Trang 1 Bộ CÔNG THƯƠNGĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINHBÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌCKẾT QUẢ THựC HIỆN ĐÈ TÀI NGHIÊN cứu KHOA HỌC CẤP TRƯỜNGTên đề tài:NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA
Bộ CÔNG THƯƠNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC KẾT QUẢ THựC HIỆN ĐÈ TÀI NGHIÊN cứu KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG Tên đề tài: NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA TINH DẦU củ GỪNG (ZINGIBER OFFICINALE ROSE) Ở MỘT SỐ TỈNH MIÊN NAM Mã số đề tài: 21/1SHT 03 Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Ngẩn Đơn vị thực hiện: Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm Tp Hồ Chí Minh, 2023 LỜI CÁM ƠN Trong suốt thời gian nghiên cứu thực đề tài, nhóm nghiên cứu nhận nhiều hỗ trợ từ phía nhà trường, ban lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học -Thực phẩm, đồng nghiệp môn Công nghệ Sinh học Cơng nghệ Thực phẩm Nhóm nghiên cứu xin gửi lời cảm ơn đến nhà trường, Viện Công nghệ sinh học Thực phẩm tạo điều kiện thời gian phịng thí nghiệm, dụng cụ, thiết bị hóa chất để thực khảo sát đề tài Mặc dù cố gắng hoàn thành tốt báo cáo nhiên q trình thực khơng tránh khỏi thiếu sót, kính mong nhận góp ý quý báu thành viên Hội đồng nghiệm thu Chúng tơi xin chân thành cảm ơn! NHĨM NGHIÊN cứu PHẦN I: THƠNG TIN CHƯNG I Thơng tin tổng quát 1.1 Tên đề tài: Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học tinh dầu củ gừng (Zingiber officinale Rose.) số tỉnh miền Nam 1.2 Mã số: 21/1SHT 03 1.3 Danh sách chủ trì, thành viên tham gia thực đề tài Họ tên Đơn vị cơng tác Vai trị thực đề tài Viện Công nghệ Sinh Chủ nhiệm đề tài TT (học hàm, học vị) TS Nguyễn Thị Ngần học - Thực phẩm TS Nguyễn Ngọc Tuấn Viện Công nghệ Sinh Thành viên học - Thực phẩm 1.4 Đon vị chũ trì: Viện Cơng nghệ Sinh học Thực phẩm 1.5 Thòi gian thực hiện: 1.5.1 Theo hợp đồng: từ tháng 03 năm 2021 đến tháng 03 năm 2022 1.5.2 Gia hạn (nếu có): từ tháng 03 năm 2022 đến tháng 09 năm 2022 1.5.3 Thực thực tế: từ tháng 03 năm 2021 đến tháng 09 năm 2023 1.6 Nhũng thay đổi so vói thuyết minh ban đầu (nếu có): Khơng có 1.7 Tổng kinh phí phê duyệt đề tài: 55 triệu đồng (Năm mưoi lăm triệu đồng) CHƯƠNG 1 Két nghiên cứu Đặt vấn đề Việt Nam quốc gia nằm vùng nhiệt đới gió mùa, nhiệt độ cao, mưa nhiều độ ẩm tưong đối cao Đây điều kiện thuận lợi cho thảm thực vật phát triển phong phú đa dạng Trong có nhiều thực vật khơng mang lại lợi ích cho hệ sinh thái, mơi trường mà cịn có đặc tính dược lý quý báu sử dụng vói nhiều mục đích khác phục vụ cho đời sống Trong nguồn tài nguyên thực vật Việt Nam, gừng lồi quen thuộc, gia vị phổ biến nhiều ăn giới nói chung Việt Nam nói riêng Hơn gừng biết đến loại thuốc Đơng Y có vai trị việc giảm bệnh tim mạch đái tháo đường có liên quan lớn đến khả kiểm sốt khối lượng thể, giảm lượng glucose lipid huyết Sự tồn chất oxi hóa có gốc tự sản sinh q trình sinh hóa gây rối loạn nhiễm khuẩn vi sinh vật thể người dẫn đến bệnh nghiêm trọng Để xử lý ức chế vấn đề thực phẩm chức đầu tư quan tâm, đặt biệt nguyên liệu có nguồn gốc tự nhiên Có nhiều nghiên cứu chứng minh chất thơm hợp chất thiên nhiên có nhiều tính chất quý khả chống oxi hóa, kháng khuẩn, kháng ung thư, đặc biệt hợp chất có tinh dầu gừng Tuy nhiên, trồng điều kiện thổ nhưỡng khác hàm lượng tinh dầu đặt tính sinh học tinh dầu gừng có thay đổi Các nghiên cứu tinh dầu gừng Việt Nam nhiều cơng trình cơng bố thay đổi hoạt tính sinh học tinh dầu gừng điều kiện thổ nhưỡng khác cịn Hiện có nhiều cơng trình nghiên cứu thành phần hóa học gừng nói chung tinh dầu gừng nước, gần có cơng trình nghiên cứu số loài thuộc họ Zingiberaceae khu vực Bắc Trung Bộ vê thành phần hóa học hoạt tính chưa có cơng trình nghiên cứu thành phần hoạt tính tỉnh miền Nam, tơi chọn cơng trình Mục tiêu 2.1 Mục tiêu tổng quát Xác định thành phần hóa học số hoạt tính tinh dầu từ củ gừng số tỉnh miền Nam 2.2 Mục tiêu cụ thễ - Thu mẫu gừng (củ) số tỉnh miền Nam - Chiết xuất tinh dầu từ mẫu thu thập - Khảo sát thành phần tinh dầu bang GC-MS - Khảo sát hoạt tính chống oxi hóa kháng khuẩn mẫu tinh dầu - Khảo sát khả trị bỏng chuột tinh dầu gừng Phưong pháp nghiên cứu Mau gừng thu hái 13 tỉnh miền Nam, Việt Nam gồm An Giang, Bạc Liêu, Cà Mau, Cần Thơ, Đồng Tháp, Hậu Giang, Kiên Giang, Long An, Sóc Trăng, Tiền Giang, Trà Vinh, Ben Tre, Vĩnh Long Phương pháp chiết tinh dầu: chưng cất lôi nước Phương pháp xác định thành phần tinh dầu gừng: Để xác định hợp chất dễ bay từ mẫu nghiên cứu sử dụng phương pháp GC (HP7890A (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) kết nối với hệ thống khối phổ MS (HP5975C, USA) Cột phân tích sử dụng HP5MS (30 m X 0,25 mm X 0,25 pm), khí mang Helium (99,99%) có tốc độ dịng mL/phút Thể tích tiêm mẫu pL), tỷ lệ chia dòng 100:1 Nhiệt độ kim phun nguồn ion đặt 250 230 °C Chương trình nhiệt độ lị đặt 60 °C (đẳng nhiệt phút) tăng lên đến 240 °C với tốc độ tăng °c/phút, sau tăng lên 280 độ vịng 10 phút Dữ liệu MS mức 70 eV, khoảng thời gian quét 0,5 giây Các hợp chất xác định thông qua so sánh với liệu hợp chất Thư viện khối phổ (NIST 17.L Wiley) Đối với phân tích GC-FID, chương trình vận hành triển khai với điều kiện chạy tương tự chương trình vận hành GC-MS Phương pháp kháng khuẩn: chủng vi khuẩn gây bệnh Escherichia coỉi (ATCC 11229), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 15442), Staphylococcus aureus (ATCC 23235), Staphylococcus epidermidis (ATCC 12228), Streptococcus pyogenes (ATCC 19615) Tất chủng vi khuẩn bảo quản Phịng thí nghiệm Công nghệ sinh học Khu công nghệ cao Sài Gịn, Thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam Phương pháp khuếch tán giếng thạch sử dụng để xác định hoạt tính kháng khuẩn mơi trường dinh dưỡng Muller Hinton Agar [17] Mỗi đĩa thạch cấy 100 pL 105 CFƯ/mL huyền phù vi khuẩn; giếng có đường kính mm sau cắt thành đĩa thạch ống kim loại vô trùng Tinh dầu gừng hòa tan Dimethyl sulfoxide (DMSO) nồng độ khác gồm 1, 10, 50, 100%, sau cho vào giếng với lượng 100 pL Penicillin sử dụng làm đối chứng dương tính cholermidis s Aureus, ampicillin gentamicin sử dụng làm đối chứng dương tính p aeruginosa E coli Tất dĩa sau giữ 37°c 18-24 DMSO sử dụng làm đối chứng âm cho tất xét nghiệm Sau đó, dĩa ủ 37°c 18-24 Phương pháp chống oxi hóa: Hiệu ứng bắt gốc phân đoạn peptit hoạt tính sinh học gốc 2,2-di-phenyl-l-picrylhydrazyl (DPPH) thực dựa theo phưong pháp Qian, Pan, Cai & Jing (2017) với vài hiệu chỉnh nhỏ ImL tinh dầu tỉnh pha loãng methanol theo dãy nồng độ (0, 0.4, 0.8, đến 4.8 (10‘2 mL/mL)) trộn với mL DPPH 0.076M hòa tan methanol ủ 30 phút nhiệt độ phòng Độ hấp phụ dung dịch tạo thành đo bước sóng 517 nm Khả thu gom gốc tự tinh dầu thử nghiệm voeis thử nghiệm 2,2’- azinobis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) theo quy trình Rufino cộng [41] với số sửa đổi Dung dịch ABTS gốc chuẩn bị cách pha trộn 7.4 mmol/L ABTS 2.6 mmol/L kali persulfate Sau đó, lOOpl tinh dầu tỉnh dược pha loãng theo dãy nồng độ (0, 1, đến 12 (10-2 mL/mL)) methanol trộn với 1900 111 dung dịch ABTS gốc, độ hấp phụ hổn hợp thu sau phút bước sóng 737 nm máy đo quang phổ ƯV/ VIs Mơ hình trị bỏng chuột Chuột gây tổn thưong bỏng da dựa theo mơ hình gây bỏng nhiệt nước theo mơ tả Vlad Porumb cộng [12] kết hợp với mơ hình Durmus AS cộng [8] Các bước khảo sát tiến hành sau: + Chuột chia ngẫu nhiên thành ba lô nhau, lô chứa 06 chuột dán nhãn Nhóm 1, Nhóm Nhóm + Gây mê, sau cạo lơng vùng lưng chuột Đặt vng góc thiết bị tạo nước nóng với vùng da tiếp xúc + Nhóm tiếp xúc với nước nóng giây, nhóm tiếp xúc ba giây nhóm tiếp xúc bảy giây + Quan sát ghi nhận trạng thái chung biến đổi da sau gây bỏng chuột thời điểm 20 phút, 28 72 Tổng kết két nghiên cứu 4.1 Thành phần hóa học tinh dầu gùng thuộc 13 tỉnh miền Nam Tinh dầu gừng phát có chứa terpenoid, bao gồm có mặt mono- sesquiterpenes Trong số monoterpen, 30 hợp chất khác xác định, đó, thành phần gồm a-pinene (từ đến 6,71%), camphene (7,06 đến 25,41%), p-myrcene (0 đến 2,32%) eucalyptol (8,27 đến 33,16%) Tinh dầu cịn chứa sesquiterpene a-curcumene, (-)-zingiberene, p-bisabolene sesquiphellandrene, hợp chất thường tìm thấy tinh dầu gừng nghệ Điều đáng ý thành phần hàm lượng tinh dầu gừng có khác tỉnh thành Ví dụ, tinh dầu gừng Tiền Giang, Bạc Liêu, Sóc Trăng, An Giang, Long An có khoảng 20-30 hợp chất, tinh dầu gừng Hậu Giang, cần Thơ, Đồng Tháp, Trà Vinh, Ben Tre có 30-45 hợp chất hóa học, cho thấy thành phần chúng có độ phức tạp cao Đặc biệt, tinh dầu Vĩnh Long phát có hợp chất gồm axit 9-octadecenoic, metyl este (42,15%), camphene (9,35%), eucalyptol (17,57%) số hợp chất khác Sự khác biệt thành phần hóa học tinh dầu gừng điều kiện khí hậu nguồn gốc địa lý gừng [18] Bảng Thành phần hàm lượng tinh dầu gừng thu hái 13 tỉnh miền Nam % Diện tích pic Thời gian lưu Hợp chất An Bạc Ben Cà Cần Đồng Hậu Kiên Long Sóc Tiền Trà Vĩnh Giang Liêu Tre Mau Thơ Tháp Giang Giang An Trăng Giang Vinh Long 2,75 1,49 3,84 4,35 4,08 5,17 3,55 11,88 7,06 10,58 17,37 14,2 22,33 12,24 9,35 - 1,11 - 1,28 - 2,05 1,86 4,193 a - Pinene 4,71 3,8 6,71 2,27 4,499 Camphene 15,85 11,62 25,41 8,32 5,474 P- Myrcene - 2,32 2,04 1,35 6,45 Eucalyptol 16,16 18,53 25,69 18,68 11, 79 8,27 13,78 23,9 23,62 15,11 33,16 12,77 17,57 10,163 endo-Bomeol 1,92 - 1,89 - - - 0,33 - 3,45 - 4,46 - - 12,322 Carveol 12,61 0,42 - 17,95 - 5,09 - - - - - - - 12,331 1,3,8-p-Menthatriene - 15,91 - - - 3,36 - - 7,95 9,16 - - - 2,13 2,94 - - - - - - 15,68 - - - - 1,96 - 8,25 27,9 - 13,64 1,79 - - 7,15 - - - - 15,23 - - 0,35 10,21 - 3,74 7,77 3,45 1,94 2,81 2,04 6,58 - 12,771 13,156 1,3,7-Octatriene, 3,7- dimethyl- 2,6-Octadienal, 3,7- dimethyl-, (E) 13,166 Citral 17,8 24,13 - 3,08 18,807 a - Curcumene 1,65 1,62 1,96 2,12 9,6 1,8 10, 49 - 7,9 11 19.124 (-)-Zingiberene - - 6.22 - 19.147 a - Bergamotene 6.72 - 0.28 - 19.483 p - Bisabolene 2.63 - 2.2 2.15 19.861 Sesquiphellandrene 2.39 - 2.53 2.34 - 8.77 8.65 - - 5.35 14.3 - 13.4 - - 8.08 - - - - 4.66 5.99 4.13 2.37 - 1.97 0.53 - - 5.73 3.35 3.2 - - 6.65 - 87 - 6.5 6.3 4.2 Hoạt tính kháng khuẩn tinh dầu gùng 4.2.1 Khả kháng khuẩn Có chủng vi khuẩn gây bệnh Escherichia coỉi (ATCC 11229), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 15442), Staphylococcus aureus (ATCC 23235), Staphylococcus epidermidis (ATCC 12228), Streptococcus pyogenes (ATCC 19615) tiến hành thử với số tinh dầu gừng số tỉnh miền Nam Kết cho thấy, tinh dầu kháng vi sinh vật tương đối giống nhau, trừ trường hợp tinh dầu kháng yếu mạnh như: thí nghiệm kháng Staphylococcus aureus tinh dầu Ben Tre kháng mạnh tinh dầu Ben Tre kháng chủng nồng độ 1% với đường kính 24,67±l,25mm đường kính vòng kháng khuẩn tinh dầu yếu Kiên Giang 19,3 ±2,05mm nồng độ 100% Tất tinh dầu tỉnh thí nghiệm, tinh dầu có khả kháng vi sinh vật cao tinh dầu tỉnh Ben Tre Tinh dầu gừng tỉnh Ben Tre kháng vi khuẩn Gram âm nồng độ thấp 1% mà tinh dầu tỉnh khác không kháng đặc biệt Staphylococcus epidermidis Staphylococcus aureus Ngoài ra, tinh dầu gừng thuộc số tỉnh miền Nam khả kháng Escherichia coll chủng Pseudomonas aeruginosa Bảng Tổng hợp số liệu khả kháng khuẩn mẫu tinh dầu gừng thuộc số tỉnh miền Nam Nồng độ tinh dầu (%) Vi khuẩn Staphylococcus Khu vực (Tỉnh) 100 50 10 Bến Tre 53,33±2,87 43,33±2,36 38,00+0,81 24,67+1,25 Tiền Giang 24,67±1,25 27,00±3,56 18,67±1,25 - Cần Thơ Quá lớn 25,00±2,49 11,33±1,25 - aureus Staphylococcus Long An 35,33±1,25 21,67±1,25 14,67±0,47 - Cà Mau 40,67±0,94 25,67±0,94 22,00±2,83 - Kiên Giang 19,3 +2,05 16,67±0,94 14,67±l,70 - Đồng Tháp 24,67±3,30 24,33±0,94 20,33±0,74 - Bạc Liêu 34,00+0,82 21,67±1,25 ll,33±0,47 - Trà Vinh 51,33±1,25 32,67±2,49 25,33±l,70 - Bến Tre 47,00±2,87 43,00+2,36 25,00+0,82 15,00+1,25 Tiền Giang 47,33±1,25 36,67±0,94 20,00+0,82 - Cần Thơ 51,00±l,41 41,33±0,47 19,00+1,25 - Long An 35,67±0,47 25,00+1,63 15,67±1,25 - Cà Mau 54,00±0,47 42,00±l,63 27,00±l,25 - Kiên Giang 30,67±0,94 22,67±1,88 16,00+0,81 - Đồng Tháp 22,00±l,41 20,33±0,47 16,33±1,25 - Bạc Liêu 32,67±1,89 25,00+1,63 18,33+1,25 - Trà Vinh 37,00±0,47 33,00±l,41 25,00+0,82 - Bến Tre Quá lớn 55,50±l,50 51,00±2,16 37,67+1,70 Tiền Giang Quá lớn Quá lớn 30,33 13,67 Cần Thơ 46,00±0,82 37,33±2,05 20,33±l,25 - Long An Quá lớn Quá lớn 31,00±l,41 11,33+1,89 Cà Mau Quá lớn Quá lớn 46,33±l,70 19,00+0,82 Kiên Giang 33,00±2,45 33,33+1,88 23,33±0,94 - Đồng Tháp Quá lớn Quá lớn 47,67±2,05 26,67+0,94 epidermidis Streptococcus pyogenes Bạc Liêu 41,00±l,41 35,33±0,94 26,67±1,25 - Trà Vinh 54,67±1,25 43,00+0,82 34,33±0,94 12,33+1,70 4.2.2 Chỉ số MIC MIC tinh dầu xác định nồng độ tinh dầu thấp ức chế vi khuẩn, ta thu kết sau: Trong thí nghiệm với s aureus, tinh dầu có giá trị MIC thấp Ben Tre với nồng độ 0,52±0,15%, tinh dầu cao Kiên Giang Bạc Liêu với nồng độ 6,67±2,36%, 6,67±2,36% Đối vói s epidermidis, tinh dầu cho giá trị MIC thấp Ben Tre với nồng độ 0,52±0,15%, tinh dầu cho giá trị cao Đồng Tháp Bạc Liêu với nồng độ 4,17±1,18% Đối với s pyogenes, Ben Tre tỉnh cho giá trị MIC thấp 0,52±0,15%, tinh dầu cho giá trị cao Kiêng Giang Bạc Liêu vói nồng độ 4,17±1,18% Từ kết cho thấy giá trị MIC tinh dầu không chênh lệch lớn tinh dầu tỉnh Ben Tre có giá trị MIC thấp chủng vi sinh vật thí nghiệm 4.3 Hoạt tính chống oxi hóa 4.3.1 DPPH Ở nhóm thể tốt hoạt tính chống oxi hóa cịn có tinh dầu thuộc tỉnh cần Thơ Cà Mau với thể độ dốc biến đổi OD hình giá trị IC50 thấp (0.1953 0.1578 tương ứng (10'2 mL/mL)) Tinh dầu tỉnh Bạc Liêu tỉnh có giá trị OD giảm thấp nhất, độ dốc biểu đồ nông so với tinh dầu tỉnh cịn lại có giá trị IC50 cao với 1.9613 (10’2 mL/mL) Từ số liệu thể ta chia khả bắt gốc tự tinh dầu gừng thuộc tỉnh làm ba nhóm: Nhóm bắt gốc tự tốt (Ben Tre, cần Thơ, Cà Mau) nhóm bắt gốc tự trung bình (Long An, Kiên Giang, Đồng Tháp, Trà Vinh) nhóm bắt gốc tự yếu (Tiền Giang Bạc Liêu) Bảng Khả kháng oxi hóa tinh dầu gừng thuộc số tỉnh miền Nam Tỉnh IC50 Bến Tiền Cần Long Cà Kiên Đồng Bạc Trà Tre Giang Thơ An Mau Giang Tháp Liêu Vinh 0,1114 1,783 0.1953 0.9097 0.1578 0.9244 0.941 1.9613 0.4372 (10‘2 mL/mL)