nghiên cứu sản xuất protein có hoạt tính sinh học dùng trong nông nghiệp bằng kỹ thuật di truyền trên tế bào cây thông (larich desidue) và bèo tấm (lemna sp wolffia sp)

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN VIỆN DI TRUYỀN NÔNG NGHIỆP BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHỊ ĐỊNH THƯ NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT PROTEIN CĨ HOẠT TÍNH SINH HỌC DÙNG TRONG NÔNG NGHIỆP BẰNG KỸ THUẬT DI TRUYỀN TRÊN TẾ BÀO CÂY THÔNG (Larich desidue) VÀ BÈO TẤM (Lemna sp wolffia sp) Chủ nhiệm đề tài: LÊ HUY HÀM 7379 26/5/2009 HÀ NỘI – 2008 MỤC LỤC DANH SÁCH NHỮNG NGƯỜI THAM GIA ĐỀ TÀI BÀI TÓM TẮT .2 NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT .4 LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGỒI NƯỚC 1.1 Tổng quan bèo .7 1.1.1 Cây phân loại bèo 1.1.2 Phân bố bèo 1.1.3 Thành phần dinh dưỡng bèo 1.1.4 Đặc điểm sinh học 1.2 Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh bèo 12 1.3 Nghiên cứu chuyển gen vào bèo Woffia sp, Lemna sp 13 1.3.1 Thiết kế vector biểu thực vật .13 1.3.2 Các phương pháp chuyển gen thực vật .15 1.3.3 Chuyển gen thông qua Agrobacterium tumefaciens 19 1.3.4 Hệ thống chuyển gen bèo 23 1.4 Chuyển gen vỏ virus gumboro vào Wolffia / Lemna 25 1.4.1 Bệnh Gumboro gia cầm 25 1.4.2 Chiến lược nghiên cứu thử nghiệm ứng dụng vaccine hệ 26 1.4.3 Gen kháng nguyên VP2 chiến lược phát triển vaccine hệ .27 1.5 Nghiên cứu sản xuất vaccin qua đường miệng 29 1.6 Tình hình nghiên cứu nước 30 CHƯƠNG NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.1 Mục tiêu đề tài 32 2.2 Nội dung nghiên cứu cần thực 32 2.3 Vật liệu 33 2.3.1 Vật liệu thực vật 33 2.3.2 Vật liệu vi khuẩn 33 2.3.3 Hoá chất .35 Phương pháp 35 2.4.1 Phương pháp thiết kế vector biểu thực vật .35 2.4.2 Phương pháp nuôi cấy mô tế bào 44 2.4.3 Phương pháp biến nạp gen .45 2.4.4 Phương pháp đánh giá chuyển gen 49 2.4.5 Thử nghiệm khả gây đáp ứng miễn dịch gà 57 CHƯƠNG3:NHỮNG NỘI DUNG VÀ KẾT QUẢ ĐÃ THỰC HIỆN 58 THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN Ở THỰC VẬT 58 1.1 Kết khuyếch đại gen mã hoá protein virus VP2 phương pháp PCR .58 1.2 Kết tạo dịng gen mã hố protein VP2 virus Gumboro .58 1.2.1 Phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vectơ pCRđ 2.1 .58 1.2.2 Biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào khả biến E coli chủng InVαF’ 59 1.2.3 Kết tách chiết ADN plasmid 60 1.2.4 Kiểm tra vectơ tái tổ hợp cách cắt với enzyme giới hạn EcoRI .60 1.3 Kết giải trình tự gen mã hoá protein VP2 virus Gumboro 61 1.4 Thiết kế vectơ biểu VP2 63 XÂY DỰNG HỆ THỐNG TÁI SINH VÀ NHÂN SINH KHỐI Ở 66 BÈO TẤM WOLFFIA, LEMMA 66 2.1 Xây dựng hệ thống tái sinh nhân sinh khối bèo Wolffia australiana 66 2.1.1 Nghiên cứu khả sinh trưởng phát triển W australiana điều kiện nuôi khác 67 2.1.2 Nghiên cứu ảnh hưởng pH đến sinh trưởng W australiana 68 2.1.3 Tạo nguồn vật liệu khởi đầu ống nghiệm W australiana điều kiện nuôi tủ ổn nhiệt 69 2.2 Xây dựng hệ thống tái sinh bèo Lemna .70 2.2.1 Tạo vật liệu vô trùng 70 2.2.2 Nghiên cứu xác định môi trường nhân bèo phù hợp 70 2.2.3 Tạo nhân callus .75 2.2.4 Nhân sinh khối callus dạng I 81 2.2.5 Tái sinh từ callus 82 XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHUYỂN GEN ĐẠT HIỆU QUẢ CAO VÀO BÈO TẤM WOFFIA SP, LEMMA SP 86 3.1 Xây dựng quy trình chuyển gen đạt hiệu cao vào bèo Woffia sp 86 3.1.1 Xác định chủng vi khuẩn thích hợp cho chuyển gen vào W australiana 86 3.1.2 Kết thí nghiệm khảo sát thời gian ly tâm hút chân không 87 3.1.3 Ảnh hưởng mật độ vi khuẩn thời gian đồng nuôi cấy 88 3.1.4 Ảnh hưởng môi trường đồng nuôi cấy 89 3.1.5 Đánh giá mức độ ảnh hưởng kháng sinh Geneticin Paromycine đến khả gây chết bèo Woffia australiana .90 3.2 Xây dựng qui trình chuyển gen đạt hiệu cao vào bèo Lemna 92 3.2.1 Xây dựng quy trình chuyển gen nguyên callus sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens 92 3.2.2 Xây dựng quy trình chuyển gen nguyên callus sử dụng súng bắn gen 99 CHUYỂN GEN VỎ VIRUS GUMBORO VÀO WOLFFIA/LEMNA 104 4.1 Chuyển gen vỏ virus Gumboro vào Wolffia australiana .104 4.2 Chuyển gen vỏ virus Gumboro vào Lemna 106 4.2.1 Chuyển gen nguyên bèo LA 106 4.2.2 Tạo callus vật liệu chuyển gen 107 4.2.3 Chuyển gen VP2 vào callus dạng I dạng II 108 PHÂN TÍCH ĐÁNH GIÁ CÂY CHUYỂN GEN .109 THỬ NGHIỆM SẢN PHẨM CHUYỂN GEN TRÊN GIA CẦM 109 5.1 Phân tích đánh giá chuyển gen 109 5.1.1 Đánh giá biểu gen gus dòng bèo chuyển gen 110 5.1.2 Tách chiết kiểm tra ADN tổng số bèo 111 5.1.3 Phân tích PCR dịng bèo chuyển gen VP2 111 5.1.4 Phân tích lai Southern .113 5.1.5 Xác định protein bèo chuyển gen .113 5.2 Thử nghiệm sản phẩm chuyển gen gia cầm 116 5.2.1 Thu mẫu huyết gà 116 5.2.2 Phát kháng thể kháng protein VP2 ELISA .117 CHƯƠNG 4: TỔNG QUÁT HÓA VÀ ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ THU ĐƯỢC 121 4.1 Dạng sản phẩm kết tạo 121 4.2 Kết khoa học 121 4.3 Kết bật khả áp dụng 122 4.4 Trình độ cơng nghệ 122 4.5 Khả áp dụng .123 4.6 Nhu cầu kinh tế, xã hội địa áp dụng 123 4.7 Đào tạo .123 4.8 Sản phẩm khoa học đề tài 124 4.9 Hợp tác quốc tế 124 4.10 Tình hình sử dụng kinh phí 124 4.11 Danh sách cơng trình công bố .125 4.12 Hạn chế đề tài 125 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 126 5.1 Kết luận .126 5.2 Đề nghị 126 TÀI LIỆU THAM KHẢO 128 B¸o c¸o Tỉng kÕt Khoa học & Kỹ thuật Đề tài DANH MC HèNH Hỡnh 1.1 Vịng sinh sản vơ tính L aequinoctialis (Landolt, 1986) Trang Hình 1.2 Hoa L.A 10 Hình 1.3 Bèo W australiana nuôi đĩa thạch 12 Hình 1.4 Cấu trúc pPAMksGFP Hình 1.5 Cấu trúc Ti plasmid dạng octopine Hình 1.6 Cơ chế lây nhiễm A tumefaciens vào tế bào thực vật Hình 1.7 Sơ đồ cấu trúc hệ vector nhị thể Hình 1.8 Sơ đồ cấu trúc vector liên hợp Hình 2.1 Bèo W australiana No 7540 Hình 2.2 Bèo Lemna aequinoctialis Hình 2.3: Cấu trúc vector nhị phân pBIN GUS-int Hình 2.4: Vector nhị phân pCAMBIA1301 Hình 2.5: Cấu trúc Vector pPAM-VP2 Hình 3.1 Kết sản phẩm PCR Hình 3.2 Kết biến nạp gen mã hoá protein VP2 vào InVα F’ Hình 3.3 Kết tách chiết ADN plasmid Hình 3.4 Kết kiểm tra dịng ADN plasmid sau xử lí EcoRI Hình Trình tự nucleotit đoạn ADN tách dịng mang gen VP2 Hình 3.6 Phân cắt gen VP2 vectơ pPAMksGFP với enzym cắt giới hạn Hình 3.7 Thiết kế plasmid pPAM- VP2 Hình 3.8 Xác định có mặt gen VP2 chủng Agrocaterium GV3101pMp90 Hình 3.9 Một số hình ảnh bèo LA tái sinh sau khử trùng Hình 3.10 Bèo nhân mơi trường H/5 + 1,5% sucrose, pH=6,0 Hình 3.11 Callus tạo N6/2 với kết hợp 2,4D +BAP Hình 3.12 Mơ callus dạng II Hình 3.13 Tạo callus dạng I từ callus dạng II Hình 3.14 Nhân callus dạng I mơi trường có 2,0 mg/l 2,4D + 6,0 mg/l BAP Hình 3.15 Tái sinh từ callus dạng II Hình 3.16 Bèo tái sinh từ callus dạng I môi trường chất ĐHST Hình 3.17 Tái sinh bèo từ callus dạng I Hình 3.18 Kết thí nghiệm thử chủng VK W australiana Hình 3.19 Xác định thời gian ly tâm chân khơng thích hợp Hình 3.20: Ảnh hưởng mật độ VK thời gian đồng nuôi cấy Hình 3.21: Kết thi nghiệm thời gian đồng ni cấy mật độ VK lần Hình 3.22: Đánh giá ảnh hưởng mơi trường đồng ni cấy Hình 3.23: Ảnh hưởng geneticin đến khả sống W australiana Hình 3.24: Ảnh hưởng Paramomycin đến khả sống W australiana Hình 3.25 Biểu tạm tới gen GUS bèo với chủng khác Hình 3.26 Ảnh hưởng kanamycin tới bèo LA Hình 3.27 ảnh hưởng hygromycin tới bèo LA Hình 3.28 ảnh hưởng hygromycin tới bèo LA Hình 3.29 Sàng lọc bèo chuyển gen môi trường chọn lọc Hình 3.30: Cánh bèo mơi trường diệt khuẩn Hình 3.31: Kết chọn lọc nguyên cánh LA mơi trường bổ sung hygromycin, geneticin Hình 3.32 Callus dạng I (A); callus dạng II (B) Hình 3.33: Mẫu callus dạng I LA môi trường diệt khuẩn Hình 3.34 : Callus dạng II tái sinh Hình 3.35: Cánh bèo chuyển gen callus dạng II loạt thí nghiệm số 12 Hình 3.36: Cánh bèo chuyển gen callus dạng II loạt thí nghiệm số 25 Hình 3.37: Biểu gen gus cánh bèo W australiana (1); W globosa (2) bèo LA (3) chuyển gen sau chọn lọc Hinh 3.38 Kết phân tích PCR gen gus dịng bèo chuyển gen Hình 3.39 Kết phân tích PCR dịng Lemna aequinoctialis chuyển gen Hình 3.40 Kết phân tích PCR dịng Wolffia australiana chuyển gen Hình 3.41 Kết lai DNA dịng bèo chuyển gen VP2 Hình 3.42 Kết phân tích ELISA dịng bèo chuyển gen VP2 Hình 3.43: Mơ tả thí nghiệm thử khả gây đáp ứng miễn dịch bèo chuyển gen gà 15 19 21 22 22 33 33 34 34 34 58 59 60 61 63 64 65 65 70 74 75 76 81 82 82 83 85 87 87 88 89 90 91 92 93 97 98 99 106 107 107 108 108 109 109 109 110 111 112 112 113 116 120 B¸o c¸o Tỉng kết Khoa học & Kỹ thuật Đề tài DANH MC BẢNG Bảng 1.1.Thành phần hàm lượng hợp chất hữu có cánh bèo Bảng 2.1 Trình tự đoạn mồi sử dụng nghiên cứu Bảng 3.1: Ảnh hưởng hàm lượng khoáng khác đến khả sinh trưởng W australiana Bảng 3.2: Nghiên cứu khả sinh trưởng phát triển W australiana điều kiện nuôi khác Bảng 3.3: Ảnh hưởng pH đến sinh trưởng W australiana Bảng 3.4: Tạo nguồn vật liệu khởi đầu in vitro Bảng 3.5 Hiệu khử trùng loại hoá chất khác Bảng 3.6 Ảnh hưởng hàm lượng khoáng Hutner tới số cánh bèo nhân sau ngày nuôi cấy Bảng 3.7 Ảnh hưởng pH môi trường nuôi tới số cánh bèo nhân sau ngày nuôi cấy Bảng 3.8 Ảnh hưởng sucrose tới số cánh bèo nhân sau ngày nuôi cấy Bảng 3.9 Ảnh hưởng khống chất điều hồ sinh trưởng khác đến tạo callus Bảng 3.10 Ảnh hưởng hàm lượng khống mơi trường N6 đến hiệu tạo callus Bảng 3.11 Ảnh hưởng 2,4D BAP đến hiệu tạo callus (%) Bảng 3.12 Ảnh hưởng hàm lượng đường (g/l) đến tỷ lệ tạo callus Bảng 3.13 ảnh hưởng hàm lượng CH đến hình thành callus Bảng 3.14 Kết tạo callus mơi trường có pH khác Bảng 3.15 Kết tạo callus dạng I từ dạng II Bảng 3.16 Ảnh hưởng chất điều hoà sinh trưởng đến chất lượng callus Bảng 3.17 Kết tái sinh callus dạng II Bảng 3.18 Hiệu tái sinh cơng thức có hàm lượng BAP khác Bảng 3.19 Ảnh hưởng IAA kinetin tới khả tái sinh cánh bèo Bảng 3.20 Ảnh hưởng CH tới khả tái sinh bèo từ callus Bảng 3.21: Kết khảo sát chủng vi khuẩn thích hợp cho chuyển gen vào W australiana Bảng 3.22: Kết thí nghiệm khảo sát thời gian ly tâm hút chân không Bảng 3.23 Ảnh hưởng mật độ vi khuẩn thời gian đồng nuôi cấy Bảng 3.24 Ảnh hưởng mật độ vi khuẩn thời gian đồng nuôi cấy Bảng 3.25 Ảnh hưởng môi trường đồng nuôi cấy Bảng 3.26: Kết thí nghiệm với geneticin Bảng 3.27: Kết thí nghiệm với paromomycin Bảng 3.28 Biểu tạm thời gen GUS mẫu bèo với chủng vi khuẩn khác Bảng 3.29 Tỷ lệ biểu tạm thời biện pháp tăng cường tiếp xúc (%) Bảng 3.30 Ảnh hưởng thời gian hút chân không tới biểu tạm thời Bảng 3.31 Ảnh hưởng mật độ vi khuẩn tới biểu tạm thời Bảng 3.32 Ảnh hưởng AS tới tỷ lệ biểu tạm thời gen GUS mẫu bèo Bảng 3.33 Ảnh hưởng kanamycin tới hệ số nhân sức sống bèo LA Bảng 3.34 Ảnh hưởng hygromycin tới hệ số nhân sức sống bèo LA Bảng 3.35 Ảnh hưởng geneticin tới hệ số nhân sức sống bèo LA Bảng 3.36 Ảnh hưởng tuổi mẫu đến biểu tạm thời gen gus bèo nguyên Bảng 3.37 Ảnh hưởng tuổi mẫu đến biểu tạm thời gen gus callus bèo Bảng 3.38 Ảnh hưởng khoảng cách bắn áp lực khí đến biểu gen tạm thời gen gus bèo nguyên Bảng 3.39 Ảnh hưởng khoảng cách bắn áp lực khí đến biểu gen tạm thời gen gus callus Bảng 3.40 Ảnh hưởng xử lý áp suất thẩm thấu đến biểu gen gus tạm thời bèo nguyên Bảng 3.41 Ảnh hưởng xử lý áp suất thẩm thấu đến biểu gen gus tạm thời callus Bảng 3.42 Ảnh hưởng hàm lượng hạt vàng đến biểu tạm thời gen gus bèo nguyên Bảng 3.43 Ảnh hưởng hàm lượng hạt vàng đến biểu tạm thời gen gus callus Bảng 3.44 Tổng hợp thí nghiệm chuyển gen VP2 vào bèo Wolffia australiana Bảng 3.45 Tổng hợp thí nghiệm chuyển gen VP2 vào bèo L.aequinoctialis Bảng 3.46: Tổng hợp thí nghiệm chuyển gen thị vào bèo LA W australiana Bảng 3.47 Xác định protein tổng số dịch chiết bèo chuyển gen Bảng 3.48 Kết phân tích ELISA dịng bèo chuyển gen VP2 Bảng 3.49 Danh sách mẫu huyết gà thu Bảng 3.50: Kết xét nghiệm ELISA mẫu huyết gà gây đáp ứng miễn dịch Bảng 3.51: Kết xét nghiệm ELISA dương tính mẫu huyết gà gây đáp ứng miễn dịch Bảng 3.52: Đánh giá mức độ tạo kháng thể kháng protein VP2 mẫu huyết gà ăn bèo chuyển gen Trang 51 66 67 68 69 70 71 72 73 75 76 77 78 79 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 89 91 91 93 94 94 95 96 96 97 99 100 100 101 101 102 102 103 103 105 106 110 114 115 116 117 118 119 DANH SÁCH NHỮNG NGƯỜI THAM GIA ĐỀ TÀI TT Họ tên Cơ quan công tác A Chủ nhiệm đề tài Phịng thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ PGS.TS Lê Huy Hàm tế bào thực vật, Viện Di truyền Nông nghiệp B Cán tham gia nghiên cứu Phịng thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ ThS Trần Duy Dương tế bào thực vật, Viện Di truyền nông nghiệp Th.S Vũ Văn Tiến nt TS Phạm Thị Lý Thu nt TS Nguyễn Thị Khánh Vân nt PGS TS Lê Thanh Hoà PGS TS Đinh Duy Kháng Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam Phịng thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ PGS TS Đỗ Năng Vịnh tế bào thực vật, Viện Di truyền nơng nghiệp Phịng thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ CN Trịnh Thị Minh Thuỳ tế bào thực vật, Viện Di truyền nơng nghiệp BÀI TĨM TẮT Hiện số lượng tác nhân gây bệnh cho người gia súc gia cầm ngày tăng, tượng nhờn thuốc tác nhân gây bệnh cũ bắt buộc người phải ưu tiên quan tâm trước hết đến phương pháp phòng bệnh Việc phòng bệnh vaccine trở thành hoạt động quan trọng mục tiêu hàng đầu ngành y tế thú y nước Đối với lĩnh vực chăn nuôi gia súc, gia cầm, giá thành vaccine cao, ngành chăn nuôi nước phát triển gặp nhiều rủi ro nhiều so với nước phát triển Vì vậy, việc tìm phương pháp sản xuất vaccine mới, với giá thành hạ tìm kiếm sôi động giới năm gần Các nghiên cứu thập niên vừa qua cho thấy tiềm ứng dụng vaccine uống sản xuất thông qua hệ thống thực vật chuyển gen lớn, khơng góp phần giảm giá thành vaccine mà mở triển vọng việc ứng dụng CNSH thực vật nông nghiệp y học Trong loài thực vật nghiên cứu để sử dụng làm hệ thống sản xuất vaccine, loài họ bèo (Lemnaceae) đặc biệt ý đặc tính sau: có tốc độ nhân vơ tính nhanh, có hàm lượng chất dinh dưỡng cao, dễ nuôi trồng, không cần điều kiện đặc biệt như: bảo quản lạnh, chế độ vô trùng Do đặc điểm trên, việc nghiên cứu sản xuất vaccine đối tượng hấp dẫn hứa hẹn nhiều triển vọng Đề tài: “Nghiên cứu sản xuất protein có hoạt tính sinh học dùng nông nghiệp kỹ thuật di truyền tế bào thông (Larich desidue) bèo (Lemna sp/ Wolffia sp.)“, thực sở hợp tác khoa học với Viện Sinh lý phân tử Công nghệ sinh học, ĐHTH Bonn (CHLB Đức) cố gắng góp phần giải vấn đề để tiến tới ứng dụng thành công kỹ thuật di truyền vào việc sản xuất hợp chất có hoạt tính sinh học phục vụ chăn ni thú y bảo vệ sức khoẻ người Mục tiêu đề tài phía Việt Nam tập trung vào giải vấn đề sau: i) Chuyển thành công gen mã hoá virus gumboro VP2 vào bèo tấm; ii) Đánh giá khả tạo miễn dịch cho gia cầm ăn bèo có protein Đề tài thực đầy đủ nội dung nghiên cứu thu kết sau: • Thiết kế vector mang gen vỏ protein virus gumboro biểu thực vật Thu thập đánh giá nguồn gen protein vỏ virus gumboro Việt Nam Thiết kế vector pPAM-VP2 mang gen VP2 biểu thực vật • Xây dựng hệ thống tái sinh nhân sinh khối bèo (Lemna sp.; Wolffia sp.) Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào áp dụng để xây dựng hoàn thiện phương pháp tạo callus tái sinh loài bèo Wolffia sp Lemna sp Một số đặc điểm sinh học yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh trưởng, tạo callus tái sinh tối ưu • Xây dựng quy trình chuyển gen đạt hiệu cao vào bèo (Lemna/Wolffia) Quy trình chuyển gen vào callus nguyên Lemna sp Wolfia sp súng bắn gen thông qua Agrobacterium xây dựng cải thiện sở tối ưu hoá yếu tố ảnh hưởng đến q trình biến nạp: chủng vi khuẩn, nồng độ AS, thời gian đồng ni cấy • Chuyển gen vỏ virus gumboro vào Wolffia/ Lemna Các thí nghiệm chuyển gen VP2 thực loài bèo Wolffia australina Lemna aequinoctialis Các dòng bèo chuyển gen trì nhân sinh khối mơi trường có bổ sung tác nhân chọn lọc • Phân tích chuyển gen Thử nghiệm sản phẩm chuyển gen gia cầm Sự có mặt gen chuyển dịng bèo chuyển gen phân tích phương pháp sinh học phân tử (PCR, Southern) Đã nhận 06 dòng bèo Wolffia australiana chuyển gen VP2 Protein VP2 tách chiết từ dòng bèo chuyển gen Thử nghiệm bước đầu cho thấy 01 dòng bèo chuyển gen có khả gây đáp ứng miễn dịch gà Phía đối tác (CHLB Đức) Viện Sinh lý phân tử công nghệ sinh học thực vật (Đại học tổng hợp Bonn) thực nghiên cứu đối tượng thông (Larich desidue) thu kết sau: i) Đã nghiên cứu tạo huyền phù, xác định điều kiện tạo huyền phù nhân nhanh tế bào thông; ii) Tối ưu hố quy trình chuyển gen vào Larich desidue thơng qua Agrobacterium; iii) Chuyển gen kháng virus Gumboro VP2 vào mô sẹo đánh giá giá biểu protein VP2 dịng thơng chuyển gen Nói tóm lại, đề tài thực tốt nội dung nghiên cứu đặt thu kết khả quan Các kết nghiên cứu đạt mang tính khoa học thực tiễn cao Thành công đề tài tiền đề cho việc nghiên cứu tạo vaccine kháng Gumboro giá rẻ dùng chăn nuôi gia cầm xa sản xuất hoạt chất sinh học khác cho nông nghiệp y học kỹ thuật di truyền thực vật NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D: 2,4 Dichlorophenoxyacetic acid 2iP: 6-(ó,ó-Dimethylallylamino) Purin AS: acetosyringone BAP: 6-Benzyl Amino Purin bp: base pair CaMV35S- P: Cauliflower Mosaic Virus 35S promoter CH: Casein Hydrolysate cs: cộng CTAB: Cetyltrimeethylammonium bromide DNA: Deoxy ribo-Nucleic Acid ĐC: Đối chứng EC: Embryogenic Callus: mơ sẹo phơi hố EDTA: Ethylene Diamine Tetraacetace Acid Et-Br: Ethidium Bromide GMC: Cây trồng chuyển gen GMO: Sinh vật chuyển gen gus: β- glucuronidase gene = gen mã hoá β-glucuronidase IAA: Indol-3-Acetic Acid IBA: Indol -3-Butyric Acid Kbp: Kilobase Km: Kanamycine KTST: Kích thích sinh trưởng LA: Lemna aequinoctialis LB: Luria and Bertani MCS: Multi-Cloning Site MS: Môi trường nuôi cấy theo Murashige & Skoog (1962) NAA: ỏ-Naphthalenacetic Acid NOS: Nopaline Synthetase NOS-P: Nopaline Synthetase Promotor nptII: Neomycin phosphotransferase gene = gen mã hoá neomyciphosphotransferase OD600: Mật độ vi khuẩn đo bước sóng 600nm quang phổ kế DUR800 Spectrophotometer hãng Beckman Coulter PCR: Polymerase Chain Reaction T-DNA: transferred-DNA = DNA chuyển TDZ: Thidiazuron Ti- Plasmid: Tumor inducing plasmid= plasmid gây khối u thực vật X-Gluc: 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-glucuronic acid LỜI MỞ ĐẦU Thập niên cuối kỷ 20 đầu kỷ 21 chứng kiến thành tựu vượt bậc lĩnh vực công nghệ sinh học thực vật Một thành tựu tạo giống trồng chuyển gen có đặc tính hồn tồn khác biệt chống chịu sâu, bệnh, kháng thuốc diệt cỏ Đến cuối năm 2008 diện tích chuyển gen tồn cầu đạt 125 triệu Một loạt giống trồng với đặc tính hồn tồn như: chịu hạn, mặn, tăng cường khả hấp thụ nitơ, chịu úng, tăng cường sinh trưởng, tăng cường chất lượng dinh dưỡng, chất lượng chế biến, tăng cường hoạt chất sinh học nghiên cứu chuẩn bị đưa vào ứng dụng sản xuất (Jame, 2008) Sự phát triển hứa hẹn sáng sủa công nghệ sinh học thực vật sử dụng chuyển gen để sản xuất chất có hoạt tính sinh học như: vitamin, hợp chất chữa bệnh, hoá chất sử dụng công nghiệp, y tế như: kháng nguyên, kháng thể, interferon, vaccine (Mason et al, 1998) Có nhiều hệ thống sản xuất protein tái tổ hợp cần thiết cho mục đích khác người Đó hệ thống sử dụng tế bào động vật bậc cao, vi khuẩn, nấm men Gần tế bào côn trùng, thực vật biến đổi gen sử dụng để khắc phục nhược điểm hệ thống sản xuất protein sử dụng tế bào động vật bậc cao, vi khuẩn nấm men Do nhiệm vụ to lớn đặt cho nhà khoa học tìm kiếm hệ thống sản xuất protein tái tổ hợp khác, rẻ tiền, dễ sử dụng không mang nguy lây nhiễm bệnh có nguồn gốc virus Hệ thống thực vật So với hệ thống truyền thống, thực vật có nhiều lợi việc sản xuất protein tái tổ hợp Vaccine thực vật sản xuất thông qua kỹ thuật di truyền gọi "Vaccine sản xuất thực vật" (Rowlandson & Tackaberry, 2003) Vaccine sử dụng dạng tinh khiết hay dạng dịch chiết thực vật nguyên liệu thực vật Vaccine tái tổ hợp đưa vào thực vật ăn người động vật, tạo khả đưa vaccine vào qua đường miệng, gây miễn dịch cho hệ thống màng nhầy miễn dịch toàn thể (Hansson et al, 2000; Fishcher et al, 2003) Ý tưởng sử dụng thực vật làm hệ thống sản xuất vaccine uống (edible vaccine) lôi nhà khoa học nhiều nước tham gia vào nghiên cứu thập niên vừa qua thu nhiều kết khả quan (Rowlandson & Tackaberry, 2003) Bệnh Gumboro bệnh viêm túi bạch huyết nhiễm trùng (Infectiuous Bursal Disease -IBD) cấp tính virus gây gà, chủ yếu gà 2-6 tuần tuổi, với tỷ lệ chết khả lây lan cao gà Tỷ lệ chết cao hậu suy giảm miễn dịch virus gây liên - tạp nhiễm bệnh khác Cũng bị suy giảm miễn dịch, chương trình vaccine phịng chống số bệnh nguy hiểm khác gia cầm bị B¸o c¸o Tỉng kết Khoa học & Kỹ thuật Đề tài 30 0.082 0.042 0.21 49 0.118 0.078 0.39 31 0.1605 0.1205 0.6025 50 0.09 0.05 0.25 35 0.1185 0.0785 0.3925 51 0.104 0.064 0.32 40 0.0985 0.0585 0.2925 Tóm lại, sở phân tích mẫu huyết dương tính, chúng tơi thu kết sau: - Lô gà ăn bèo dòng WT5 hai lần: huyết 10 / 12 có kháng thể kháng protein VP2 - Lơ gà ăn bèo dịng WT39 hai lần: huyết / 12 có kháng thể kháng protein VP2 Giá trị S/P Mức độ tạo kháng thể kháng protein VP2 0,2