Trang 1 LƯƠNG THỊ PHƯƠNG LAN ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CAN THIỆP CỘNG ĐỒNG PHÒNG, CHỐNG NHIỄM SÁN LÁ GAN NHỎ CỦA NGƯỜI DÂN TẠI THỊ TRẤN RẠNG ĐÔNG, HUYỆN NGHĨA HƯNG, TỈNH NAM ĐỊNH NĂM 2009 - 201
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG ng LƯƠNG THỊ PHƯƠNG LAN đồ ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CAN THIỆP CỘNG ĐỒNG ng PHÒNG, CHỐNG NHIỄM SÁN LÁ GAN NHỎ CỦA NGƯỜI cộ DÂN TẠI THỊ TRẤN RẠNG ĐÔNG, HUYỆN NGHĨA HƯNG, án Y tế TỈNH NAM ĐỊNH NĂM 2009 - 2012 Lu ậ n LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y TẾ CÔNG CỘNG HÀ NỘI – 2016 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG đồ ng LƯƠNG THỊ PHƯƠNG LAN ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CAN THIỆP CỘNG ĐỒNG ng PHÒNG, CHỐNG NHIỄM SÁN LÁ GAN NHỎ CỦA NGƯỜI cộ DÂN TẠI THỊ TRẤN RẠNG ĐÔNG, HUYỆN NGHĨA HƯNG, án Y tế TỈNH NAM ĐỊNH NĂM 2009 - 2012 Chuyên ngành: Y tế công cộng Lu ậ n Mã số: 62.72.03.01 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS.TS Nguyễn Văn Đề PGS.TS Trần Hữu Bích HÀ NỘI – 2016 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu thực Các số liệu, kết luận án trung thực chưa công bố cơng trình khác ng Tác giả Lu ậ n án Y tế cộ ng đồ Lương Thị Phương Lan ii LỜI CẢM ƠN Hoàn thành luận văn Tiến sĩ Y tế công cộng này, nhận nhiều giúp đỡ từ thầy giáo, gia đình, bạn bè đồng nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu, thầy giáo khoa, phịng liên quan Trường Đại học Y tế Công cộng Đại học Y Hà Nội truyền thụ kiến thức, tạo điều kiện thuận lợi, chia sẻ kinh nghiệm cho suốt trình học tập thực luận văn Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành sâu sắc tới GS TS Nguyễn Văn ng Đề PGS.TS Trần Hữu Bích người thầy tâm huyết tận tình hướng dẫn, đồ động viên, dành nhiều thời gian trao đổi định hướng cho trình thực luận án ng Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ủy ban nhân dân thị trấn Rạng Đông, cộ huyện Nghĩa Hưng, tỉnh Nam Định; Trạm Y tế thị trấn Rạng Đông; Các cán y tế tế thị trấn Rạng Đông; Các cộng tác viên y tế thôn bản; người dân thị trấn Rạng Y Đông, huyện Nghĩa Hưng, tỉnh Nam Định; Trung tâm y tế dự phòng huyện Nghĩa án Hưng, tỉnh Nam Định; Chi Cục An toàn vệ sinh thực phẩm tỉnh Nam Định giúp đỡ tạo điều kiện cho tiến hành nghiên cứu Lu ậ n Tôi xin gửi lời cảm ơn đến lãnh đạo Bộ Y tế, lãnh đạo Cục An tồn thực phẩm nơi tơi công tác; bạn đồng nghiệp tạo điều kiện giúp đỡ tơi q trình thực luận án Cuối cùng, tơi xin dành tình u thương, lịng thành kính biết ơn bố mẹ, chồng, người gia đình Xin cảm ơn bạn bè chia sẻ, động viên tơi suốt q trình học tập iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT C.sinensis CSHQ Chỉ số hiệu EPG (Eggs per gram): Số trứng trung bình gam phân Opisthorchis viverrini O viverrini PCR (Polymerase Chain Reaction): Kỹ thuật nhân ADN đặc hiệu Tỉ lệ khỏi bệnh TLKB THPT Trung học phổ thông THCS Trung học sở TNCSHCM Thanh niên cộng sản Hồ Chí Minh TTGDSK Truyền thơng giáo dục sức khoẻ ng đồ ng Clonorchis sinensis Sán gan nhỏ cộ SLGN Lu ậ n án Y tế WHO (World Health Organization): Tổ chức Y tế giới iv MỤC LỤC Trang MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Lịch sử bệnh sán gan nhỏ 1.2 Đặc điểm ký sinh trùng học sán gan nhỏ 1.3 Chẩn đoán, điều trị dự phòng bệnh sán gan nhỏ 1.4 Các nghiên cứu tỉ lệ nhiễm sán gan nhỏ người 11 1.5 Các nghiên cứu tỉ lệ nhiễm ấu trùng sán gan nhỏ cá nước 15 1.6 Các nghiên cứu yếu tố liên quan đến nhiễm sán gan nhỏ 17 1.7 Các nghiên cứu biện pháp phòng, chống sán gan nhỏ 24 1.8 Khung lý thuyết nghiên cứu 35 ng đồ ng ĐẶT VẤN ĐỀ 38 2.1 Đối tương nghiên cứu 38 tế cộ Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38 2.3 Thiết kế nghiên cứu 38 án Y 2.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu n 2.4 Cỡ mẫu phương pháp chọn mẫu 39 42 2.6 Các khái niệm, thước đo tiêu chuẩn đánh giá 48 2.7 Các hoạt động can thiệp nhằm giảm nguy nhiễm sán gan nhỏ 50 2.8 Vật liệu kỹ thuật nghiên cứu 54 2.9 Phương pháp thu thập số liệu 54 2.10 Qui trình thu thập số liệu 55 2.11 Quản lý, phân tích sử dụng số liệu 57 2.12 Đạo đức nghiên cứu 59 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 60 3.1 Tỉ lệ nhiễm loài sán gan nhỏ người cá nước nuôi thị 60 Lu ậ 2.5 Các biến số số nghiên cứu trấn Rạng Đông, huyện Nghĩa Hưng, tỉnh Nam Định trước can thiệp v 3.2 Thực trạng kiến thức, thái độ, thực hành phòng, chống nhiễm sán gan 70 nhỏ số yếu tố liên quan đến nhiễm sán gan nhỏ người dân thị trấn Rạng Đông, huyện Nghĩa Hưng, tỉnh Nam Định 3.3 Hiệu can thiệp cộng đồng phòng, chống SLGN người dân thị 86 trấn Rạng Đông, huyện Nghĩa Hưng, tỉnh Nam Định sau năm can thiệp Chương 4: BÀN LUẬN 97 4.1 Tỉ lệ nhiễm loài sán gan nhỏ người cá nước nuôi thị 97 trấn Rạng Đông, huyện Nghĩa Hưng, tỉnh Nam Định 4.2 Thực trạng kiến thức, thái độ, thực hành phòng, chống nhiễm sán gan 108 ng nhỏ số yếu tố liên quan đến nhiễm sán gan nhỏ người dân đồ thị trấn Rạng Đông, huyện Nghĩa Hưng, tỉnh Nam Định 4.3 Hiệu can thiệp cộng đồng phòng, chống SLGN người dân thị 114 ng trấn Rạng Đông, huyện Nghĩa Hưng, tỉnh Nam Định sau năm can thiệp 131 KẾT LUẬN 136 tế cộ 4.4 Ưu điểm, hạn chế hoc kinh nghiệm nghiên cứu Y KHUYẾN NGHỊ 138 án DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ ĐƯỢC CƠNG BỐ CỦA TÁC n GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI LUẬN ÁN PHỤ LỤC Lu ậ TÀI LIỆU THAM KHẢO Phụ lục 1: Bộ phiếu vấn Phụ lục Phương pháp đánh giá kiến thức, thái độ, thực hành Phụ lục Phương pháp xét nghiệm Kato– Katz Phụ lục Định loại sán gan nhỏ người ấu trùng nang Phụ lục Vật liệu kỹ thuật phân loại ấu trùng sán cá nước Phụ lục 6: Tài liệu truyền thông dùng can thiệp cộng đồng Phụ lục 7: Biểu đồ grantt hoạt động can thiệp truyền thông giáo dục sức khoẻ hàng năm vi DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Chiến lược dự phịng kiểm sốt bệnh sán gan nhỏ 24 Bảng 1.2 Các nghiên cứu phác đồ thuốc điều trị sán gan nhỏ 28 Bảng 2.1 Các biến số số nghiên cứu 42 Bảng 2.2 Hướng dẫn phân loại cường độ nhiễm sán gan nhỏ theo WHO 49 Bảng 3.1 Tỉ lệ nhiễm sán gan nhỏ theo tuổi, giới, nghề nghiệp học vấn 61 Bảng 3.2 Phân loại cường độ nhiễm sán gan nhỏ (n = 63) 62 Bảng 3.3 Kích thước hình thái nội quan sán gan nhỏ C sinensis 64 (n=20) ng Bảng 3.4 Danh mục mẫu sán gan nhỏ trưởng thành thu nhận người 65 đồ thị trấn Rạng Đông, huyện Nghĩa Hưng, tỉnh Nam Định sử dụng giám định phân tử ng Bảng 3.5 So sánh nucleotid điểm có sai khác chuỗi gen cox1 67 cộ Clonorchis spp nghiên cứu với C sinensis chủng Trung Quốc Hàn tế Quốc án nghề nghiệp Y Bảng 3.6 Tỉ lệ người dân có biết bệnh sán gan nhỏ theo giới, học vấn n Bảng 3.7 Tỉ lệ hiểu biết phòng,chống sán gan nhỏ người dân 71 73 75 Bảng 3.9 Thực hành ăn gỏi cá sử dụng chung dụng cụ chế biến thức ăn 77 Lu ậ Bảng 3.8 Thái độ người dân với việc phòng, chống bệnh sán gan nhỏ sống thức ăn chín theo nhóm tuổi, giới, nghề nghiệp, trình độ học vấn Bảng 3.10 Tỉ lệ sử dụng phân tươi người gia súc để bón ruộng, 78 ni cá Bảng 3.11 Thực hành người dân nghi ngờ bị bệnh sán gan nhỏ 79 Bảng 3.12 Mối liên quan kiến thức, thái độ, thực hành phòng, chống 80 sán gan nhỏ với giới tính, trình độ học vấn, nghề nghiệp đối tượng nghiên cứu Bảng 3.13 Mối liên quan kiến thức thực hành phòng, chống sán gan nhỏ 83 vii Bảng 3.14 Mối liên quan yếu tố cá nhân, kiến thức, thái độ phịng, 84 chống sán gan nhỏ tình trạng nhiễm sán gan nhỏ người dân Bảng 3.15 Phân tích mối liên quan hành vi nguy nhiễm SLGN với 85 tình trạng nhiễm sán gan nhỏ Bảng 3.16 Kết đào tạo nhân lực cho cơng tác phịng, chống sán gan 87 nhỏ Bảng 3.17 Hoạt động can thiệp thông qua kênh truyền thông trực tiếp 88 thị trấn Rạng Đông, huyện Nghĩa Hưng, tỉnh Nam Định Bảng 3.18 Hoạt động can thiệp thông qua kênh truyền thông gián tiếp ng thị trấn Rạng Đông, tỉnh Nam Định đồ Bảng 3.19 Hiểu biết người dân phòng, chống SLGN trước sau can thiệp ng Bảng 3.20 Thái độ người dân phòng, chống SLGN trước sau can cộ thiệp tế Bảng 3.21 Thực hành người dân số biện pháp nhằm phòng, 90 91 92 94 Y chống sán gan nhỏ trước sau can thiệp 95 Bảng 3.23 Tỉ lệ giảm trứng sán gan nhỏ sau điều trị thuốc praziquantel 95 n án Bảng 3.22 Tỉ lệ trứng sán gan nhỏ sau điều trị thuốc praziquantel 96 Bảng 3.25 Tỉ lệ nhiễm sán gan nhỏ sau 24 tháng can thiệp 96 Lu ậ Bảng 3.24 Tỉ lệ tái nhiễm sán gan nhỏ năm can thiệp viii DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1 Tỉ lệ nhiễm SLGN người từ 01 tuổi trở lên (n =400) 60 Biểu đồ 3.2 Tỉ lệ nhiễm ấu trùng sán gan nhỏ loài cá nước 62 Biểu đồ 3.3 Tỉ lệ người dân có nghe nói sán gan nhỏ (n =340) 70 Biểu đồ 3.4 Tỉ lệ người dân có biết bệnh sán gan nhỏ theo nhóm tuổi 71 Biểu đồ 3.5 Tỉ lệ người dân biết tác hại bệnh SLGN 72 Biểu đồ 3.6 Hiểu biết tái nhiễm bệnh SLGN 72 Biểu đồ 3.7 Phương tiện truyền thông SLGN nhỏ đến người dân trước 74 can thiệp ng Biểu đồ 3.8 Tỉ lệ người dân có đưa lời khun người khác khơng nên ăn đồ gỏi cá, cá nấu chưa chín Biểu đồ 3.9 Thực hành người dân trước can thiệp nghi ngờ bị bệnh ng sán gan nhỏ theo nhóm tuổi Lu ậ n tế án Y trước sau can thiệp cộ Biểu đồ 3.10 Thực hành người dân nghi ngờ nhiễm sán gan nhỏ 76 79 93 170 Phụ lục PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ KIẾN THỨC, THÁI ĐỘ, THỰC HÀNH PHÒNG, CHỐNG NHIỄM SÁN LÁ GAN NHỎ Nhóm biến Phương pháp đánh giá Đạt Khơng đạt Các tình trả Tình 1-3 lời khác Câu hỏi KT7 Hiểu biết KT8, đường truyền bệnh Tình KT9, KT10, KT14 Tình n Tình 1-4 Tình Tình 4-5 Trả lời tình 1-2 Tình Tình Tình Tình Tình khác Tình khác Tình khác Các tình trả lời khác Tình Tình Tình Tình Các tình trả lời khác đồ ng án Y TH23, TH24 Lu ậ Tình 0, cộ tế Thực hành đạt TD20 TH21 TH25 TH28 Các tình khác Tình ng Hiểu biết KT11 phòng chống KT12, KT15 TD17 TD18 Thái độ TD19 Các tình trả lời khác Tình 171 Phụ lục 3: PHƯƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM KATO - KATZ - Bộ xét nghiệm Kato - Katz gồm: + Lưới lọc phân kim loại mềm chất dẻo + Khuôn nhựa bìa cát tơng kích thước 30x40x1,47mm có lỗ trịn đường kính 6mm để đong phân Lương phân tương đương 41,6mg + Dung dịch xanh malachit 3% + Giấy cellophane với kích thước 26x28mm ngâm dung dịch sau 24 trước sử dụng: Nước cất 100ml ng + Que nhựa để gạt phân đồ Dung dịch xanh malachit 3% 1ml ng Glycerin 100ml cộ - Kỹ thuật tiến hành: tế + Mẫu phân đặt giấy thấm, dùng lưới lọc đặt lên mẫu phân Dùng que ấn lên lưới lọc để phân lọt lên lưới án Y + Lấy phân mặt lưới lọc cho vào lỗ tròn khuôn nhựa đặt sẵn lên lam Lu ậ n kính Khi phân đầy phẳng miệng lỗ ta nhấc khuôn nhựa lên để lại số phân đong lam kính - Phủ mảnh giấy cellophane (đã ngâm sẵn) lên mặt phân + Dùng nút cao su ấn nhẹ lên mặt giấy cellophane cho phân dàn mỏng tận mép mảnh giấy cellophane + Để tiêu nhiệt độ phòng từ 15 đến 30 phút sau đem soi kính hiển vi + Đếm tồn số trứng giun có mẫu phân tiêu Sau lấy số trứng giun đếm nhân với 24 tổng số trứng giun có gam phân 172 Phụ lục 4: ĐỊNH LOẠI SÁN LÁ GAN NHỎ Ở NGƯỜI VÀ ẤU TRÙNG NANG (METACERCARIA) THU THẬP ĐƯỢC Ở CÁ BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ (PCR) (1) ĐỊNH LOẠI SÁN LÁ GAN NHỎ Ở NGƯỜI Đối tượng: Các mẫu SLGN thu thập bệnh nhân nhiễm sán qua điều trị praziquantel chương trình can thiệp thị trấn Rạng Đông, huyện Nghĩa Hưng, tỉnh Nam Định Phương pháp sinh học phân tử (PCR) định loài SLGN người - Tách chiết ADN tổng số: ADN tổng số tách chiết hoá chất Genomic-Tip Kit ng ADNeasy (QIAGEN Inc.) theo qui trình nhà sản xuất Mô tả rút gọn sau: đồ mẫu vật bảo quản cồn 70% lấy cho cồn bay hết ly tâm ng chân khơng, sau rửa nhiều lần PBS Mẫu vật nghiền kỹ xử lý với cộ dung môi Kit, hấp phụ lên màng ly chiết ADN theo qui trình tách chiết Hàm lượng ADN sử dụng khoảng 100-150 nanogram cho phản ứng tế PCR có dung lượng 50 microlit án Y - Chọn mồi cho phản ứng PCR Gen cox1 (cytochrome oxidase 1) gen ty thể chọn làm đích nghiên Lu ậ n cứu Cặp mồi (primer) dùng nhân ADN đích phản ứng PCR chọn sở trình tự bảo tồn gen có Ngân hàng Gen tài liệu xuất - Quy trình phản ứng PCR ADN đích nhân PCR tiêu chuẩn với hố chất PCR Master Mix Kit (Promega) Chu trình nhiệt PCR máy Perkin-Elmer (Perkin-Elmer Inc., Mỹ) gồm bước sau: 940C/5 phút chu kỳ; 35 chu kỳ 940C/1 phút, 500C/1 phút 720C/1 phút; chu kỳ cuối kéo dài 10 phút 720C Sản phẩm PCR tinh chế hoá chất QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN Inc.) dịng hố vào vector có tên gọi pCR2.1 pCR 2.1 (TOPO) hoá chất TA-cloning Kit (Invitrogen Inc.) Vector pCR2.1 tiếp nhận sản phẩm PCR chuyển nạp vào dòng tế bào IVNF’ 173 chọn lọc khuẩn lạc theo phương pháp kháng sinh thị màu (SAMBROOK VÀ RUSSELL, 2001) ADN plasmid có chứa PCR tách chiết với hoá chất QIAprep Spin Plasmid Extraction Kit (QIAGEN Inc.) Trình tự nucleotid ADN plasmid chứa sản phẩm PCR tái tổ hợp giải trình máy tự động ABI 3100 (ABI 3100 automated sequencer) hãng Perkin-Elmer (Mỹ) Chuỗi nucleotid xử lý chương trình SeqEd1.3; sau so sánh sử dụng chương trình AsemblyLIGN 1.9 MacVector 6.5.3 (Oxford Molecular Inc.) Thành phần acid amin thu nhận cách sử dụng mã hệ gen ty thể sán dẹt ngân hàng gen thông qua chương trình GENDOC 2.5 Trong phân tích phả hệ, tất chuỗi chủng chọn lọc ng có chủng Việt Nam xếp theo chương trình GENDOC 2.5, đồ sau đưa vào phân tích phả hệ chương trình MEGA 2.1 thành phần ng nucleotid acid amin, sử dụng hệ số tiến hoá thấp ME (minimum evolution index) cộ (Kuma cs, 2001) - Phương pháp xử lý nucleotid/ chuỗi acid amin ứng dụng sinh-tin học tế xử lý kết án Y Giải trình nucleotid sau dịng hoá, từ ADN plasmid tái tổ hợp, thực máy giải trình tự động (ABI 3100 automated sequencer), xử lý Lu ậ n phần mềm cung cấp SeqEd 1.0.3; AssemblyLIGN 1.0.9c nhằm thu nhận chuỗi chung, sau xử lý hệ chương trình MacVector 6.5.3 (Oxford Molecular Group) Giám định chuỗi ADN (gen chẩn đoán) truy nhập Ngân hàng Gen chương trình BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) (ALTSCHUL VÀ CS, 1997) Sự đồng hay nhiều chuỗi) thu nhận qua so sánh đa chuỗi (multiple alignment) chương trình ClustalW bố trí sẵn hệ chương trình MacVector 6.5.3 (Oxford Molecular Group) Tra cứu so sánh sử dụng phần mềm có Trung tâm sinh-tin học quốc tế (NCBI = National Centre for Biotechnology Information/USA có (http://ww.ncbi.nlm.nih.gov) sử dụng số chương trình đặc hiệu có ExPASy (http://expasy.ch) Sự sai khác nucleotid acid amin 5% biến đổi nội loài (Interspecific differences) 5% trở lên biến đổi ngoại loài (Intraspecific differences) 174 (2) ĐỊNH LOÀI ẤU TRÙNG NANG (METACERCARIA) THU THẬP ĐƯỢC Ở CÁ Đối tượng: Mẫu ký sinh trùng sử dụng định loại sinh học phân tử ấu trùng nang (metacercaria) thu thập cá nuôi thị trấn Rạng Đông, huyện Nghĩa Hưng, tỉnh Nam Định Phương pháp sinh học phân tử (PCR): định loại ấu trùng nang (metacercaria) thu thập cá Tách chiết ADN tổng số ADN tổng số tách chiết hoá chất Genomic-Tip Kit (QIAGEN Inc.) theo qui trình nhà sản xuất Mơ tả rút gọn sau: mẫu vật bảo quản ng cồn 70% lấy cho cồn bay hết ly tâm chân khơng, sau rửa đồ nhiều lần PBS Mẫu vật nghiền kỹ xử lý với dung môi Kit, ng hấp phụ lên màng ly chiết ADN theo qui trình tách chiết Hàm lượng ADN sử cộ dụng cho phản ứng PCR (50 microlit) khoảng 150 nanogam Thiết kế tổng hợp mồi PCR tế Gen cox1 (cytochrome oxidase 1) gen ty thể chọn làm đích nghiên án Y cứu Cặp mồi (primer) dùng nhân ADN đích phản ứng PCR (polymerase chain reaction), thiết kế sở trình tự bảo tồn gen Ngân n có Lu ậ cox1 hàng Gen, 5'TTTTTTGGGCATCCTGAGGTTTAT3', bao gồm mồi mồi xuôi: ngược: JB3F: JB4.5R: 5'TAAAGAAAGAACATAATGAAAATG3', Các trình tự tương ứng với đoạn ADN nghiên cứu từ số quần thể thuộc họ Opisthorchiidae giống Paragonimus công bố [4] đăng ký Ngân hàng Gen (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)được sử dụng để so sánh đối chiếu chạy PCR, giải trình tự chọn chuỗi so sánh ADN đích nhân PCR tiêu chuẩn với hoá chất PCR Master Mix Kit (Promega) Chu trình nhiệt PCR máy Perkin-Elmer (Perkin-Elmer Inc., Mỹ) gồm bước sau: 940C - phút chu kỳ; 35 chu kỳ 940C - phút, 500C - phút 720C - phút; chu kỳ cuối kéo dài 10 phút 720C Sản phẩm PCR tinh chế hoá chất QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN Inc.) dịng hố vào vector 175 pCR2.1 hoá chất TA-cloning Kit (Invitrogen Inc.) Vector pCR2.1 tiếp nhận sản phẩm PCR chuyển nạp vào dòng tế bào IVN F’ chọn lọc khuẩn lạc theo phương pháp kháng sinh thị màu (SAMBROOK RUSSELL, 2001) ADN plasmid có chứa PCR tách chiết với hoá chất QIAprep Spin Plasmid Extraction Kit (QIAGEN Inc.) Chuỗi ADN giải trình tự máy giải trình tự động ABI 377 PRISM (Perkin- Elmer) thực với số lượng nhiều plasmid tái tổ hợp nhằm thu kết xác Sắp xếp, đối chiếu trình tự tương ứng đoạn gen hệ chương trình máy tính AsemblyLIGN 1.9 MacVector 6.5.3 (Oxford Molecular Inc.) Trình tự axit amin dịch mã theo bảng mã di truyền ng mt-DNA số 21 sán dẹt (platyhelminth mtDNA genetic code) giới thiệu Ngân hàng Gen Lu ậ n án Y ng tế cộ Trung Quốc Triều Tiên đồ Các chuỗi cox1 Clonorchis sp Việt Nam so sánh với loài 176 Phụ lục VẬT LIỆU VÀ KỸ THUẬT PHÂN LOẠI ẤU TRÙNG SÁN LÁ TRONG CÁ NGỌT Quan sát ấu trùng sán (metacercaria) - Để phân loại metacercaria dựa vào đặc điểm hình thái thu riêng ấu trùng có hình dạng tương tự vào đĩa petri nhỏ - Chuyển metacercaria sang lam kính, nhỏ giọt glycerine + lactic acid (1:1), đậy lam men quan sát hình thái chi tiết kính hiển vi có độ phóng đại lớn (10x40 trở lên) - Phân loại metacercaria dựa vào đặc điểm hình dạng kích thước đồ + Dạng ấu trùng ấu trùng; ng Những dấu hiệu phân loại quan trọng là: + Các giác bám, kích thước giác kích cỡ ấu trùng; ng + Hình dạng kiểu tuyến tiết; cộ + Cơ quan sinh sản tế Phá nang metacercaria Y - Ép học: Đôi ép nhẹ nang metacercaria lam men với nước án nước muối sinh lý làm vỡ ngan metacercaria Một kỹ thuật n khác mà làm làm vỡ nang với đầu kim nhỏ thao tác kính hiển vi Lu ậ - Tiêu nang dung dịch dày: Phương pháp Li ctv (2004): + Chuẩn bị dung dịch dày sau: Trong dung dịch nước muối đệm phosphate pH 8,0 thêm: Trypsin 10 milligrams/100ml; Muối mật 10 milligrams/100ml; Để dung dịch dày nhiệt độ phòng 30 phút, hút metacercaria cho vào dịch đặt tủ ấm 5% CO2 37oC Metacercaria phá nang vịng 10 đến 90 phút Quy trình cố định nhuộm Cố định Metacercaria: 177 a) Để nghiên cứu hình thái học nên cố định formalin 5% nóng (hơ formalin gần sơi bỏ ngồi, dùng pipet hút metacercaria với nước nước muối sinh lý (càng tốt) cho trực tiếp vào formalin dung dịch nóng Nếu nên thao tác buồng hút phịng có thơng gió hoạc bên ngồi (Formalin 5%: phần formaldehyde 95 phần nước) b) Để nghiên cứu phân tử DNA, cố định dung dịch cồn 70oC Cố định sán trưởng thành metacercaria thoát khỏi nang - Làm phẳng nhẹ lamen trước cho vào dung dịch cố định formaline nóng 5% Sau đặt trùng lên lam kính, đậy lamen rút nước vừa phải bên ng lamen cách đặt miếng giấy giấy thấm vào mép lamen, nước tự động đồ rút ngấm qua giấy Không ép mạnh Dùng pipet lấy formalin nóng 5% ng nhỏ vào bên mép lamen bên có trùng, formalin nhanh chóng chảy cộ lamen cố định trùng Cẩn thận nhấc lamen lên rửa trùng pipet Lu ậ n án Y tế dung dịch cố định formalin 178 Lu ậ n án Y tế cộ ng đồ ng Phụ lục TÀI LIỆU TRUYỀN THÔNG DÙNG TRONG CAN THIỆP CỘNG ĐỒNG n Lu ậ án Y tế ng cộ ng đồ 179 n Lu ậ án Y tế ng cộ ng đồ 180 n Lu ậ án Y tế ng cộ ng đồ 181 n Lu ậ án Y tế ng cộ ng đồ 182 n Lu ậ án Y tế ng cộ ng đồ 183 Lu ận án Y tế cộ ng đồ ng 184 Phụ lục Biểu đồ Grantt hoạt đông can thiệp truyền thông giáo dục sức khoẻ hàng năm