Nghiên cứu phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có một số đặc tính dùng để định hướng ứng dụng sản xuất sản phẩm probiotic

LỜI CẢM ƠN Trên thực tế khơng có thành công mà không gắn liền với hỗ trợ, giúp đỡ dù hay nhiều, dù trực tiếp hay gián tiếp ngƣời khác Trong suốt thời gian từ bắt đầu học tập trƣờng đến nay, em nhận đƣợc nhiều quan tâm, giúp đỡ q Thầy Cơ, gia đình bạn bè Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi đến Cơ Bộ mơn Vi sinh - Hóa sinh thuộc Viện Công nghệ Sinh học - Trƣờng Đại học Lâm Nghiệp với tri thức tâm huyết để truyền đạt vốn kiến thức quý báu cho chúng em suốt thời gian học tập Trƣờng Và đặc biệt em xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Nhƣ Ngọc nhiệt tình hƣớng dẫn em hồn thành tốt báo cáo khóa luận tốt nghiệp Nếu khơng có lời hƣớng dẫn, dạy bảo Thầy Cơ em nghĩ báo cáo khóa luận tốt nghiệp em khó hồn thiện đƣợc Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn thầy cô Bƣớc đầu vào thực tế em hạn chế nhiều bỡ ngỡ, trình độ lý luận nhƣ kinh nghiệm thực tiễn cịn hạn chế Do vậy, khơng tránh khỏi thiếu sót, em mong nhận đƣợc ý kiến đóng góp q báu q Thầy Cơ để kiến thức em lĩnh vực đƣợc hoàn thiện hơn, giúp em học hỏi thêm đƣợc nhiều kinh nghiệm làm hành trang tốt cho công việc sau Em xin chân thành cảm ơn! Hà nội, ngày tháng năm 2018 Sinh viên thực Nguyễn Thị Lý MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1.1 Vi khuẩn Lactic (LAB) 1.1.1 Khái quát nhóm vi khuẩn sinh Lactic 1.1.2 Phân loại vi khuẩn lactic 1.1.3 Các yếu tố ảnh hƣởng đến sinh trƣởng vi khuẩn lactic 1.1.4 Ứng dụng vi khuẩn lactic 1.2 Probiotic 10 1.2.1 Khái niệm Probiotic 10 1.2.2 Vai trò Probiotic 11 Chƣơng 2: MỤC TIÊU – NÔI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 16 2.2 Nội dung nghiên cứu 16 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 16 2.3.1 Nguyên liệu 16 2.3.2 Hóa chất Thiết bị 16 2.3.3 Các phƣơng pháp nghiên cứu 18 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 3.1 Kết phân lập khiết giống 25 3.2 Kết khả sinh axit lactic 27 3.3 Kết đặc điểm sinh hoá chủng đƣợc chọn lọc 28 3.4 Kết kiểm tra khả chịu nhiệt 30 3.5 Kết kiểm tra khả chịu pH thấp 31 3.6 Kết khả sinh chất kháng khuẩn 32 3.7 Kết thử hoạt tính enzyme ngoại bào .36 3.8 Kết thử hoạt tính kháng kháng sinh 38 Chƣơng 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 4.1 Kết luận .41 4.2 Kiến nghị .41 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT LAB (Lactic Acid Bacteria) Vi khuẩn lactic MRS de Man, Rogosa, Sharp BC (Bacterial Cellulose) Cellulose vi khuẩn kDa kiloDalton sp (species) Lồi GRAS Generally Recognized As Safe (Đƣợc cơng nhận chung an toàn) aa Acid amino VSV Vi sinh vật VK Vi khuẩn NCCLS National Committee for Clinical Laboratory Standards LB Lysogeny Broth (môi trƣờng để nuôi cấy vi khuẩn) WHO World Health Organization (Tổ chức Y tế giới) Food and Agriculture Organization of the FAO United Nations (Tổ chức Lƣơng thực Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Danh sách máy móc thiết bị sử dụng 18 Bảng 3.1: Kết phân lập vi khuẩn LAB .26 Bảng 3.2: Kết khả sinh axit chủng vi khuẩn 27 Bảng 3.3: Kết thử nghiệm phản ứng Calatase nhuộm Gram 29 Bảng 3.4: Kết mật độ vi khuẩn cfu /ml với ảnh hƣởng nhiệt dộ 31 Bảng 3.5: Kết mật độ vi khuẩn cfu/ml với ảnh hƣởng pH .32 Bảng 3.6: Kết thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn chủng vi khuẩn 33 Bảng 3.7: Hoạt tính enzyme ngoại bào .36 Bảng 3.8: Hoạt tính kháng kháng sinh Tetracylin 38 Bảng 3.9: Hoạt tính kháng kháng sinh Streptomycin 39 Bảng 3.10: Hoạt tính kháng kháng sinh Gentamycin 39 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Một số hình ảnh vi khuẩn lactic [1] Hình 3.1 Hình ảnh khuẩn lạc vi khuẩn phân lập từ thực phẩm lên men 27 Hình 3.2 Ống nghiệm bảo quản giống vi khuẩn .28 Hình 3.3 Khả ức chế vi khuẩn Ecoli gây bệnh dịch chất kháng khuẩn thô các chủng vi khuẩn đƣợc tuyển chọn 33 Hình 3.4 Khả ức chế vi khuẩn Samonella gây bệnh dịch chất kháng khuẩn thô các chủng vi khuẩn đƣợc tuyển chọn 33 Hình 3.5 Khả ức chế vi khuẩn Shigella gây bệnh dịch chất kháng khuẩn thô các chủng vi khuẩn đƣợc tuyển chọn 34 Hình 3.6 Khả ức chế vi khuẩn H12 dịch chất kháng khuẩn thô các chủng vi khuẩn đƣợc tuyển chọn 34 Hình 3.7 Khả ức chế vi khuẩn BA dịch chất kháng khuẩn thô các chủng vi khuẩn đƣợc tuyển chọn 34 Hình 3.8 Khả ức chế vi khuẩn NT1 dịch chất kháng khuẩn thô các chủng vi khuẩn đƣợc tuyển chọn 35 Hình 3.9 Hoạt tính phân giải Tinh bột chủng vi khuẩn 37 đƣợc tuyển chọn 37 Hình 3.10 Hoạt tính phân giải Cellulose chủng vi khuẩn đƣợc tuyển chọn .37 Hình 3.11 Hoạt tính phân giải Protease chủng vi khuẩn đƣợc tuyển chọn .37 Hình 3.12 Hoạt tính kháng kháng sinh nồng độ 10mg/l chủng vi khuẩn tuyển chọn 39 Hình 3.13 Hoạt tính kháng kháng sinh nồng độ 50mg/l chủng vi khuẩn tuyển chọn 40 ĐẶT VẤN ĐỀ Từ thời cổ đại ngƣời biết sử dụng Vi sinh vật (VSV) để chế biến bảo quản thực phẩm, nhƣng ý tƣởng tạo sản phẩm VSV sống hữu ích để bổ sung vào thức ăn nƣớc uống nhằm cải thiện sức khoẻ nâng cao suất vật nuôi đƣợc quan tâm nhiều vài thập kỷ trở lại Khi chƣa tìm thuốc kháng sinh, ngƣời biết tiêu thụ thực phẩm chứa vi sinh vật sống có lợi nhƣ sản phẩm lên men có nguồn gốc từ sữa Theo Ayurveda, ngành y học lâu đời khoảng 2500 năm trƣớc công nguyên, tiêu thụ sữa chua (1 sản phẩm sữa lên men) đƣợc ủng hộ để trì sức khỏe tốt (Chopra v Doiphode, 2002) Các vi khuẩn có lợi ruột tạo ảnh hƣởng tốt cho thể cách ngăn cản khối ung thƣ, làm bất hoạt virus, tạo cc enzyme kháng thể tự nhiên, làm giảm cholesterol Bên cạnh chúng ức chế tăng trƣởng vi khuẩn có hại qua việc tiết môi trƣờng acid hữu cơ, chất kháng khuẩn, đặc biệt tạo thành chất kháng khuẩn Trong vi khuẩn có hại lại tạo sản phẩm có hại cho vật chủ nhƣ độc tố chất gây ung thƣ Khi vi khuẩn có hại chiếm ƣu thế, cạnh tranh chất dinh dƣỡng với tế bào vật chủ đồng thời nồng độ chất có hại tăng lên Các chất đơi khơng tác động mà tích lũy thể vật chủ theo thời gian, chúng đƣợc xem nhƣ yếu tố gây lo hại, ung thƣ, xơ vữa động mạch, giảm khả miễn dịch Năm 1974, Paker đƣa khái niệm probiotic để VSV chất làm cân hệ VSV đƣờng ruột ngƣời vật ni, kể từ có nhiều phát vai trò, tác dụng VSV sống nhƣ: tăng cƣờng sức khoẻ hệ tiêu hố thơng qua cải thiện cân hệ vi sinh vật ruột (Fuller, 1989), tăng đáp ứng miễn dịch, phịng chống ung thƣ đƣờng tiêu hố (FAO/WHO, 2001), giảm colesterol máu (Pereira Gibson, 2002) Các (VSV) probiotic thiết phải VSV sống hữu ích, chúng vi khuẩn (VK) (thƣờng VK khuẩn lactic, số chủng Bacillus) nấm men Đề tài: “Nghiên cứu phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có số đặc tính dùng để sản xuất sản phẩm probiotic” đƣợc tiến hành nhằm phân lập, đánh giá, tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có đặc tính probiotic phục vụ cho việc sản xuất sản phẩm Probiotic Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1.1 Vi khuẩn Lactic (LAB) 1.1.1 Khái quát nhóm vi khuẩn sinh Lactic Vi khuẩn lactic (LAB) đƣợc định nghĩa nhóm vi khuẩn Gram (+), gồm trực khuẩn cầu khuẩn không sinh bào tử, khơng ƣa khí (nonaerobic) nhƣng chịu oxy (aerotolerant), sinh acid lactic sản phẩm lên men carbohydrat LAB gồm nhiều chi, tiêu biểu chi Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus Streptococcus [3,14] Các LAB khơng di động, catalase âm tính, tỉ lệ GC thấp dƣới 50% LAB ƣa ấm chịu nhiệt, nhiệt độ sinh trƣởng tối ƣu tùy loài, dao động từ 28 đến 45oC LAB có nhu cầu dinh dƣỡng phức tạp, lên men cần vitamin, acid amin peptid ngắn Nguồn carbohydrat glucose, fructose, lactose, maltose, sucrose; số chủng vi khuẩn sử dụng tinh bột nhƣ Lactobacillus amylophilus L amylovorus [15] LAB phân bố rộng rãi nhiều hệ sinh thái, thƣờng đƣợc tìm thấy số loại thực phẩm (các sản phẩm từ sữa, thịt rau lên men, bột nhào chua…), thực vật, đƣờng tiêu hóa, hơ hấp sinh dục ngƣời động vật [2,3] LAB có lịch sử ứng dụng lâu đời thực phẩm lên men tác động có lợi mặt dinh dƣỡng, cảm quan tuổi thọ sản phẩm, với sản phẩm dễ hỏng nhƣ sữa, thịt, cá, số loại rau Trong y dƣợc, nhiều loài LAB đƣợc sử dụng làm probiotic để cải thiện nâng cao sức khỏe với nhiều tác dụng trị liệu đáng ý nhƣ ngăn ngừa nhiễm khuẩn đƣờng ruột, điều trị tiêu chảy, tăng cƣờng đáp ứng miễn dịch, giảm cholesterol máu, giảm nguy mắc ung thƣ [15] LAB sinh nhiều loại chất có tác dụng kháng khuẩn: acid lactic, acid acetic, ethanol, acid béo, H2O2, diacetyl… đặc biệt chất kháng khuẩn Mặc dù chất kháng khuẩn đƣợc tìm thấy nhiều loại vi khuẩn khác, chất kháng khuẩn sinh LAB thu hút đƣợc ý đặc biệt nhà khoa học tính an tồn tác dụng ức chế nhiều vi khuẩn gây bệnh nguy hiểm nhƣ Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes… Trong số khoảng 200 chất kháng khuẩn đƣợc mô tả nay, chất kháng khuẩn từ LAB chiếm tới 90% [16] Một số vi khuẩn thƣờng dùng thực phẩm, số giống vi khuẩn lactic nịng cốt liên quan đến q trình lên men thực phẩm nhƣ: Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus Streptococcus [3] 1.1.2 Phân loại vi khuẩn lactic 1.1.2.1 Phân loại vi khuẩn lactic theo Orla-Jensen Orla-Jensen phân loại vi khuẩn lactic dựa vào đặc điểm hình thái học (cầu khuẩn trực khuẩn), kiểu lên men, khả phát triển nhiệt độ khác nhau, mức độ sử dụng đƣờng Một số giống vi khuẩn lactic nòng cốt liên quan đến trình lên men thực phẩm nhƣ Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus Streptococcus [2,3] Hình 1.1 Một số hình ảnh vi khuẩn lactic [1] Streptococcus Nhóm vi khuẩn có dạng hình cầu hình trứng, kết đơi hay dạng chuỗi, lên men đồng hình Hiện có 50 lồi Streptococus đƣợc nhận biết, vi khuẩn phân bố chủ yếu xoang miệng đƣờng hô hấp Một số Streptococcus nhƣ Sp Mutans tác nhân gây bệnh sâu viêm màng tim [4]