tế bào tín hiệu và cần thiết cho việc hình thành một số hormon như thyroxin

Hiện nay có rất nhiều phương pháp thử hoạt tính chống oxi hóa: oxygen radical absorbane capacity (ORAC), Total radical-trapping antioxidant parameter (TRAP), ferrie reducing antioxidant power assay (FRAP), 1,1 diphenyl -2-picrylhydrazyl radical scavenging (DPPH),… Tuy nhiên ở đây chúng tôi chọn phương pháp thử hoạt tính chống oxy hóa DPPH• vì những ưu điểm của nó so với các phương pháp khác như sau:

- Phương pháp đơn giản, thiết bị yêu cầu không quá phức tạp - Tiến hành nhanh chóng

- Thích hợp nhiều tác nhân chống oxy hóa

Ngoài ra, nó còn được dùng đo tính chống oxy hóa cho các sản phẩm thực phẩm Marsden Blois là người đầu tiên đặt nền móng cho phương pháp DPPH• cách đây gần 50 năm (1958), ở thí nghiệm đầu tiên Blois đã thử hoạt tính chống oxy hóa của amino axit cystein bằng cách dùng DPPH• chuẩn độ nó rồi đo độ hấp thu theo thời gian ở bước sóng 517nm Tên khoa học của DPPH• là 1,1 diphenyl -2-picrylhydrazyl (2,2 diphenylpicrylhydrazyl), là gốc tự do bền, màu tím, phân tử không bị dime hóa như một số gốc tự do khác

Năm 1922, Goldschmidt và Renn đã phát hiện ra một gốc tự do bền có màu tím đậm, hầu như không phân hủy, không nhị trùng hóa và cũng không phản ứng với oxy đó chính là gốc tự do DPPH• (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) DPPH• là một gốc tự do có màu tím giống như màu của dung dịch KMnO4, không tan trong nước, tan trong dung môi hữu cơ Dung dịch DPPH• có độ hấp thụ cực đại tại bước sóng 517 nm và

22 sản phẩm khử của nó là 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazine (DPPH-H) thì có màu vàng cam.[16]

1.6.4 Cơ chế hình thành gốc tự do

Các gốc tự do thì không ổn định, chúng phản ứng nhanh chóng với những tổ hợp khác, cố gắng lấy electron mà chúng cần để có sự ổn định Một cách tổng quát, các gốc tự do tấn công phân tử ổn định gần nhất để lấy electron của chúng Khi phân tử ổn định bị mất electron, bản thân chúng biến thành gốc tự do và bắt đầu một chuỗi phản ứng tương tự Một khi quá trình này bắt đầu chúng có thể lan truyền, cuối cùng cho kết quả là một tế bào sống bị phá hủy

23

PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Chi Bần (Sonneeratia): cây Bần Chua (Sonneratia caseolaris), cây Bần Trắng

(Sonneratia alba)

Chi Vẹt (Bruguiera): Vẹt Trụ (Bruguiera cylindrica), Vẹt Tách (Bruguiera

parviflora) và Vẹt Đen (Bruguiera sexangula)

Chi Mắm (Avicennia): cây Mắm Đen (Avicennia officinalis), cây Mắm Quăn

(Avicennia alba)

Chi Đước (Rhizophara): cây Đước Đôi (Rhizophora apiculata), cây Đước Xanh

(Rhizophora mucronata) và cây Đước Vòi (Rhizophora stylosa)

Bộ phận thu hái: lá trưởng thành

Địa điểm thu hái: tại rừng ngập mặn Cần giờ thành phố Hồ Chí Minh vào tháng 7 năm 2019

Sau khi hái về, nguyên liệu rửa sạch, loại bỏ tạp chất, phơi khô và xay để tạo

thành bột cây để chuẩn bị cho quá trình nghiên cứu

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu

Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm Sinh Hóa, Khoa Công Nghệ Sinh Học, trường Đại học Mở Thành Phố Hồ Chí Minh trong thời gian từ tháng 8/2019 đến tháng 07/2020

2.1.3 Hóa chất và thiết bị

❖ Hóa chất:

- Các loại dung môi ethanol (Việt Nam), metanol (Việt Nam), NaOH (Việt Nam), acid formic (Việt Nam), acid phosphoric (Việt Nam)

- DMSO, thuốc thử Folin-Ciocalteu (Merck)

- DPPH•, enzyme α- glucosidase, acarbose, cơ chất p- Nitrophenyl-α-D- glucopyranoside ( Aldrich Sigma), cơ chất para-nitrophenyl-α-D-glucosidase

Hóa chất sử dụng đạt trình độ tinh khiết phân tích

24

❖ Thiết bị:

- Tủ sấy (Memmert ALM400) - Cân phân tích điện tử (AA – 200) - Cân kĩ thuật (Sartorius TE 412) - Máy cô quay (Heidolph)

2.2.1 Phương pháp thu thập mẫu

Mười mẫu lá cây nghiên cứu được thu hái thuộc rừng ngập mặn Cần Giờ Các mẫu cây thuốc này được lựa chọn theo tiêu chí dân gian, tài liệu tham khảo

Ngày nay DPPH• được sử dụng để khảo sát khả năng ức chế gốc tự do Phương pháp này rất hữu hiệu được dùng phổ biến vì đơn giản, nhanh chóng và dễ ổn định

Các chất có khả năng kháng oxi hóa sẽ trung hòa gốc DPPH• bằng cách cho hydrogen, làm giảm độ hấp thu tại bước sóng cực đại và màu của dung dịch phản ứng sẽ nhạt dần, chuyển từ tím sang vàng nhạt Phản ứng trung hòa gốc DPPH• của các chất kháng oxy hóa được minh họa bằng phản ứng được mô tả bên trên

Hình 2 1: Cơ chế kháng oxy hóa

25

Nghiên cứu khả năng ức chế α-glucosidase được xác định theo phương pháp của

Apostolidis và cộng sự[54] Để khảo sát khả năng ức chế hoạt tính enzyme

α-glucosidase trên cao chiết, ta sử dụng p-nitrophenyl-α-D-glucopyranosid (pNPG) làm cơ chất Cơ chất p-nitrophenyl-α-D-glucopyranosid sẽ bị enzyme α-glucosidase thủy phân chuyển hóa thành α-D-glucose và p-nitrophenol (pNP)

Hình 2 2 Phản ứng thủy phân pNPG dưới sự xúc tác của enzyme α-glucosidase

2.3.1 Sơ đồ nghiên cứu

Nguyên liệu sau khi thu hái, phân loại, rửa sạch và thái nhỏ Tiến hành sấy khô và nghiền thành bột Sau đó tiến hành nghiên cứu theo sơ đồ 2.1:

Thu thập mẫu nghiên cứu

Thử nghiệm hoạt tính sinh học

Nghiên cứu quy trình sản xuất nước uống đóng chai Xử lí nguyên liệu

Khảo sát chất lượng sản phẩm toàn diện Khả năng

kháng oxy hóa

Khả năng ức chế enzyme

α-glucosidase

Chỉ tiêu hóa lí

Hoạt tính sinh học

Chỉ tiêu vi sinh

Sơ đồ 2.1: Sơ đồ nghiên cứu

Cao tổng được trích ly bằng dung môi ethanol với thông số trích ly như sau: tỷ lệ nguyên liệu : dung môi là 1:50 (g/ml), ở nhiệt độ 60ºC trong thời gian 60 phút và thực hiện 8 lần Sau quá trình trích ly tiến hành lọc thô rồi lọc tinh để loại bỏ bã, dịch sau khi lọc được loại dung môi bằng hệ thống cô quay chân không, thu hồi dung môi ethanol và cao tổng Sau đó, cao ethanol sẽ tiến hành khảo sát hoạt tính

sinh học: kháng oxy hóa và khả năng ức chế enzyme α- glucosidase của cao ethanol

Sơ đồ 2.2: Sơ đồ quy trình đều chế cao

Nguyên liệu

Bột nguyên liệu khô

Chiết cao Ethanol

Lọc thô

Lọc chân không

Cô quay

Cao cồn

27 Rửa sạch

Phơi khô Xay nhuyễn

2.3.3 Quy trình sản xuất nước uống đóng chai dự kiến

Nước uống đóng chai bắt đầu xuất hiện từ thế kỷ XVII ở Mỹ Ưu điểm của nước uống đóng chai là dễ dàng, nhỏ gọn, sử dụng trong những chuyến đi xa, tham gia các hoạt động ngoài trời Hiện nay có rất nhiều loại nước có ga giúp uống nhanh, tuy nhiên việc sử dụng quá nhiều nước có ga có hại cho sức khỏe Trong nước có ga có chứa cồn, các chất kích thước, cùng với lượng cao gây ra tình trạng xương yếu, đồng thời tăng nguy cơ béo phì, tiểu đường làm tăng huyết áp

Vì vậy nước uống đóng chai được sản xuất từ nguyên liệu tự nhiên có các hợp chất sinh học rất được người tiêu dùng quan tâm

Sau khi khảo sát hoạt tính sinh học khả năng ức chế α-glucosidase, lựa chọn

được nguồn cây dược liệu ứng dụng vào sản phẩm Quy trình sản xuất nước uống đóng chai hỗ trợ hạ đường huyết dự kiến theo như sơ đồ 2.3

Sơ đồ 2.3: Quy trình dự kiến sản xuất nước uống đóng chai

Thuyết minh quy trình:

Nguyên liệu được thu hái về, loại bỏ những lá hư hỏng, sâu bệnh và rửa sạch Nguyên liệu sau đó được phơi khô, nghiền mịn Tiến hành khảo sát quá trình sao nhằm tìm ra thông số thời gian và nhiệt độ sao tối ưu để đảm bảo chất lượng Bột

Bã

Bảo ôn Sản phẩm

Gia nhiệt – Bài khí

Rót chai – Ghép nắp

28 nguyên liệu sẽ được trích ly với dung môi nhằm tìm ra thông số tối ưu của quá trình trích ly với hàm lượng chất khô cao Sau khi trích ly cần lọc để loại bỏ bã nguyên liệu cũng như cặn để thu được dịch trích Tiến hành phối trộn với cỏ ngọt thích hợp để tăng vị cho sản phẩm mà vẫn giữ được mùi thơm và màu sắc đặc trưng của sản phẩm Mẫu sẽ được rót chai - ghép nắp và sau đó là gia nhiệt – bài khí Mẫu thành phẩm sẽ được đem đi thanh trùng nhằm kéo dài thời gian bảo quản của sản phẩm

2.3.4 Khảo sát thành phần nguyên liệu

❖ Cách tiến hành:

Lấy 1 mg cao chiết được thực hiện và pha loãng 100 lần Sau đó lấy 1ml dung dịch vừa pha loãng vào bình định mức 10 ml, thêm 0,5 ml thuốc thử Folin –Ciocalteu, lắc đều, để phản ứng diễn ra trong 3 phút rồi thêm vào 1 ml dung dịch Na2CO3 bão hòa, lắc đều và bổ sung nước cất đến vạch định mức Để yên trong 3 phút rồi đem so màu ở bước sóng 760 nm với nước cất làm chuẩn

Hàm lượng tro tổng (%w/w khô) Nung ở 550 - 6000C đến khối lượng không đổi

Hàm lượng đường khử, đường tổng (%) Phương pháp Bertrand

29

❖ Xử lý kết quả:

Dựa vào đường chuẩn acid gallic để xác định hàm lượng polyphenol có trong mẫu cao bán thành phẩm Hàm lượng polyphenol có trong mẫu được tính bằng đương lượng acid gallic (GAE) có trong mẫu cao đem định lượng

2.3.4.3 Xác định hàm lượng flavonoid

Từ nguyên liệu ban đầu được xử lý theo sơ đồ 2.2 để thu nhận bán thành phẩm cao chiết, với dung môi cồn thu cao cồn Cao chiết được xác định hàm lượng flavonoid dựa theo phương pháp tạo màu với AlCl3 bằng cách xây dựng đường chuẩn quercetin.[14]

❖ Cách tiến hành:

Lấy 1 mg cao bán thành phẩm và pha loãng 10 lần Sau thêm vào 4 ml nước cất thu được hỗn hợp 1 Sau đó, thêm vào 0,3 ml dung dịch NaNO2 5% Sau 5 phút thêm tiếp 0,3 ml dung dịch AlCl3 10%, sau 6 phút cho vào 2 ml dung dịch NaOH 1M và định mức đến thể tích 10 ml bằng nước cất Tiến hành đo độ hấp thụ ở bước sóng 425 nm

❖ Xử lý kết quả:

Dựa vào đường chuẩn quercetin để xác định hàm lượng flavonoid có trong mẫu cao bán thành phẩm Hàm lượng flavonoid có trong mẫu được tính bằng đương lượng quercetin có trong mẫu cao đem định lượng

2.3.5 Khảo sát hoạt tính sinh học trong nguyên liệu

2.3.5.1 Khảo sát khả năng kháng oxy hóa